小鼠胚胎干细胞移植治疗骨质疏松症

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨质疏松症的药物治疗效果不佳，干细胞移植治疗成为热点。
目的：探讨胚胎干细胞移植治疗雌激素缺乏致骨质疏松症的疗效。
方法：雌性健康C57BL/6小鼠30只，随机分为假手术组、模型组、治疗组，每组10只。建立卵巢摘除术后骨质疏松症模型，治疗组造模后1 d通过小鼠尾静脉注射胚胎干细胞，其他两组不进行任何干预。治疗10 h采用流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡程度，治疗后3 d运用ELISA测定小鼠血清肿瘤坏死因子α水平，治疗1个月利用micro-CT扫描检测小鼠股骨骨小梁数量和骨密度。
结果与结论：模型组股骨骨小梁数量及骨密度较假手术组均有一定程度的降低，血清肿瘤坏死因子α水平较假手术组升高。通过尾静脉注射胚胎干细胞后，治疗组股骨骨小梁数量及骨体积分数有一定的提高，肿瘤坏死因子α表达水平降低，T淋巴细胞凋亡数量增多，与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。说明胚胎干细胞治疗骨质疏松症有一定的效果，可能是通过其免疫调控能力发挥作用的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 胚胎干细胞, 骨质疏松症, 免疫调控, T淋巴细胞, 肿瘤坏死因子α

Abstract:

BACKGROUND: Because of poor therapeutic effects of drug treatment, stem cell transplantation has become a hot spot in the treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic efficacy of embryonic stem cell transplantation in the treatment of estrogen deficiency-induced osteoporosis.
METHODS: Thirty female healthy C57BL/6 mice were randomly divided into model, sham-operated, and treatment groups, with 10 mice in each group. Ovariectomized models were established. In the treatment group, embryonic stem cells were injected by tail vein at 1 day after modeling, and there was no treatment in the other two groups. After 10 hours of treatment, flow cytometry was used to detect the apoptosis of T-lymphocytes; after 3 days of treatment, ELISA assay was used to detect the level of tumor necrosis factor-α in mouse serum; after
1 month of treatment, micro-CT was employed to determine the number of bone trabeculae and bone mineral density.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham-operated group, the number of bone trabeculae and bone mineral density were lower in the model group, while the serum level of tumor necrosis factor-α was higher in the model group. After embryonic stem cell transplantation via the tail vein, the number of bone trabeculae and the bone volume fraction were increased certainly, the serum level of umor necrosis factor-α was decreased, and the number of apoptotic T-lymphocytes was increased in the treatment group, which significantly differed from those in the model group (P < 0.05). These findings indicate that embryonic stem cell therapy has a certain effect on the treatment of osteoporosis, which may play a role through immune regulation.

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Key words: Embryonic Stem Cells, Osteoporosis, T-Lymphocytes, Tumor Necrosis Factor-alpha

中图分类号:

R394.2

樊志刚，王东. 小鼠胚胎干细胞移植治疗骨质疏松症[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 898-902.

Fan Zhi-gang, Wang Dong. Mouse embryonic stem cell transplantation for treatment of osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 898-902.

图/表（结果） 3

2.1 胚胎干细胞的体外培养在荧光倒置显微镜下可观

2.2 特异性标志免疫组化检测结果在荧光显微镜下观察胚胎干细胞，同一视野用激光共聚焦显微镜下观察胚胎干细胞免疫荧光染色结果，可见呈红色荧光的Oct-4、SSEA-1的表达，Oct-4表达在细胞核(图2A1)，SSEA-1表达在细胞膜(图2B1)，说明培养的细胞的确为胚胎干细胞(图2)。

2.3 实验动物数量分析参与实验的C57BL/6小鼠共30只，全部进入结果分析，实验中无死亡。

2.4 治疗前模型组和假手术组骨形态学比较 micro-CT扫描结果显示，模型组的骨小梁数量和骨密度均较假手术组低，且差异有显著性意义(P < 0.05)，说明摘除卵巢后雌激素缺乏所致骨质疏松症建模成功(图3)。

2.5 胚胎干细胞注射后骨质疏松症状的改善情况治疗1个月后取小鼠股骨，micro-CT机检测干骺端，结果显示，治疗组与模型组相比，骨小梁数量和骨密度均有一定程度提高(图4)，且差异有显著性意义(P < 0.05)，说明胚胎干细胞治疗骨质疏松症有一定的效果。

2.6 血清肿瘤坏死因子α水平比较 ELISA检测小鼠血清肿瘤坏死因子α水平，结果显示模型组与假手术组比较，肿瘤坏死因子α水平明显上升，提示肿瘤坏死因子α参与了骨质疏松症的形成。治疗组与模型组比较肿瘤坏死因子α水平明显降低，提示胚胎干细胞移植可能通过降低肿瘤坏死因子α水平达到治疗骨质疏松症的效果(图5)。

2.7 T淋巴细胞凋亡检测模型组与假手术组比较，因异常T淋巴细胞增多^[13]，故T淋巴细胞凋亡数量显著下降，提示骨质疏松症与T淋巴细胞凋亡相关。治疗组与模型组比较，T淋巴细胞凋亡数量明显升高，提示胚胎干细胞移植治疗骨质疏松症可能是通过加速T淋巴细胞凋亡实现的(图6)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年2至7月在郑州大学干细胞研究中心完成。

材料：

实验动物：雌性健康C57BL/6小鼠30只，体质量 18-22 g，购自河南省实验动物中心。实验过程中对动物的处理符合伦理学标准。

小鼠胚胎干细胞移植治疗骨质疏松症实验所用主要细胞、试剂和仪器：
细胞、试剂和仪器	来源
小鼠E14细胞	北京赛贝生物技术有限公司
高糖DMEM培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺	Hyclone公司
免疫组化用一抗Oct-4及SSEA-1抗体	美国Millipore公司
二抗包括山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗体	美国R&D公司
FITC标记CD3抗体	美国Biolegend公司
micro-CT	美国GE公司

实验方法：

E14细胞培养：参考相关文献[9-11]，首先将适量1 g/L明胶溶液加入到100 mm细胞培养皿中，轻轻振荡，使明胶溶液可以覆盖培养皿的细胞生长面，25 min后将明胶溶液吸出，干燥后使用。将E14细胞接种于该培养皿中，细胞培养液为含体积分数为20%胎牛血清，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，0.1 mmol/L非必需氨基酸，1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L谷氨酰胺，1 000 U/mL白血病抑制因子的高糖DMEM培养液，于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度条件下培养，原代培养至细胞达70%-80%汇合时，弃培养液，以无Ca²⁺、Mg²⁺ PBS洗1次，0.5 g/L胰酶、0.2 g/L EDTA于37℃下消化3-5 min，按1︰3比例常规传代。将处于对数生长期的第5代细胞用于后续实验。

免疫组化检测胚胎干细胞表面标志物：细胞用 0.01 mol/L PBS洗3次后，以45 g/L多聚甲醛固定15 min，0.01 mol/L PBS洗涤，视情况用0.01 mol/L PBS+体积分数为2% Triton X 100室温穿透细胞20 min，再以即用型二抗宿主血清封闭25 min。弃血清后，加入一抗抗体Oct-4 (1∶200稀释)和SSEA-1(1∶50稀释)，并于4 ℃孵育过夜。PBS洗涤，再以Cy3标记二抗室温孵育1.5 h后，重复PBS洗涤，以1 mg/L Hoechst33344染细胞核，激光共聚焦显微镜及荧光显微镜下观察拍照。

骨质疏松症模型建立：选取雌性健康C57BL/6小鼠30只，随机分为假手术组、模型组、治疗组，每组10只。按Liao等^[12]的方法构建骨质疏松症模型，给予10 g/L戊巴比妥钠麻醉后，模型组和治疗组于背部开口探寻双侧卵巢，结扎后切除，分别缝合肌肉层和皮肤层。假手术组探寻到双侧卵巢即分别缝合肌肉层和皮肤层。造模后1个月，micro-CT机检测小鼠股骨干骺端骨小梁数量下降，密度减低说明建模成功。治疗组造模后1 d尾静脉注射1×10⁶个第5代胚胎干细胞(于5 mL PBS中制备成细胞悬液)。假手术组和模型组不进行任何干预。

T淋巴细胞提取和凋亡检测：治疗后10 h，取各组小鼠(5只)脾脏分别碾碎后，过200目滤网孔。液体离心后加裂解液，再离心后加PBS制成单细胞悬液，加CD3抗体筛选T淋巴细胞，然后加入5 μL的凋亡试剂液中，4 ℃孵育20 min，流式细胞仪检测各组T淋巴细胞凋亡水平。

ELISA检测血清肿瘤坏死因子α水平：治疗后3 d，取各组小鼠5只，从尾静脉采血2.0 mL，常温放置30 min，离心后取血清按说明书中标准步骤进行操作。

骨形态学测量：1个月后取各组小鼠(3只)股骨，放入45 g/L多聚甲醛固定36 h，micro-CT机检测股骨干骺端骨小梁数量和骨密度。

主要观察指标：①micro-CT机检测各组股骨干骺端骨小梁数量和骨密度。②流式细胞仪检测各组T淋巴细胞凋亡水平。③ELISA检测各组动物血清肿瘤坏死因子α水平。

统计学分析：运用SPSS13.0软件分析，数据用均值±标准误表示，两组间差异用t 检验，多组间比较用单因素方差分析，α=0.05。

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讨论

骨质疏松是一种骨密度降低、骨脆性增加、骨板结构紊乱、易发骨折的全身代谢性疾病^[14]。绝经后骨质疏松主要是由于雌激素缺乏引起的高转换型骨量丢失，其重建受许多因素调控^[15]。雌激素缺乏使再建骨转换率增高，再建过程中的骨吸收大于骨形成，总体上使成骨作用减弱。体内雌激素水平下降，能够激活T淋巴细胞并释放多种细胞因子，如分泌肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、核因子κB受体活化因子配体等重要的促破骨细胞生长的炎症因子，导致骨密度降低^[16-18]。去势雌性小鼠的卵巢被切除后，骨松质骨量减少，骨密度下降，这种特性较好的模仿了正常人绝经后高转换型骨质疏松发生时的状态，是目前公认的研究骨质疏松症的最佳动物模型。

Kovacic等^[19]发现小鼠卵巢切除1个月后，小鼠骨量显著下降。本实验结果表明模型组骨密度和骨小梁数量与假手术组比较均有明显下降，更确定了绝经后雌激素缺乏导致了骨质疏松。但Benisch等^[20]的研究仅停留在骨量的改变上，未对如何治疗和改善提出建议。

现在对于骨质疏松症的治疗主要依靠药物(雌激素替代疗法)，但结果表明此方法存在较大的不良反应，患者经治疗后乳腺癌的患病率明显上升^[21]。因此寻求一种治疗效果可靠和安全的方法成为研究的热点。

本实验采用小鼠胚胎干细胞治疗骨质疏松症，探讨胚胎干细胞的疗效以及是否通过免疫调节发挥作用。胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团或桑葚胚，是一种具有自我更新特性及多向分化潜能的细胞^[22]，为治疗许多难治性疾病提供了细胞来源和研究工具。本研究发现，治疗组与模型组比较，骨密度和骨小梁数量都有一定的提高，且体内炎性因子肿瘤坏死因子α水平和T淋巴细胞凋亡数目也明显下降，提示小鼠胚胎干细胞不仅可以明显改善骨质疏松症的症状，且可能是通过其免疫调节功能，增加T淋巴细胞凋亡的方式进行的。

通过免疫调节的方式在全身其他组织疾病的治疗中也得到了部分证实，He等^[23]发现间充质干细胞是通过其免疫调控作用使得肠炎小鼠体内肿瘤坏死因子α，白细胞介素1β等促炎因子减低而达到治疗效果的。Maumus等^[24]研究显示，利用胚胎干细胞免疫调控可以减少TH1淋巴细胞和肿瘤坏死因子α，γ-干扰素的表达从而改善骨关节病的症状。这些结果都在一定层面上提示免疫调控作用在干细胞治疗中的作用，本实验也得出了相似结论。

实验通过静脉注射胚胎干细胞治疗骨质疏松症，发现可以增加T淋巴细胞凋亡，减低炎性因子肿瘤坏死因子α的产生，发挥一定的治疗效果。但研究还不够深入，如胚胎干细胞在治疗过程中免疫调节发挥的具体机制还知之甚少，需要进一步的实验观察。

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