sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8054-8060.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.004

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sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

刘伟¹，王杰¹，幸永明¹，李纯志¹，陈昌伟¹，赵宏¹，龚德军²

1解放军第113医院骨科，浙江省宁波市 315040；2解放军第二军医大学附属长海医院胸心外科实验室，上海市 200433

收稿日期:2014-11-02 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
作者简介:刘伟，男，1982年生，四川省眉山市人，汉族，2009年解放军第二军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱外科和组织工程研究。
基金资助:
南京军区医学科技创新重点课题 (12Z06)，课题名称：LMP-1和SOX9共修饰BMSCs后复合血小板凝胶生物支架构建组织工程髓核的实验研究

Cotransfection of sox9 and LMP1 genes in rabbit bone mesenchymal stem cells through lentivirus vectors in vitro

Liu Wei¹, Wang Jie¹, Xing Yong-ming¹, Li Chun-zhi¹, Chen Chang-wei¹, Zhao Hong¹, Gong De-jun²

1Department of Orthopaedics, the 113th Hospital of PLA, Ningbo 315040, Zhejiang Province, China; 2Chest Cardiac Laboratory, Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Received:2014-11-02 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
About author:Liu Wei, M.D., Attending physician, Department of Orthopaedics, the 113th Hospital of PLA,th Ningbo 315040, Zhejiang Province, China
Supported by:
the Medical Innovation Project of Nanjing Military Region, No. 12Z06

摘要/Abstract

摘要：

背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。
目的：构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察SOX9和LMP1基因的表达情况。
方法：双酶切从GeneArt提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。
结果与结论：测序结果显示质粒pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 慢病毒, sox9基因, LMP1基因, 椎间盘, 髓核细胞, 共转染, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Compared with the traditional method of cytokines, gene transfection into a host cell by lentivirus can achieve a sustained long-term efficient expression. Double/multiple gene co-modification therapy is superior to single gene therapy to induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells.
OBJECTIVE: To build two recombinant lentivirus vectors separately expressing sox9 and LMP1 genes, and then co-transfect rabbit bone marrow mesenchymal stem cells for observing the expression of sox9 and LMP1 genes.
METHODS: Double enzyme digestion was performed for plasmid 13abiv6c_1366933 containing sox9 gene sequences provided by GeneArt, and the sox9 gene was cloned into pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP carrier to harvest the plasmid pLMIG-13GS0345-1 including sox9 gene. Through single oligo design and synthesis of LMP1 gene sequences that were cloned into pLenti6.3_MCS_IRES2 DsRed-Monomer carrier, the plasmid gs0318 13-1 including LMP1 gene was obtained. The plasmids were packed by 293T cells to obtain the recombinant lentivirus vector carrying sox9 gene marked by green fluorescent protein markers (Lenti-SOX9-GFP) and the recombinant lentivirus vector carrying LMP1 gene marked by red fluorescent protein markers (Lenti-LMP1-RFP). The Lenti-SOX9-GFP and Lenti-LMP1-RFP were co-transfected into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells to observe the expression of sox9 and LMP1 genes.
RESULTS AND CONCLUSION: Sequencing results showed that the insert sequences of plasmids pLMIG-13GS0345-1 and 13GS0318-1 were completely consistent with the sox9 gene (NM_000346) and LMP1 gene (AF345904.1) sequences in the Genbank respectively, indicating that the Lenti-SOX9-GFP and Lenti-LMP1-RFP were successfully constructed. The expression of green fluorescent protein and red fluorescent protein could be observed in the same view after co-transfection of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells by Lenti-SOX9-GFP and Lenti-LMP1-RFP. The RT-PCR and western blot assay results also proved that the Lenti-SOX9-GFP and Lenti-LMP1-RFP could successfully and efficiently co-transfect the bone marrow mesenchymal stem cells, and mRNA and protein expressions of SOX9 and LMP1 gene could be successfully observed. The recombinant lentivirus vectors Lenti-SOX9-GFP and Lenti-LMP1-RFP were successfully constructed and successfully co-expressed in the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, which provided preliminary experimental basis for further research in nucleus pulposus tissue engineering.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, lentivirus infections, SOX9 transcription factor

中图分类号:

R394.2

刘伟，王杰1，幸永明，李纯志，陈昌伟，赵宏，龚德军. sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8054-8060.

Liu Wei, Wang Jie, Xing Yong-ming, Li Chun-zhi, Chen Chang-wei, Zhao Hong, Gong De-jun. Cotransfection of sox9 and LMP1 genes in rabbit bone mesenchymal stem cells through lentivirus vectors in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8054-8060.

图/表（结果） 3

2.1 慢病毒载体构建结果测序结果显示含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1中的插入序列与SRY-related high mobility group-box gene 9，sox9(NM_000346，共 1 550 bp)完全一致，含LMP1基因的质粒13GS0318-1中的插入序列与Homo sapiens LIM mineralization protein 1 (AF345904.1，共1 374 bp)完全一致(测序图略)，未见碱基突变。序列插入位点分别位于pLenti6.3_MCS_ IRES2-EGFP载体的BamHI/AscI和pLenti6.3_MCS_ IRES2-DsRed-Monomer载体的BamHI/AscI。将构建的Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1- RFP病毒原液转染293T细胞24 h后，在荧光显微镜下可见绿色或红色荧光蛋白的表达(图1，2)。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒滴度测定结果分别为2.5×10⁷TU/mL 和2.05×10⁸ TU/mL。

2.2 兔骨髓间充质干细胞的体外培养结果刚提取的骨髓间充质干细胞为圆形，悬浮于培养液中，可见有圆盘状血细胞混杂其中。培养7 d左右骨髓间充质干细胞已贴壁，培养14 d后骨髓间充质干细胞呈多种形态，如梭形，胞体膨大，有长短不一的胞质突起，并呈集落生长(图3A)。已传第3代的骨髓间充质干细胞，细胞纯度较高，生长速度较快，细胞密度较高，已达95%融合(图3B)。

2.3 Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞的MOI确定慢病毒转染后骨髓间充质干细胞在荧光显微镜下细胞呈多角形，胞体增大、胞质伸展相互交错，胞质内充满绿(或红)色荧光物质，DAPI标记的细胞核清晰可见，不同MOI值(50，100，150，200)条件下的转染率见表2，测定结果显示Lenti-SOX9和Lenti-LMP1的最佳MOI分别为100和150，其转染率均约为85%。

2.4 MTT法检测转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响经MTT细胞增殖试剂盒检测Lenti-SOX9、Lenti-LMP1或空白慢病毒Lenti-NC转染(MOI 200)后5 d内骨髓间充质干细胞的生长情况，实验结果显示高转染复数的Lenti-SOX9- GFP及Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体分别转染骨髓间充质干细胞后的细胞生长曲线与未处理的细胞基本一致，统计分析表明，各种处理细胞的生长特性差异无显著性意义(图4，P > 0.05)。表明慢病毒转染对骨髓间充质干细胞的生长增殖没有明显的影响。

2.5 Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体对兔骨髓间充质干细胞的同时转染结果将Lenti-SOX9- GFP(MOI 100)和Lenti-LMP1-RFP(MOI 150)慢病毒载体同时转染第3代骨髓间充质干细胞，继续培养72 h后通过荧光显微镜观察转染荧光情况。结果见图5所示，共转染的骨髓间充质干细胞同一视野中不同激发光下既有红色荧光，也有绿色荧光蛋白表达，说明Lenti-SOX9和Lenti-LMP1慢病毒载体可以同时成功转染骨髓间充质干细胞。

2.6 Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞后sox9与LMP1 mRNA的表达情况骨髓间充质干细胞被重组慢病毒Lenti-SOX9-GFP和Lenti- LMP1-RFP共转染后48 h，抽提细胞总RNA进行RT-PCR分析。结果显示共转染组出现位置大小为320 bp及1 400 bp的条带，这与sox9(304 bp)及LMP1(1 383 bp)预期结果相符

合，而空白慢病毒Lenti-NC转染组没有发现sox9或LMP1的基因表达。

sox9 mRNA表达：见图6，Lenti-SOX9与共转染处理组中sox9 mRNA(304 bp)表达稍多，条带较强，且组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，Lenti-LMP1组有微弱条带，与Lenti-SOX9及共转染组相比，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。LMP1 mRNA表达：见图7，Lenti-LMP1与共转染处理组中LMP1 mRNA(1 385 bp)表达稍多，条带较强，且组间差异无显著性意义(P > 0.05)，Lenti-NC及Lenti-SOX9-GFP转染组未见LMP1 mRNA表达，见表3。

2.7 Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒共转染骨髓间充质干细胞后SOX9与LMP1蛋白的表达情况：经Western Blot检测各分组处理后骨髓间充质干细胞中目的蛋白表达，可以观察到M_r42 000处有β-Actin参比条带，而经Lenti-LMP1或Lenti-SOX9慢病毒分别转染骨髓间充质干细胞72 h后，分别在有SOX9和LMP1特征条带表达，而Lenti-NC转染组未见表达。

SOX9蛋白表达：见图8，Lenti-SOX9与共转染处理组中观察到M_r80 000-85 000处有条特征带，其相对分子质量大小与SOX9融合蛋白(55 000+27 000=82 000)相吻合，条带较强，且组间差异无显著性意义(P > 0.05)，Lenti-LMP1处理组有少量SOX9蛋白表达，与Lenti-NC转染组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

LMP1蛋白表达：见图9，Lenti-LMP1与共转染处理组中观察到M_r88 000-95 000处有条特征带，其相对分子质量大小与LMP1融合蛋白(63 000+27 000=90 000)相吻合，其中Lenti-LMP1处理组表达条带较强，具有组间统计学差异(P < 0.05)，Lenti-SOX9转染组及空白慢病毒转染组未见LMP1蛋白表达，见表3。

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引言

在体内，髓核组织修复和再生涉及复杂的信号调控网络及多种细胞因子的共同参与，研究表明sox9和LMP1基因在髓核组织修复和再生过程中具有重要的作用。调节Ⅱ型胶原合成的性别决定区Y-Box(sex determining region Y-Box9，sox-9)在髓核退变中越来越受到人们的关注，sox9基因可能参与了椎间盘从发育、成熟到退变的整个变化过程，增加sox9可以明显增加Ⅱ型胶原的合成，从而可能达到对退变椎间盘的修复作用^[1-2]。而细胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1基因是近年证实与椎间盘退变相关的基因之，其表达产物为一种细胞内非分泌性骨诱导蛋白，它可通过调节各种细胞因子的生成和其他相关基因的表达，来实现其所诱导的透明样基质的合成增加。研究证明LIM矿化蛋白1基因在椎间盘细胞过度表达，以及通过骨形态发生蛋白介导机制，在体内外条件下均可增加蛋白聚糖、硫酸氨基葡聚糖及Ⅱ型胶原的合成，从而减缓甚至逆转椎间盘细胞的退化^[3]。

目前大多数学者均采用单一的生长因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化，应用效果有限，而采取双/多基因共修饰治疗的策略，则可获得更好的效果^[4]，因此LIM矿化蛋白1和sox9基因的共表达可能会更有利于骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转化以及特异髓核细胞外基质的表达。

通过慢病毒载体将目的基因转染真核细胞后可以达到较为长期、高效、局部的效果，本研究通过分别构建绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的慢病毒载体以及红色荧光蛋白标记的携带LIM矿化蛋白1基因的慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9和LIM矿化蛋白1基因的表达情况，为下一步实验奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2013年8月至2014年2月在解放军第二军医大学长海医院科技楼完成。

材料：

实验动物：雄性3-5周龄新西兰大白兔，体质量1.0- 2.0 kg，购于中科院上海实验动物中心。

实验方法：

Lenti-SOX9-GFP(绿色荧光蛋白标记)和Lenti-LMP1-RFP(红色荧光蛋白标记)慢病毒载体的构建：从GeneArt提供的含SOX9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933中按Bam HⅠ和Asc Ⅰ双酶切下目的片段并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体中。用Bam HⅠ和AscⅠ双酶切质粒及载体pLenti6.3_MCS_ IRES2-EGFP，连接目的片段和载体，并转化到感受态细胞DH5。测序验证重组克隆插入片段的序列信息，含有目的序列的正确质粒编号为pLMIG-13GS0345-1。根据AF345904.1，Homo sapiens LIM mineralization protein 1(LMP1)，共1 374 bp，对所需合成的序列进行分析，进行单链oligo的设计及合成，利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因序列，将合成好的序列装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞DH5。用Bam HⅠ/ AscⅠ把TA克隆质粒进行酶切，用T₄ DNA ligase连接回收的片段与载体，并将连接产物转化感受态细胞DH5a，从转化的平板上挑取多个单克隆进行测序验证。得到含LMP1目的基因序列的慢病毒表达载体13GS0318-1。

通过脂质体转染方法将质粒pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1分别转染对数生长期的293T细胞，获得绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞实验所用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
13ABIV6C_1366933质粒	GeneArt
Bam HⅠ、AscⅠ	MBI
感受态细胞DH5α	全式金
pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP	Invitrogen改造
pMD18-T vector	Takara
platinum Pfx DNA Polymerase、platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity、 pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer、 Trizol试剂、Lipofectamine 2000	Invitrogen
包装质粒pLP1，pLP2，pLP/VSVG、293T细胞	Life technologies
胰蛋白酶、鼠抗兔β-actin单克隆抗体、DAPI试剂	Sigma
BCA蛋白定量分析试剂盒	Hyclone
cDNA反转录试剂盒	Qiagen
鼠抗兔SOX9蛋白抗体	LifeSpan BioScience
鼠抗兔PDLIM7蛋白抗体	Abcam
羊抗鼠IgG-HRP	北京中山生物技术有限公司
RNA提取试剂盒	北京百泰克生物技术有限公司
反转录试剂盒	Omega
sox9、LMP1、β-Actin引物	由上海吉玛制药技术有限公司合成

载体，以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定：取健康新西兰大白兔麻醉后，双侧股骨转子部位脱毛，无菌操作下用16号骨髓穿刺针在股骨转子处穿刺抽取约5 mL骨髓液。1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(含有100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素)反复吹打混匀后，将单细胞悬液接种于细胞培养瓶，在37 ℃，体积分数5% CO₂细胞培养箱中培养。72 h后首次换液，后隔日换液。待细胞长满瓶底时(融合率达90%)，通过倒置显微镜观察细胞并拍照，并以1∶4比例反复传代。

Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体对骨髓间充质干细胞的转染及条件优化(MOI值)：取第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，以5×10⁴/孔铺12孔板，待细胞达至70%-80%融合时，分别转染空白慢病毒、Lenti- SOX9-GFP或Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。感染复数(Muhiplicities of infection，MOI)分别为50，100，150，200。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中继续培养72 h后弃培养液，PBS清洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min；PBS再次漂洗5 min，加入DAPI工作液室温染色20 min，PBS漂洗后倒置荧光显微镜下观察转染后细胞内荧光发光情况，倒置荧光显微镜下取6个视野细胞计数，计算各MOI值转染情况下病毒的转染效率，转染率=红(或绿)荧光细胞数/镜下DAPI标记的细胞数×100%。

MTT法检测转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响：取第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞进行消化，以1×10⁴/孔铺96孔板，待细胞至70%-80%融合时，将高转染复数的Lenti-SOX9-GFP及Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体分别转染骨髓间充质干细胞(MOI 200)，每组设3个平行孔，未处理组作为阴性对照。转染后第1-5天采用MTT法检测细胞生长情况，每天取出一块培养板，向每孔加入20 μL新鲜配制的MTT液(5 g/L)，继续培养4 h，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解后在酶标仪上读取570 nm波长的吸光度A值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒对兔骨髓间充质干细胞的同时共转染：取第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞以5×10⁴/孔铺12孔板，待细胞达至70%-80%融合时，将优化MOI后的Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1- RFP慢病毒载体同时转染骨髓间充质干细胞，轻轻混匀。置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中继续培养72 h后，DAPI试剂对细胞核染色，PBS漂洗后通过倒置荧光显微镜观察转染后细胞中细胞核与胞质中的荧光发光情况，取6个视野细胞计数，计算慢病毒共转染效率，转染率=红(或绿)荧光细胞数/镜下DAPI标记的细胞数×100%。

RT-PCR检测慢病毒共转染骨髓间充质干细胞后sox9 mRNA和LMP1 mRNA的表达：将骨髓间充质干细胞以5×10⁴/孔铺12孔板，待细胞达至70%-80%融合时，分为4组进行转染，(A)空白慢病毒Lenti-NC转染组、(B)Lenti- SOX9-GFP转染组、(C)Lenti-LMP1-RFP转染组、(D)Lenti- SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染组，每组设3个复孔。培养72 h后，PBS清洗2次，加入Trizol试剂裂解各组细胞，按照参照Qiagen公司反转录试剂盒说明书提取总RNA。进一步对各组细胞RT-PCR检测，RT-PCR引物见表1。

sox9的反应体系和条件：50 μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL+dNTP(10 mmol/L)1.0 μL+Senseprimer (10 μmol/L) 1.0 μL+Anti-senseprimer(10 μmol/L)1.0 μL+ cDNA 1.0 μL + ddH₂O 39.0 μL + Taq DNA polymerase 1.0 μL；反应条件：94 ℃ 40 s，58 ℃40 s，72 ℃ 2 min，35 cycles；72 ℃ 5 min。

LIM矿化蛋白1的反应体系和条件：50 μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL+dNTP(10 mmol/L) 1.0 μL+ Senseprimer (10 μmol/L) 1.0 μL+Anti-senseprimer (10 μmol/L)1.0 μL+cDNA 1.0 μL+ ddH₂O 39.0 μL+Taq DNA polymerase 1.0 μL；反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35 cycles；72 ℃ 5 min。反应结束后取5 μL产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。

Western-Blot检测慢病毒共转染骨髓间充质干细胞后SOX9和LMP1蛋白的表达：将第3代骨髓间充质干细胞以1×10⁵/孔铺6孔板，待细胞达至70%-80%融合时，分为4组进行转染，(A)空白慢病毒Lenti-NC转染组、(B)Lenti-SOX9-GFP转染组、(C)Lenti-LMP1-RFP转染组、(D)Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染组，每组设3个复孔。继续培养72 h后，裂解细胞后提取各孔总蛋白质。进行凝胶电泳及转膜封闭后，分别加入1∶500鼠抗兔SOX9蛋白抗体或鼠抗兔PDLIM7蛋白抗体和1∶1 000的β-actin单克隆抗体溶液，室温振荡孵育2 h，TBST漂洗3次。再加入1∶2 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体溶液，室温振荡孵育30 min，TBST漂洗3次。在PVDF膜上滴加2 mL化学发光试剂ECL作用5 min，暗室内用底片曝光，形成蛋白条带以评价SOX9及LMP1蛋白的表达。

主要观察指标：①慢病毒载体构建结果。②兔骨髓间充质干细胞的体外培养结果。③MTT法检测转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响。④Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1- RFP慢病毒载体对兔骨髓间充质干细胞的同时转染结果。⑤兔骨髓间充质干细胞体外慢病毒共转染后目的基因与蛋白的表达情况。

统计学分析：通过BioRad GISIl000型凝胶成像系统对凝胶电泳进行扫描保存，采用Quantity One软件对的目的片段的灰度值进行测定，以β-Actin目的条带作为内参照，计算SOX9、LIM矿化蛋白1基因或蛋白片段实测的灰度值与β-Actin实测灰度值的比值，作为目的mRNA或蛋白相对含量。利用SPSS 12.0统计软件包分析数据，数据以x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

sox9基因属于sox基因家族成员之一，是Ⅱ型胶原合成以及软骨形成过程中的一个必需的转录因子，也是维持软骨表型的主要调控基因^[5]。目前的研究发现，通过SOX9转染兔骨髓间充质细胞后，可上调sox9基因的表达，使细胞内软骨特异性的分子如Ⅱ型胶原等的因子表达，增加椎间盘内Ⅱ型胶原的合成，有望恢复椎间盘的生理活性，促进其修复^[6-7]。人LIM矿化蛋白1也是促进髓核基质生成活性最强的生物因子之一，已证实其在成骨细胞分化过程中有着重要作用^[8]，可能通过招募众多的成骨因子共同参与了髓核细胞的形成。Yoon等^[9]通过腺病毒载体将LIM矿化蛋白1基因转到入兔椎间盘细胞，结果表明LIM矿化蛋白1基因可使骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的表达明显增加，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA合成也明显增加。

骨髓间充质干细胞是目前髓核组织工程中应用最广泛的种子细胞之一，具有取材方便、对机体损伤少、与生物支架材料的黏附性能好、在体外培养具有较强的增殖传代能力等优点^[10-11]。目前主要通过在体外或体内应用细胞生长因子或将其通过基因转染的方法导入细胞内表达促骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转化，在众多相关生长因子中，SOX9及LIM矿化蛋白1为最重要的诱导生长因子，在髓核组织的形成、生长和修复过程中起着最关键作用，也是目前髓核组织工程中研究的热点。

慢病毒载体属于一种新型的反转录病毒载体，它可感染分裂细胞和非分裂细胞，具有将目的基因整合到宿主细胞基因组、感染效率高、稳定长效转染等优点，能将目的基因高效导入动物和人的原代细胞或细胞系^[12]。本实验选用的Invitrogen ViraPower^TM系列慢病毒系统为四质粒包装系统，属于第3代慢病毒载体系统^[13]，可以高效感染宿主细胞，是实现基因治疗较为理想的载体，有望将这两种目的基因共同在兔骨髓间充质细胞(骨髓间充质干细胞)中持续稳定表达，为课题研究逆转椎间盘退变提供有力的工具。

本实验通过不同荧光标记的慢病毒载体介导sox9及LMP1基因体外成功高效转染至骨髓间充质干细胞，转染后的骨形态发生蛋白在荧光显微镜下细胞呈多角形，胞体增大、胞质伸展相互交错，胞质内充满绿色及红色荧光物质，确定了慢病毒的最佳感染复数MOI分别为100及150，转染效率分别为(90.3±5.2)%与(82.5±9.1)%。同时，通过MTT法检测转染后5 d的细胞增殖能力，发现这两种慢病毒转染不影响骨髓间充质干细胞的增殖能力。作者进一步将Lenti-SOX9与Lenti-LMP1在最佳MOI条件下同时转染骨髓间充质干细胞，72 h后采用荧光显微镜观察，RT-PCR与Western Blot检测，结果证明Lenti-SOX9与Lenti-LMP1可成功高效转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1，显著高于对照组。本部分研究结果证实SOX9及LIM 矿化蛋白1可在骨髓间充质干细胞稳定表达，将为下一步验证LIM矿化蛋白1和SOX9的共表达会是否有利于骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转化以及特异髓核细胞外基质的表达奠定了实践基础。

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sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

Cotransfection of sox9 and LMP1 genes in rabbit bone mesenchymal stem cells through lentivirus vectors in vitro

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