组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (1): 91-95.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.016

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

李佳，安恒庆，王峰，王文光，帕洛克•迪力木拉提，王玉杰，木拉提•热夏提

新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-11-15 出版日期:2015-01-01 发布日期:2015-01-01
通讯作者: 木拉提?热夏提，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:李佳，女，在读博士，主治医师，主要从事小儿泌尿外科疾病诊治、毛囊干细胞相关研究。
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院2012年组织工程专项科研基金(2012zzgc05)；2015年新疆维吾尔自治区自然科学基金-联合基金：毛囊干细胞在膀胱扩大术中的应用(2015211C090)

Tissue explant method versus enzymatic digestion method for culture of rat hair follicle stem cells

Li Jia, An Heng-qing, Wang Feng, Wang Wen-guang, Paluoke Dilimulati, Wang Yu-jie, Mulati Rexiati

First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-11-15 Online:2015-01-01 Published:2015-01-01
Contact: Mulati Rexiati, M.D., Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Li Jia, Studying for doctorate, Attending physician, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Special Fund for Tissue Engineering Research in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University in 2012, No. 2012zzgc05; the Natural Science Foundation of the Xinjiang Uygur Autonomous Region in 2015 (Joint Fund), No. 2015211C090

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力，近年来受到广泛关注，成为种子细胞的研究热点。
目的：比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。
方法：体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊，分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞，利用反复差速贴壁法纯化细胞，定期观察细胞生长状况及形态，流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。
结果与结论：两步酶法获得的细胞生长速度快，获得的细胞量多，而组织块法获得的细胞生长速度较慢，获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%，组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。总的来说，两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞，可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 毛囊干细胞, 培养, 组织块法, 酶消化法, 差速贴壁法, 生长曲线, 表面标志, 组织工程皮肤, SD大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Hair follicle stem cells have been confirmed to have stronger proliferative ability than interfollicular epidermal stem cells, which have been an issue of concern in seed cell research.
OBJECTIVE: To compare the biological characteristics of rat hair follicle stem cells cultured by tissue explant method and enzymatic digestion method.
METHODS: Under stereomicroscope, hair follicles were isolated from the rat whiskers, and then tissue explant method and two-step enzymatic digestion method were employed to culture hair follicle stem cells. Cells were purified using repeated differential adhesion method, and cell growth and morphology were observed periodically. Flow cytometry was used to detect the expression of CD34 and β1 integrin in passage 3 hair follicle stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells cultured by two-step enzymatic digestion method grew faster with more amount than those cultured by tissue explants method. Flow cytometry showed that the expressions of PE-CD34 and FITC-β1 were (39.52±19.57)% and (93.46±4.73)% for the two-step enzymatic digestion group, and (19.20±11.53)% and (363.57±14.42)% for the tissue explant method, respectively. There was a significant difference between the two methods. In conclusion, these two methods are able to culture high-activity hair follicle stem cells, which can be chosen according to different experimental requirements.

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Key words: Stem Cells, Hair Follicle, Cell Culture Techniques

中图分类号:

R394.2

李佳，安恒庆，王峰，王文光，帕洛克•迪力木拉提，王玉杰，木拉提•热夏提. 组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 91-95.

Li Jia, An Heng-qing, Wang Feng, Wang Wen-guang, Paluoke Dilimulati, Wang Yu-jie, Mulati Rexiati. Tissue explant method versus enzymatic digestion method for culture of rat hair follicle stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 91-95.

图/表（结果） 2

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引言

皮肤作为人体第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下组织及其附属器组成。皮肤深层组织及其附属结构一旦遭受破坏，难以完全再生。传统的治疗手段也只是修复皮肤的最基本功能，而对如何进一步恢复全层皮肤的结构和功能，尤其是附属器官的再生仍是难点。组织工程皮肤的出现为皮肤缺损的治疗提供了一条崭新的途径，研究表明，干细胞是组织自我更新和再生修复的细胞来源，可通过分泌大量的细胞因子，促进肉芽组织形成、血管再生等修复过程，选择何种细胞作为皮肤种子细胞已成为当前研究的关键。

毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是存在于毛囊中的干细胞，目前普遍认为毛囊干细胞定位于毛囊上段的隆突(Bulge)区，通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞^[1]。毛囊干细胞具有如下特征：①数量少。②慢周期。③给予刺激后增殖。④未分化特性。⑤自我更新能力和增殖潜能，可分裂产生短暂增殖细胞。⑥存在部位隐蔽、安全，血管丰富，营养条件好，体外克隆形成能力强。研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力，近年来受到广泛关注，成为种子细胞的研究热点^[2]。

在毛囊干细胞的研究中首先要解决的问题就是细胞的获取和纯化，然而由于缺乏特异性标志，毛囊干细胞的分选和培养扩增是一个棘手的问题。有研究表明细胞外基质差速贴壁法是一种简单有效的干细胞分选方法。课题组在此基础上利用Ⅳ型胶原差速贴壁法分选毛囊干细胞，并对分选后的细胞进行鉴定，为毛囊干细胞构建组织工程化皮肤奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2011年10月至2012年10月在新疆医科大学实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级SD大鼠5只，雌雄不限，8-10 d龄，体质量25-35 g，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

显微分离培养：取新生8-10 d的SD大鼠，脱颈椎处死后，立即用5%碘伏消毒大鼠头部，剪下双侧触须部皮肤，每侧面积约1.5 cm×1.5 cm大小，仔细修剪组织去除表皮和绒毛。保存于含双抗的PBS中。

组织块培养法：将乳鼠触须部组织用PBS漂洗后在体视显微镜下用显微镊小心从组织中分离出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，无需剪除毛球部及上端毛干，将其均匀、分散置于3.5 cm培养皿中，每皿8-10块，待组织贴壁后，轻轻加入1 mL含体积分数为10%胎牛血清的K-SFM培养基，每两三天换液1次，观察细胞游出情况以及游出细胞形态。五六天时细胞达到80%-90%汇合后，挑去组织块，继续培养1 d，消化传代。

酶消化培养法：体视显微镜下分离处于生长期的毛囊，剪除毛球部及上端毛干，将毛囊组织置于5 g/L DispaseⅡ中37 ℃摇床消化1 h后入0.125%trypsin-0.01%EDTA 37 ℃消化10 min，过200目筛网，2 000 r/min离心10 min，倒去上清液，K-SFM无血清培养液稀释后计数。以5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于铺有Ⅳ型胶原的25 mL培养瓶中，置于培养箱37 ℃，体积分数为5% CO₂条件下培养。每两三天换液1次，细胞达到80%-90%汇合后，消化传代。

细胞传代：细胞达80%汇合时，弃去培养基，PBS冲洗3次；加入0.125% trypsin-0.01% EDTA 0.6 mL于培养瓶中，37 ℃保温箱中消化30 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的K-FSM 10 mL终止消化。将含细胞的培养基置于25 mL离心管中，2 500 r/min离心15 min后，弃去上清液，保留约1 mL，轻柔吹打混匀，细胞计数后，以5×10⁴或者按1∶3接种于25 mL Ⅳ型胶原包被的培养皿中。将接种细胞的培养瓶置于CO₂培养箱中20 min后取出，吸去上清液，该培养瓶中加入含体积分数为10%胎牛血清的K-SFM培养基继续培养，隔日普通光学显微镜下观察，两三天换液。当达到80%-90%汇合时，进行消化传代或鉴定用。

细胞形态观察：在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

细胞的生长曲线：两种不同方法培养的第3代毛囊干细胞，接种到48孔板中，接种密度5×10³/孔，每天取3个孔，计数后算出平均值，根据计数结果绘制生长曲线。

细胞免疫荧光检测CD34、β1整合素的表达：两种方法培养所得第3代细胞长满瓶底80%-90%后，常规PE免疫荧光标记染色，用DAPI复染后于荧光显微镜下观察表达情况。

具体步骤如下：将培养的第3代毛囊干细胞接种于 3.5 cm的小培养皿中进行培养，当细胞达到70%-80%汇合时，用预冷的无菌PBS轻轻漂洗3次，每次3 min，冷风吹干后用40 g/L的多聚甲醛室温下固定20 min，PBS轻轻漂洗3次，每次3 min；体积分数为3%H₂O₂室温下作用30 min，以除去内源性过氧化物酶，PBS轻轻漂洗3次，每次3 min；2 mol/L稀盐酸于37 ℃下作用1 h，PBS轻轻漂洗3次，每次3 min；0.1%Triton-100室温下作用30 min，PBS轻轻漂洗3次，每次3 min；体积分数为10%正常山羊血清封闭20 min，吸去多余液体以保留薄层血清；加入单克隆抗体CD34，β1整合素(1∶250)放入湿盒中4 ℃过夜；次日用PBS轻轻漂洗3次，每次3 min；分别加入二抗，37 ℃下作用15 min；PBS漂洗后，镜下观察。

流式细胞仪检测CD34、β1整合素的表达：取两组第3代毛囊干细胞，生长汇合率为80%-90%时，胰酶消化，PBS漂洗3次，细胞计数，制成100 μL PBS中溶入10⁶个细胞的细胞悬液，置于1 mL离心管中，分别加入1 μL PE anti-mouse CD34抗体和1 μL FITC anti-mouse β1整合素，室温避光30 min，加入PBS使体积总量为500 μL。另设10⁶细胞为空白对照，流式细胞仪检测CD34、β1整合素的表达。

主要观察指标：①毛囊干细胞形态变化。②毛囊干细胞生长增殖情况。③免疫荧光和流式细胞仪检测毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

毛囊干细胞目前正为国际及国内研究之热点细胞，且研究尚处于早期阶段，发展空间较大，比起传统的骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞具有以下优势及发展空间。毛囊隆突区是干细胞的聚居地，毛囊干细胞作为新的种子细胞日益受到重视。Costarelis等^[3-5]在1990年证实小鼠毛囊中的标记滞留细胞即慢周期角质形成细胞，位于围绕毛囊的外根鞘的bulge部位。

毛囊干细胞是具有多向分化性的干细胞，能分化产生毛囊、皮脂腺、表皮、平滑肌等组织，因此毛囊干细胞的获得和体外培养具有重要的价值。毛囊干细胞在一定条件下，可以向上皮样细胞、平滑肌细胞、神经细胞、骨样细胞、软骨样细胞、脂肪样细胞、神经样细胞分化，具有多分化潜能^[6-12]。

毛囊干细胞的标记物一直是研究热点和难点，目前比较常用的有CD34、K15、K19、CDTl、整合素等^[1，7]。CD34最初用来标记造血干细胞，最近研究发现在鼠毛囊中CD34与滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，可能是目前最理想的鼠毛囊干细胞标记物^[12-14]。
毛囊干细胞可以在一定的条件下诱导分化为尿路上皮样、平滑肌样细胞结构(泌尿系基本组成细胞)，这对泌尿生殖系组织工程学发展提供了新的种子细胞。当前国际发展趋势和最重要迫切的任务是继续对毛囊干细胞在泌尿生殖系统的进一步应用进行研究，构建以毛囊干细胞做为种子细胞的组织工程化泌尿系组织^[15-19]。王平等^[20]使用酶消化法分离兔毛囊干细胞，将毛囊干细胞接种在电纺纳米丝素纤维支架上，应用组织学、荧光染色法观察到毛囊干细胞在支架上能形成复层上皮样结构，且AE1/AE3染色阳性，成功构建了组织工程尿道。故对毛囊干细胞进行更深入彻底的研究，获得成熟的毛囊干细胞的分离纯化方法，研究微环境对毛囊干细胞的诱导分化作用，进一步证明毛囊干细胞在一定条件下能成为构建泌尿系各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，为泌尿系组织工程学拓展了思路，为毛囊干细胞多分化的深入研究奠定了理论实验基础^[21-25]。

毛囊干细胞从本质上来说是皮肤角质干细胞(KSC)，黏附特性是其特性之一，皮肤角质干细胞对基底膜有较强的黏附性，对Ⅳ型胶原、层粘连蛋白(基底膜的主要成分)及细胞外基质的黏附速度要比其他类型细胞快得多，大多数皮肤角质干细胞在10 min之内即黏附在胶原等细胞外基质上^[26-29]。细胞外基质差速贴壁法在表皮干细胞的分选中已得到应用，是一种简单有效的方法。在本实验中首先选用了显微分离技术选取了毛囊干细胞的富集区域，后续进一步培养中分别使用两种最常用的培养方法：组织块培养法和两步酶培养法，分别运用差速贴壁法获得实验用种子细胞^[30-33]。两步酶法获得的细胞生长速度快，获得的细胞量多，而组织块法获得的细胞生长速度较慢，获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46± 4.73)%，组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。

总的来说，两种方法均能培养出毛囊干细胞，可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。

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