miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8156-8161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.021

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞

王艳华¹，刘浩¹，辛红¹，白晓雪²，刘学娟³，倪宇昕⁴

1天津市人民医院口腔科，天津市 300121；吉林大学白求恩第一医院，2呼吸科，3病理科，吉林省长春市 130021；4吉林大学口腔医院种植科，吉林省长春市 130021

收稿日期:2014-11-06 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 倪宇昕，博士，主治医师，吉林大学口腔医院种植科，吉林省长春市 130021
作者简介:王艳华，女，1977年生，硕士，主治医师，主要从事牙周病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070855)资助

MicroRNA-21 can promote the differentiation of neural crest stem cells from human follicle into Schwann cells

Wang Yan-hua¹, Liu Hao¹, Xin Hong¹, Bai Xiao-xue², Liu Xue-juan³, Ni Yu-xin⁴

1Department of Stomatology, Tianjin People’s Hospital, Tianjin 300121, China; 2Department of Respiratory Medicine, 3Department of Pathology, the First Bethune Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; 4Department of Dental Implantation, Stomatological Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Received:2014-11-06 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Ni Yu-xin, M.D., Attending physician, Department of Dental Implantation, Stomatological Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
About author:Wang Yan-hua, Master, Attending physician, Department of Stomatology, Tianjin People’s Hospital, Tianjin 300121, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070855

摘要/Abstract

摘要：

背景：miRNAs是一类长18-25个碱基的非编码单链小RNA分子，可以与mRNA分子的3’UTR上序列互补结合而调节目标基因的蛋白表达水平。大量证据表明，miRNAs可能起到调节许旺细胞分化、髓鞘形成以及周围神经生长和发育的作用。
目的：观察miR-21在毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞过程中的表达。
方法：培养毛囊干细胞，通过流式分选法从人毛囊中分离神经嵴干细胞，并定向诱导为许旺细胞，在诱导过程中采用qRT-PCR检测miR-21的表达水平。将毛囊神经嵴干细胞分为对照组、agomir-21组、agomir-NC组、antagomir-21组和antagomir-NC组。对照组无干预，agomir-21组加入miR-21的激动剂，antagomir-21组加入miR-21的抑制剂，agomir-NC组和antagomir-NC组分别为agomir-21和antagomir-21的阴性对照组，加入无活性的microRNA类似物。最后，通过数据库寻找miR-21可能的作用靶标。
结果与结论：在毛囊神经嵴干细胞诱导分化为许旺细胞过程中，miR-21表达水平逐渐升高。转染miR-21激动剂agomir-21后，干细胞分化为许旺细胞的能力增强，而转染miR-21抑制剂antagomir-21后可削弱干细胞的分化能力。通过数据库检索发现，SOX2可能是miR-21重要靶基因并参与其调节干细胞分化的作用。结果提示，毛囊神经嵴干细胞可作为许旺细胞的一个重要来源，miR-21可促进此分化过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 分化, 毛囊, 神经嵴干细胞, 许旺细胞, microRNA, 分化, SOX2, 周围神经, 流式细胞术, 髓鞘, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNAs are a class of non-coding single-stranded small RNA molecules containing 18–25 nucleotides that can bind to the 3’UTR of the mRNA molecules and regulate the protein expression of target genes. Studies have shown that microRNAs could regulate Schwann cell differentiation, myelination maturation and growth of the peripheral nerve.
OBJECTIVE: To observe the expression of miR-21 during the differentiation of neural crest stem cells from human follicle into Schwann cells.
METHODS: Hair follicle stem cells were cultured and neural crest stem cells were separated from human hair follicles by flow cytometry. Then, the neural crest stem cells were induced to differentiate into Schwann cells.
qRT-PCR was used to detect the expression of miR-21 in the process of induction. Neural crest stem cells from hair follicles were divided into control group, agomir-21 group, agomir-NC group, antagomir-21 group and antagomir-NC group. The control group was without intervention. Agomir-21 group was transfected with miR-21 agonist, whereas Antagomir-21 group was transfected with miR-21 antagonist. agomir-NC group and antagomir-NC group were respectively negative controls of agomir-21 group and antagomir-21 group. Finally, the possible target of miR-21 was searched in database.
RESULTS AND CONCLUSION: Neural crest stem cells were successfully separated from human hair follicles using flow cytometry and induced to differentiate into Schwann cells. In the process of cell differentiation, miR-21 expression was upregulated gradually. Transfection of miR-21 agonist could enhance the stem cell differentiation into Schwann cells, whereas transfection of miR-21 antagonist could weaken the differentiation capacity of stem cells. Furthermore, we found via database searching that SOX2 maybe a target of miR-21 and participate in the regulatory role of miR-21. This study suggested that hair follicle neural crest stem cells can be used as an important source of Schwann cells and miR-21 can promote the differentiation.

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Key words: stem cells, neural crest, hair follicle, Schwann cells, microRNAs

中图分类号:

R394.2

王艳华，刘浩，辛红，白晓雪，刘学娟，倪宇昕. miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8156-8161.

Wang Yan-hua, Liu Hao, Xin Hong, Bai Xiao-xue, Liu Xue-juan, Ni Yu-xin. MicroRNA-21 can promote the differentiation of neural crest stem cells from human follicle into Schwann cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8156-8161.

图/表（结果） 2

2.1 毛囊神经嵴干细胞分离与培养将人毛囊的隆突部接种于培养液中培养，48 h后可以观察到隆突部边缘有少量梭形细胞生长，见图1A。待梭形细胞数目较多时，用胰酶将细胞消化后HNK1和p75抗体双染，流式分选出HNK1和p75双阳性细胞即神经嵴干细胞，占所有细胞比例的10%左右，见图1B。将神经嵴干细胞种于培养基5 d左右时，形成典型的小的干细胞团块，见图1C。

2.2 miR-21在神经嵴干细胞分化为许旺细胞过程中的表达在诱导第30天时，通过流式细胞术对受诱导的神经嵴干细胞进行检测发现，有(63.8±3.7)%的细胞表达S100，有(72.6±4.9)%的细胞表达GFAP，说明在诱导因子神经调节蛋白1的刺激下，可分化为许旺细胞样细胞，见图2A。

同时，在诱导不同的时间点通过qRT-PCR检测了miR-21的表达，miR-21在诱导分化许旺细胞的第10天上升约3倍，并且随着诱导时间的推移不断上升，此结果表明miR-21在神经嵴干细胞向许旺细胞分化中可能起到了潜在性的调节作用，见图2B。

2.3 miR-21促进神经嵴干细胞分化为许旺细胞神经嵴干细胞转染agomir-21或antagomir-21，然后用20 μg/L神经调节蛋白1作用至40 d，检测干预miR-21是否调控许旺细胞分化。结果发现转染agomir-21的神经嵴干细胞在诱导后有(75.3±5.6)%的细胞同时表达S100和GFAP，明显高于其阴性对照agomir-NC组[(64.2±4.1)%，P < 0.05]；antagomir-21组的神经嵴干细胞在诱导后有(41.1±3.2)%的细胞同时表达S100和GFAP，明显低于其阴性对照antagomir-NC组[(62.0±2.7)%，P < 0.01]，见图3A。

同时，用qRT-PCR对各组细胞中的S100和GFAP mRNA进行了检测(以对照组S100和GFAP mRNA表达为1)，结果发现转染agomir-21的神经嵴干细胞在诱导后S100 mRNA表达量为2.13±0.20，明显高于其阴性对照agomir-NC组(1.03±0.21，P < 0.05)；antagomir-21组的神经嵴干细胞在诱导后S100 mRNA表达量为0.50±0.06，明显低于其阴性对照antagomir-NC组(0.95±0.13，P < 0.05)。agomir-21组和antagomir-21组神经嵴干细胞在诱导后GFAP mRNA表达量分别为3.267±0.439 1和0.533 3± 0.078 81(n=3)，分别高于/低于其阴性对照agomir-NC组(0.88±0.15，P < 0.01)和antagomir-NC组(1.17±0.19，P < 0.05)，见图3B。此结果表明miR-21具有促进神经嵴干细胞分化为许旺细胞的作用。

2.4 SOX2可能是miR-21的靶基因为揭示miR-21促分化作用的机制，通过Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de/ cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi)，Targetscan (http://www. targetscan.org/)和miRBase(www.mirbase.org)3个数据库寻找miR-21的作用靶点，结果发现SOX2基因的3’UTR端包含一个可7 mer大小的序列与miR-21相匹配，见图4。

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引言

毛囊神经嵴干细胞是神经嵴干细胞中研究较多的一种，其优点在于取材方便而来源广泛^[1]。课题组之前的一项研究显示在转化生长因子β1的诱导下毛囊神经嵴干细胞可成功分化为表达SMA和calponin的平滑肌样细胞^[2]。此外，在不同诱导剂的作用下，毛囊神经嵴干细胞还具有分化为许旺细胞、黑色素细胞和神经元等多种成熟细胞类型的潜能。越来越多的证据表明，毛囊神经嵴干细胞可作为许旺细胞的重要来源，在周围神经损伤后组织工程学修复中发挥重要作用^[3-4]。然而，毛囊神经嵴干细胞向许旺细胞分化的机制复杂，目前还未完全阐明，给许旺细胞分化的调节带来一定的困难。近年来有研究提示，体内一种重要的小分子物质microRNA(miRNAs)在许旺细胞分化过程中起到了关键作用^[5]。

miR-21是与干细胞分化和神经再生关系密切的miRNAs之一。之前研究中，Yu等^[6-7]发现在周围神经损伤时组织中miR-21含量明显升高。而microarray检测到，在小鼠坐骨神经许旺细胞髓鞘生成过程中，miR-21水平逐渐上升^[8]。这些研究均提示miR-21与许旺细胞的分化以及髓鞘再生有关，但miR-21对干细胞分化为许旺细胞到底有何种作用以及此种作用通过何种机制产生尚无研究阐明。基于此问题，本研究从人毛囊中分离出神经嵴干细胞，并将其定向诱导为许旺细胞，qRT-PCR方法检测诱导过程中miR-21水平。此外，还人为控制细胞内miR-21水平以观察其对许旺细胞分化的影响，进一步寻找miR-21调节分化可能的基因作用靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：分子生物学实验。

时间及地点：神经嵴干细胞分离、培养与鉴定实验于2012年10月至2013年3月在吉林大学病理学实验室完成，其余实验于2013年4至8月在吉林大学白求恩第一医院医学转化中心免疫学实验室完成。

材料：人含毛囊皮肤组织由吉林大学白求恩第一医院皮肤科提供。

miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞实验所用试剂和仪器：
名称	来源
分散酶	Invitrogen，Grand Island，NY，USA
碱性成纤维细胞生长因子	Sino Biological，北京，中国
HNK1和p75抗体	BD, San Jose, CA, USA
神经调节蛋白1	Sino Biological, 北京，中国
MesenPRO培养基	Invitrogen, Grand Island, NY, USA
一抗兔抗人多克隆抗体S100、小鼠抗人单克隆抗体GFAP	Abcam, Hongkang, China
二抗FITC标记的山羊抗兔IgG/Cy3 标记的山羊抗鼠IgG	博士徳，武汉，中国
荧光显微镜	Olympus, Tokyo, Japan
Trizol	Sigma-Aldrich, MO, USA
EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix	TransGen Biotech, Beijing, China
miR-21特异性引物	RiboBio, Guangzhou, China
TransStart^TM SYBR Green qPCR Supermix	TransGen Biotech, Beijing, China

实验方法：

从人毛囊中分离毛囊干细胞：取新鲜皮肤组织，放入冰冷PBS中运送至实验室，神经嵴干细胞分离方法参考Yu等^[9]和Krej?í等^[10]，简述如下：皮肤组织经PBS冲洗后，在冰上小心剔除皮肤上附着的脂肪组织，然后切成小块。4 ℃下放入含4.8 g/L分散酶的DMEM培养基中过夜。镜下从脱落的表皮上仔细分离收集毛囊，PBS冲洗。37 ℃下，用0.25%的胰酶/EDTA溶液处理2次，每次30 min。消化得到的细胞悬液经40 μm孔径的细胞滤网过滤并计数，然后将细胞种植于培养皿，加入含4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的人胚胎干细胞培养基中。将培养皿放入37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中，每3 d换液1次。

流式细胞分选法筛选神经嵴干细胞：待细胞数量较多时，收集、洗涤细胞制成单个细胞悬液，按照Jiang^[11]和Yang等^[12]方法通过流式细胞分选法进行神经嵴干细胞的筛选，过程简述如下：用PBS稀释细胞至终浓度为(10-20)×10⁹ L^-¹。流式管中按1∶100加入HNK1和p75抗体并混匀，4 ℃避光孵育40 min，用冰冷的PBS洗涤样本， 4 ℃，1 500 r/min离心5 min。PBS重悬细胞后，采用流式细胞仪对细胞进行分选，收集CD271和p75双阳性细胞。

诱导人毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞：按照Liu等^[13]的方法，诱导神经嵴干细胞分化为许旺细胞，简述如下：收集神经嵴干细胞，加入含20 μg/L神经调节蛋白1 (neuregulin-1)的MesenPRO培养基。放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中，每2 d换液1次，共培养28 d。

神经嵴干细胞中敲除SOX2基因：将神经嵴干细胞接种于24孔板中，待细胞汇合度达50%以上时，加入Polybrene至终质量浓度为5 mg/L，加入shRNA慢病毒颗粒(MOI=15)以转染细胞，每15 min摇晃1次培养板以增强转染效果。过夜后弃去培养基，添加500 μL无Polybrene的完全培养基孵育一两天。之后每3 d更换1次含有8 mg/L嘌呤霉素的培养基，杀死非转染的细胞，存活细胞即是敲除SOX2的神经嵴干细胞。

实验分组：为检测miR-21在神经嵴干细胞分化为许旺细胞过程中的变化，在诱导前，诱导10，20，30，40 d时分别收集细胞，qRT-PCR检测细胞内miR-21的水平。

为检测miR-21对神经嵴干细胞分化的影响，收集神经嵴干细胞分为对照组，agomir-21组，agomir-NC组，antagomir-21组和antagomir-NC组共5组，按照上述方法进行许旺细胞方向诱导。分别在诱导前和诱导20 d时，向agomir-21组加入miR-21的激动剂agomir-21至终浓度为200 μmol/L，向antagomir-21组加入miR-21的抑制剂antagomir-21至终浓度为200 μmol/L。agomir-NC组和antagomir-NC组分别为agomir-21和antagomir-21的阴性对照组，加入无活性的microRNA类似物。对照组不作任何处理。按照上述诱导方法诱导至40 d时，免疫荧光染色和qRT-PCR观察各组干细胞分化情况。

免疫荧光染色：为检测干细胞分化情况，将细胞用PBS洗3次，每次3 min，之后用常温40 g/L多聚甲醛固定20 min。PBS洗3次，每次3 min。加入0.1% Triton打孔10 min，PBS洗3次，每次3 min。体积分数为10%血清封闭1 h。按1∶100分别加一抗兔抗人多克隆抗体S100和小鼠抗人单克隆抗体GFAP，4 ℃过夜。过夜后取出室温下放置15 min，PBS洗3次，每次3 min。分别以1∶200加二抗FITC标记的山羊抗兔IgG/Cy3标记的山羊抗鼠IgG，室温下孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min。用Hoechest 33342染核2 min，PBS洗3次，每次3 min，荧光显微镜下观察并拍照。

qRT-PCR检测microRNA和mRNA表达：按Liu等^[2]的方法进行PCR测定miR-21和SOX2 mRNA的表达，步骤简述如下：Trizol法提取总RNA，使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix进行cDNA合成。2.5 μL合成的cDNA、1 μL miR-21特异性引物或S100和GFAP mRNA引物，加入TransStart^TM SYBR Green qPCR Supermix后进行实时定量PCR测定miR-21和SOX2 mRNA水平，PCR仪检测PCR产物SYBR绿色荧光强度，以小RNA分子U6为miR-21内参，GAPDH mRNA为S100和GFAP mRNA内参，定量产物浓度。

主要观察指标：①毛囊分离而来的干细胞表面HNK1和p75蛋白的表达情况。②神经嵴干细胞分化为许旺细胞过程中miR-21的表达情况。③神经嵴干细胞分化中S100和GFAP的mRNA和蛋白表达。

统计学分析：使用SPSS 18.0 for windows软件(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)进行数据处理。计量资料均用x(_)±s表示，分组资料以相对数表示。组间比较采用方差分析及q检验，检验水准α=0.05。

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讨论

毛囊神经嵴干细胞由于具有多分化潜能且取材方便、来源广泛而被认为是再生医学中理想的“种子细胞”来源^[13]，但是如何取得纯度较高的神经嵴干细胞是目前所面临的首要问题。在既往干细胞分离的相关研究中，研究者通常利用毛囊神经嵴干细胞具有迁移性和趋化性这一特点，采用毛囊培养法来分离神经嵴干细胞。此方法操作相对简单、价格低廉，但是耗时相对较长。最重要的一点是毛囊中含有多种类型干细胞如间充质干细胞也具有迁移性的特点，因此通过培养法获得神经嵴干细胞通常达不到满意的纯度。本研究采用流式分选的方法，留取只表达神经嵴干细胞特异性抗原p75和HNK1的干细胞。分离后的细胞经培养后，形成较为典型的神经嵴干细胞团块，保证了之后实验的顺利进行。

神经嵴干细胞在适当诱导剂的刺激下可成功分化为许旺细胞。Liu等^[14]在神经嵴干细胞培养基中加入20 μg/L的神经调节蛋白1刺激40 d后，通过免疫荧光染色检测发现，约有78%和85%的细胞分别表达许旺细胞特异性标志物蛋白。研究表明诱导时间太长可能会影响对miR-21调节分化作用的观察，因此把诱导时间定为4周。诱导4周后通过免疫荧光检测发现，大约有65%和73%的细胞分别表达S100和GFAP。同时在诱导过程中，检测了miR-21的动态表达，结果显示细胞内miR-21在诱导10 d周时表达上升并不明显，在20，30 d时表达急剧上升，约为诱导前的8倍，在第40天时上升趋于平缓。结合既往研究显示miR-21在髓鞘损伤后表达上调的结果，初步认为miR-21在神经嵴干细胞分化为许旺细胞的过程中起到了调节作用。

miR-21是人类中较早发现广泛存在的miRNAs之一，在物种间具有高保守性。miR-21定位于17号染色体q23.2处的FRA17B脆性区域上，具有自主转录单位，其转录受到包括STAT3、AP-1和NFI等多种增强子的调节^[15]。STAT3是miR-21转录水平上重要的调控因素，在某些肿瘤中STAT3的激活会导致miR-21的显著表达^[16-17]。另外有研究表明，神经调节蛋白1与细胞膜表面受体结合后，可增强下游通路中STAT3的磷酸化激活^[18]。因此推测，在诱导神经嵴干细胞分化为许旺细胞的过程中，miR-21升高的原因是由于神经调节蛋白1作用于下游通路导致STAT3磷酸化所致。miR-21功能复杂，主要涉及胚胎发育、肿瘤、纤维化和免疫反应等领域。在胚胎发育过程中，随着胚胎成熟miR-21水平逐渐升高，并通过作用靶基因RECK和PDCD4调节分枝化形态发生。此外，miR-21水平在胶质瘤、肺癌和肝癌等多数肿瘤中表达上调，并通过结合不同的靶基因促进肿瘤的生长。本研究将miR-21的激动剂agomir-21转染至神经嵴干细胞中，神经嵴干细胞分化为许旺细胞的能力增强，而加入miR-21的拮抗剂antagomir-21却会抑制细胞的分化，表明除了上述功能，miR-21还具有促进神经嵴干细胞分化为许旺细胞的作用。结合神经调节蛋白1对miR-21转录的促进作用，可以认为调控miR-21表达可能作为神经调节蛋白1促进分化的另一重要途径。

为揭示miR-21调节神经嵴干细胞分化的机制，通过数据库寻找miR-21的作用靶点，结果发现SOX2基因的3’-UTR端包含一个7 mer大小的序列可与miR-21相匹配，提示SOX2可能是miR-21发挥作用的下游靶基因。SOX2是SOX (sry-related HMG box-containing)基因家族中的一员，编码的SOX2蛋白有317个氨基酸，通过HMG盒结构域结合靶基因，发挥转录因子的调节活性。SOX2参与脊椎动物的胚胎发育，维持神经干细胞的不分化状态、多向性分化潜能以及自我复制能力等。研究证实，SOX2可抑制神经干细胞分化为许旺细胞和髓鞘生成^[19-20]。因此认为SOX2可能是miR-21的一个重要的靶点并参与了miR-21调节神经嵴干细胞分化的作用，但两者之间的靶点验证还待进一步研究。

综上所述，研究发现miR-21在神经调节蛋白1刺激后表达上调，并可能通过抑制SOX2基因表达，从而促进神经嵴干细胞分化为许旺细胞的能力。本实验对miRNAs与许旺细胞分化的相关研究作出补充，为周围神经的组织工程学修复提供一条新的思路。

miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞

MicroRNA-21 can promote the differentiation of neural crest stem cells from human follicle into Schwann cells

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