牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.022

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8162-8167.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.022

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牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖

聂姗姗，刘佳，张瑞涵，王璇，李伯琦，孙大磊，热甫卡提，刘奕杉

新疆医科大学第一附属医院儿牙预防保健科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2014-11-12 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 刘奕杉，硕士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院儿牙预防保健科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:聂姗姗，女，1989年生，新疆维吾尔自治区昌吉市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主要从事儿童口腔医学，乳牙牙髓干细胞方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区重点实验室医学动物模型研究实验室开放课题(XJDX1103-2013-04)

MHC molecule expression in dental pulp stem cells and mixed lymphocyte proliferation in vitro

Nie Shan-shan, Liu Jia, Zhang Rui-han, Wang Xuan, Li Bo-qi, Sun Da-lei, Refukati, Liu Yi-shan

Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-11-12 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Liu Yi-shan, Master, Associate chief physician, Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Nie Shan-shan, Studying for master’s degree, Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Open Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region Key Laboratory of Medical Laboratory Animal Models, No. XJDX1103-2013-04

摘要/Abstract

摘要：

背景：若牙髓干细胞诱导分化后仍然具有与未分化时相似的免疫调节能力，则有可能为组织工程提供同种异体种子细胞来源。
目的：观察牙髓干细胞表面免疫分子的表达以及体外调节淋巴细胞反应的功能。
方法：从C57BL/6小鼠牙髓组织中分离获取牙髓干细胞，体外培养至第2代，流式细胞仪检测免疫分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达。以1×105/孔牙髓干细胞刺激异体淋巴细胞，观察细胞增殖情况。以1×105/孔数量的牙髓干细胞或经γ-干扰素作用后的牙髓干细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中，观察淋巴细胞增殖情况。
结果与结论：牙髓干细胞表达MHC-Ⅰ类分子，但未检测到MHC-Ⅱ类分子阳性表达。γ-干扰素刺激48 h后，MHC-Ⅰ表达未见明显增高，MHC-Ⅱ类分子表达明显增高。异体或经γ-干扰素作用的牙髓干细胞均未能刺激淋巴细胞体外增殖。说明牙髓干细胞可在体外调节淋巴细胞增殖反应，有可能成为组织工程或细胞治疗中同种异体细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 牙髓干细胞, 混合淋巴细胞培养, MHC抗原, 小鼠

Abstract:

BACKGROUND: If differentiated dental pulp stem cells have immune adjustment ability similar to undifferentiated ones, they could become a new source of allogeneic seed cells in tissue engineering.
OBJECTIVE: To study the immunological properties of dental pulp stem cells and their immunomodulatory effects on lymphocytes in vitro.
METHODS: Dental pulp stem cells were isolated from mouse dental pulp tissue. Cells at passage 2 were detected using flow cytometry for the expression of MHC-I, MHC-II. Inguinal lymphcells were cultured with allogeneic dental pulp stem cells at a density of 1×105 cells per well. Dental pulp stem cells at 1×105 cells per well or interferon-γ-treated dental pulp stem cells were added into the mixed lymphocyte reaction system to observe lymphocyte proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry showed that undifferentiated dental pulp stem cells expressed MHC-I but not MHC-II. After intervention with interferon-γ for 48 hours, increased expression of MHC-I could not been seen in the dental pulp stem cells, but MHC-II expression was increased obviously. No lymphocyte response was induced by allogeneic or interferon-γ-treated dental pulp stem cells as stimulators. Experimental findings suggest that dental pulp stem cells can modulate the proliferation of lymphocytes, which may be expected to become a new source of allogeneic seed cells in tissue engineering or cell therapy.

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Key words: stem cells, dental pulp, lymphocyte culture test, mixed

中图分类号:

R394.2

聂姗姗，刘佳，张瑞涵，王璇，李伯琦，孙大磊，热甫卡提，刘奕杉. 牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8162-8167.

Nie Shan-shan, Liu Jia, Zhang Rui-han, Wang Xuan, Li Bo-qi, Sun Da-lei, Refukati, Liu Yi-shan. MHC molecule expression in dental pulp stem cells and mixed lymphocyte proliferation in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8162-8167.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖能力和多向分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前，已在体外成功的扩增出人体多种组织的成体干细胞，自从2000年Gronthos等^[1]发现人牙髓组织中存在成体干细胞即牙髓干细胞后，近10年来国内外学者对牙髓干细胞的培养、生物学特性、细胞表型、分化能力等方面进行了大量研究。牙髓干细胞被定义为具有自我复制和多向分化能力的克隆源性细胞。一些学者已经证明了牙髓干细胞存在于不同物种的牙髓组织中，并且这些细胞在受到不同刺激时可以分化为不同谱系的细胞，例如脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞^[2-5]。在矿化诱导培养基中，牙髓干细胞能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白^[6]；在脂肪诱导培养基中，牙髓干细胞培养物中出现油红O阳性的脂滴；此外，牙髓干细胞还在mRNA和蛋白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志神经巢蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白，这说明体外培养的牙髓干细胞有向神经样细胞分化的潜能^[7]。其他学者也成功诱导了牙髓干细胞向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化^[8-9]。牙髓干细胞在临床应用中与其他来源于骨髓或脂肪组织的间充质干细胞相比具有很多优势^[10]，Gronthos等^[1]通过对人牙髓细胞及骨髓间充质干细胞的研究发现，两种细胞具有极其相似的免疫表型。自从Miura等^[11]发现人脱落乳牙的牙髓组织中含有一种新的成体干细胞，并将其命名为乳牙牙髓干细胞以来，便成为研究的热点^[12-13]。乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力，可以在短期内获得组织工程需要的细胞量，且在矿化诱导之后，大部分细胞出现了牙本质涎蛋白的阳性表达^[14-15]。此外，乳牙牙髓干细胞还具有高度增殖和克隆形成的特性，当将体外扩增的乳牙牙髓干细胞与羟磷灰石/磷酸三钙联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质-牙髓样结构。

免疫学研究表明，正常状态下骨髓间充质干细胞不表达MHC Ⅱ类抗原、CD80、CD86、CD40等免疫调节分子^[16]；骨髓间充质干细胞在体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内系统性应用骨髓间充质干细胞可明显延长异体皮片移植的存活时间^[17]，在造血干细胞移植同时移植骨髓间充质干细胞可明显降低移植物抗宿主反应^[18]。骨髓干细胞在体外可抑制同种异体T淋巴细胞的免疫应答^[19]，目前骨髓间充质干细胞已经用于同种异体组织工程化组织的构建与组织修复^[20-21]，而牙髓干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相似的免疫学特性，国内外文献少见报道。本研究观察牙髓干细胞表面MHC分子的表达以及体外混合淋巴细胞增殖反应能力，为进一步应用同种异体牙髓干细胞为种子细胞构建组织工程化组织寻找免疫学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：实验于2013年2月至2014年2月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心以及中国科学院上海生命科学研究院完成。

材料：

实验动物：①C57BL/6小鼠10只，5-7 d龄，体质量 4-6 g，由复旦大学动物实验中心提供。②C57BL/6小鼠 1只，4周龄，体质量13-15 g，由复旦大学动物实验中心提供。③Balb/c小鼠1只，4周龄，体质量13-15 g，由复旦大学动物实验中心提供。

牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞增殖实验所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液、α-MEM培养液、胎牛血清、RPMI-1640培养基	美国HYCLONE公司
Ⅰ型胶原酶	美国WORTHINGTON公司
Ⅱ型胶原酶	德国Serva公司
胰蛋白酶	美国GIBCO公司
FITC 标记的抗小鼠 MHC-Ⅰ抗体，FITC标记的抗小鼠MHC-Ⅱ抗体	美国SIGMA公司
恒温CO₂培养箱	美国Forma Scientific公司
普通台式离心机、高速冷冻离心机	美国Heraeus公司
倒置相差显微镜	日本Nikon公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司
7500 Fast型荧光定量PCR仪	美国ABI公司
全波长扫描式多功能读数仪	美国Thermo公司

实验方法：

牙髓干细胞的分离培养：引颈处死5-7 d的C57BL/6小鼠，游离鼠上下颌牙槽骨，乙醇消毒1 min，无菌条件下用显微外科器械获得小鼠前牙的完整牙髓组织。牙髓提取物经含有3%青链霉素的PBS反复冲洗，加入等体积0.3% Ⅰ型胶原酶，37 ℃恒温摇床消化3 h，离散细胞，1×PBS洗涤2次，每次1 500 r/min 离心5 min，弃上清以洗净胶原酶。沉淀用含体积分数为10%胎牛血清α-MEM培养液，置于 37 ℃、体积分数为5% CO₂、100%饱和湿度的条件下培养，细胞融合至70%-80%传代，取体外培养第2代牙髓干细胞进行检测。

淋巴细胞的分离培养：引颈处死4周龄C57BL/6小鼠及Balb/c小鼠，无菌条件下剪开腹股沟处皮肤摘取腹股沟淋巴结，用含有3%青链霉素的PBS反复冲洗，加入0.3% Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化30-40 min，加入含体积分数为10%胎牛血清、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的 RPMI-1640培养基，1 100 r/min离心3 min，弃上清，重复1次，重悬细胞，调整细胞浓度为4×10⁵。

牙髓干细胞的诱导：将第2代牙髓干细胞分为两组，一组继续在普通培养基中培养，另一组添加矿化诱导液(β-甘油磷酸钠10 mmol/L，维生素C 100 mg/L，地塞米松 10^-⁶ mmol/L)，持续培养3周。实验重复选取5组样本进行检测。

诱导后细胞的聚合酶链反应：

提取细胞总RNA以及cDNA合成：参照TriZol Reagent说明书提取总RNA，即10⁵的细胞中加入1 mL TriZol，混匀室温放置10 min，收集培养皿内贴壁的细胞后移入1.5 mL EP管；加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s，室温孵育10 min，4 ℃，1 200 r/min离心15 min，收集上清加入500 μL异丙醇，于4 ℃，1 200 r/min离心15 min；沉淀用体积分数为75%乙醇洗2次，7 500 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清空气干燥5 min，沉淀溶于DEPC水中，并用紫外分光光度仪定量。参照说明书合成cDNA，即5 μg RNA为模板加入引物oligodT12-18，放入70 ℃水浴10 min立即转移入冰水中变性，加入反转酶AMV-RT，60 min，加1 μL RNase H，37 ℃ 20 min。

PCR检测DSPP，DMP1和ALP mRNA的表达：设计鼠的DSPP，DMP1和ALP引物序列(上海生工)，DSPP(sense 5’-GGC TTT GAA GAC ATT GAT TAC-3’ ；antisense 5’-CCC ATG CAG AAA TTT AAC CGC-3’)；DMP1(sense 5’-GGA GGA TGA TGA AGA CGA CA-3’；antisense 5’-TGT TCC TCA CTC TCA CTG TC-3’)；ALP(sense 5’-CCA GCA GGT TTC TCT CTT GG-3’，antisense 5’-CTG GGA GTC TCA TCC TGA GA-3)，进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR buffer 5 μL，25 μmol/L引物1 mL，cDNA模板2 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，ExTaq DNA聚合酶0.5 μL，加水至50 μL。反应条件：94 ℃变性 2 min，94 ℃/(45 s)，56 ℃/(45 s)，72 ℃/(60 s)共35个循环，72 ℃延长10 min，取10 μL PCR产物用1×10^-² g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察并照相。

流式细胞仪检测诱导后细胞表面免疫分子表达：0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，细胞浓度调整为(1.5-3.0)×10⁹ L^-¹，离心，将细胞沉淀用100 μL流式缓冲液(含体积分数为1%胎牛血清的PBS)重悬，分别加入FITC 标记的抗小鼠MHC-Ⅰ抗体，FITC标记的抗小鼠MHC-Ⅱ抗体，4 ℃避光孵育45-60 min，流式缓冲液洗涤，10 g/L多聚甲醛固定，流式细胞仪检测MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ的表达。牙髓干细胞培养液中加入γ-干扰素(20 μg/L)作用48 h，流式细胞仪检测MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ的表达。

异体牙髓干细胞刺激淋巴细胞反应：培养C57BL/6及Balb/c小鼠淋巴细胞，将细胞密度调整为4×10⁶接种于96孔板，分别将诱导前后的牙髓干细胞经PBS反复冲洗后，以1×10⁵/孔数量加入，与淋巴细胞共同培养6 d。分组如下：①诱导组：诱导后C57BL/6牙髓干细胞加入Balb/c淋巴细胞。②未诱导组：未诱导C57BL/6牙髓干细胞加入Balb/c淋巴细胞。③阳性对照组：C57BL/6树突状细胞加入Balb/c淋巴细胞。④阴性对照组：未诱导C57BL/6牙髓干细胞加入C57BL/6淋巴细胞。每组均取3个复孔，收获前10 μL/孔加入Cell Counting Kit-8，37 ℃孵育30 min，全波长扫描式多功能读数仪测量增殖情况，重复3次。

上述各组淋巴细胞与牙髓干细胞共同培养4 d时，加入γ-干扰素刺激48 h，检测细胞增殖情况。

主要观察指标：①诱导后牙髓干细胞ALP、DSPP、DMP1的表达。②诱导后细胞表面免疫分子表达。③异体牙髓干细胞刺激淋巴细胞反应。

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讨论

Gronthos等^[22]认为牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞与骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的生物学途径相似。成牙本质细胞和成骨细胞表达相似的矿化基质蛋白，如Collagen-Ⅰ、Osteonectin、alkaline phosphatese等。矿化组织特异性蛋白是指在骨组织、牙本质和牙骨质中发现并有相应的生成细胞合成的非胶原蛋白质，本实验选取的检测指标ALP、DSPP、DMP1是较明确的矿化组织特异性蛋白，是与牙髓干细胞向成牙本质细胞功能性分化途径密切相关的基因。

牙本质涎蛋白是一种牙本质非胶原蛋白^[23]，有研究还证明牙本质涎蛋白不仅是牙本质矿化所必须的非胶原蛋白，而且还是诱导间充质干细胞分化为成牙本质样细胞的重要因子。

碱性磷酸酶是常用的矿化鉴定指标^[24-25]，也参与牙本质的形成，细胞经矿化液诱导培养后，其碱性磷酸酶活性与矿化结节的形成能力存在正相关^[26]。碱性磷酸酶是牙髓细胞分化的先决条件，其与成牙本质细胞的功能有着密切的联系，它的变化是牙髓细胞分化成牙本质形成的一个标志。实验证实：增殖代谢活跃的牙髓细胞，可释放较多的碱性磷酸酶^[27]，牙髓干细胞在诱导7 d时，碱性磷酸酶表达明显增高。在牙髓中，DSPP被认为是成牙本质细胞特有的标志物，它的表达与成牙本质细胞的分化相关^[28]。本组结果显示：牙髓干细胞作为具有很强分化增殖功能的干细胞，随着诱导时间的延长，牙本质特异性蛋白DSPP、DMP1明显表达，这说明牙髓干细胞在矿化液的诱导作用下，具有向成牙本质细胞分化的功能。

成体干细胞的应用显著拓展了组织工程种子细胞的来源，并且克服了胚胎干细胞应用中存在的伦理问题。本研究中检测了牙髓干细胞表面MHC分子的表达情况，检测结果发现，在正常状态下牙髓干细胞表达MHC-Ⅰ类分子，体外培养第2代的牙髓干细胞未见MHC-Ⅱ类分子明显表达。在γ-干扰素刺激后，MHC-Ⅱ类分子表达明显升高，这一结果与骨髓间充质干细胞的报道非常相符，提示牙髓干细胞可能具有与骨髓间充质干细胞相似的调节淋巴细胞反应的免疫调节功能。因此，进一步进行了牙髓干细胞对淋巴细胞反应调节作用的观察与检测。研究发现，单纯的牙髓干细胞未能刺激异体淋巴细胞产生增殖反应，说明牙髓干细胞具有较低的抗原反应性。在γ-干扰素作用后，虽然牙髓干细胞表达了MHC-Ⅱ类分子，但淋巴细胞未见明显增殖。结果表明牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的较低免疫原性。

研究证明，骨髓间充质干细胞对混合淋巴细胞增殖反应的抑制作用与其来源无关，即无论骨髓间充质干细胞与混合淋巴细胞反应中的任何一方(刺激方、反应方)来源相同，或骨髓间充质干细胞来源于第三方，均能抑制双向混合淋巴细胞反应的增殖作用^[29]。研究发现，牙髓干细胞可明显抑制双向混合淋巴细胞的增殖反应，经过γ-干扰素作用的牙髓干细胞，抑制淋巴细胞增殖的作用与未经γ-干扰素作用组无明显差别，说明牙髓干细胞调节淋巴细胞反应的功能与其MHCⅡ分子表达无关。

本研究结果证明，牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞相近的低免疫原性，同时具有一定的调节免疫反应的能力，可抑制混合淋巴细胞的体外增殖反应。进一步的研究将集中于牙髓干细胞调节免疫反应的作用机制，以及牙髓干细胞在体外诱导分化后其免疫调节功能。若牙髓干细胞诱导分化后仍然具有与未分化时相似的免疫调节能力，则有可能成为组织工程或细胞治疗的新的同种异体种子细胞来源。

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MHC molecule expression in dental pulp stem cells and mixed lymphocyte proliferation in vitro

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