骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连：实验成果与转化应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：利用骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下可分化为成骨细胞的特性，直接在骨折骨不连部位进行自体骨髓间充质干细胞移植，这一新技术受到广大骨科临床医师的关注。

目的：总结分析采用骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连的临床疗效。

方法：检索 1998至2014年西文生物医学期刊文献数据及CNKI数据库有关骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连的文献，英文检索词为“bone marrow stem cells(BMSCs),stem cell transplantation(SCT), nonunions,tissue engineering”，中文检索词为“骨髓间充质干细胞，干细胞移植，骨不连”。排除内容重复和缺乏原创性文献，保留 36篇文献做进一步分析。

结果与结论：将骨髓间充质干细胞移植到骨不连断端骨组织，可诱导其分化为成骨细胞来修复骨不连、骨缺损，为临床应用奠定了理论基础。骨髓间充质干细胞具有明确的骨缺损修复能力，众多研究表明采用骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连是安全、有效的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨不连, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植术, 骨组织工程

Abstract:

BACKGROUND: As bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoblasts under certain induction conditions, autologous bone marrow mesenchymal stem cells can be implanted into the bone nonunion site of bone fracture. This new technology garners increasing attention of orthopedic clinicians.

OBJECTIVE: To summarize the clinical efficacy of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of bone nonunion of limb fractures.

METHODS: A computer-based search of Foreign Medical Journal Full-Text Service and CNKI databases was performed for articles related to bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of bone nonunion of limb fractures published from 1998 to 2014 using the keywords of “bone marrow stem cells (BMSCs), stem cell transplantation (SCT), nonunions, tissue engineering” in English and Chinese, respectively. Literatures with repetitive content and lack of originality were excluded. A total of 36 literatures were obtained for further analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells are transplanted into the end of bone nonunion, and then can be induced to differentiate into osteoblasts to repair bone nonunion and bone defects,laying a theoretical basis for clinical application. Bone marrow mesenchymal stem cells can repair bone defects, which provides an effective method and material to promote fracture healing. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells is safe and effective for treatment of bone nonunion of limb fracture.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, fractures, bone

中图分类号:

R318

杨俊丽，韩霞，孙明启. 骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连：实验成果与转化应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7337-7341.

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图/表（结果） 1

2.1 骨不连研究现状骨不连又名骨折不愈合，是指在各种因素影响条件下，骨折愈合停止，骨折两端未能达到骨性连接的骨折，骨折端会形成假关节，是骨折常见的晚期并发症之一，是目前创伤骨科的棘手难题之一。骨折的愈合过程包括血肿期、纤维骨痂形成期、骨性骨痂形成期和塑形改建期。目前对于骨不连没有统一的定义，美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)将“损伤和骨折后至少9个月，并且没有进一步愈合倾向已有3个月，称为骨不连”^[1]，临床上对于骨不连的诊断有赖于临床症状和物理征，包括病患骨折端的疼痛感、查体有骨擦感及影像学上骨不连、假性关节腔等证据。

骨不连病理学表现主要为：骨折愈合明显停滞、成骨细胞增生不活跃或成骨细胞凋亡，骨折间隙内软骨性和纤维性骨化，骨折周围血管再生差或者无新生血管。目前已有研究证实许多生物因素及细胞因子在骨折修复过程中均起着非常关键的作用^[2-3]，而这些因素或者细胞因子对作用时间长短、骨折周围血供条件及内环境均有较严格的要求。

刘傥等^[4]通过对骨不连的病理学研究，发现骨的愈合能力是由成骨细胞的活力决定的，而成骨细胞又是被骨形态发生蛋白、成纤维生长因子等体内因子所调控。虽然机体在骨断端缺乏血供的条件下存在某些代偿机制，但这些代偿机制在血管重建和新生骨形成方面与正常骨折修复在时相上和作用方式上有所不同^[5-6]，最终造成骨折的纤维瘢痕修复而非骨组织完全性再生。以上促进成骨细胞趋化的因子能发挥功能的基础是血液循环，因此尽最大努力减小骨膜及软组织的剥离和保护游离骨块与软组织的联系，需要临床骨科医师术中着重注意。骨不连的原因是多方面的，而创伤性骨折后并发骨不连临床比较多见。骨局部条件是影响骨折愈合的主要因素，局部血供破坏是导致骨不连的最常见诱因^[7]，可能的原因包括患者全身情况、骨折端局部情况和医源性因素，像软组织损伤、血供不足、骨折块过于粉碎、软组织插入、营养不良、感染、固定不牢固、骨膜剥离过多等，以及其他全身性疾病都会影响到骨折端的愈合^[8]。

在临床上，可能遇到合并有严重皮肤软组织损伤的开放性四肢骨折，在这类损伤的患者中，通常选用外固定，同时需要反复多次清创、皮瓣转移等修复局部软组织缺损，会出现局部软组织条件差，血运差，此刻无论采用拆去外固定还是不予任何干预的保守治疗，都将导致骨不连。面对两难的困境，目前骨不连治疗方法包括局部超声刺激、电及电磁刺激，也采用局部注射红骨髓或者促进骨折愈合的药物等治疗。有文献报道，这类损伤的患者当中，骨不连的发生率仍高达23%^[9]。

随着分子生物学技术以及组织工程学方面的研究进展，骨不连的治疗观念有了很大突破性改进。直接在骨折骨不连部位进行自体骨髓间充质干细胞移植，给予合适的诱导条件，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这一新技术引起了广大骨科临床医师的重视。骨科临床致力于研究可否利用骨髓间充质干细胞可被诱导分化为成骨细胞的这一特殊潜能，将其移植到骨不连断端，利用有效治疗浓度的骨髓间充质干细胞，即骨髓间充质干细胞浓度越高，其成骨能力越强^[10]，加速骨形态发生蛋白、成纤维生长因子等体内因子趋化调控，加速骨折骨不连的愈合过程，以此治疗骨不连。

骨不连的形成是一个复杂的连续过程，只有了解骨不连的机制和目前的研究现状，才能寻找有效的骨不连治疗方法，为攻克这一骨科学难题创造条件。

2.2 骨髓间充质干细胞

2.2.1 干细胞移植技术骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，近年研究发现骨髓间充质干细胞具有较强的多向分化潜能，在特定的诱导条件下其可分化为成骨细胞^[11]。

骨髓间充质干细胞又名骨髓基质干细胞，是来源于骨髓的单胚层多能干细胞，因其取材容易，能迅速体外培养和增殖，同时具有多向分化潜能，有望被用在细胞疗法治疗中。利用骨髓间充质干细胞移植治疗疾病是一个有广阔前景的研究领域，这些都归功于其特殊能力，包括自身增殖能力强、分化范围广，能够修复损伤的功能组织以及免疫调节等功能，不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题^[12]。从理论上说，目前已证实干细胞移植治疗疾病具有很多优势，应用该技术能治疗神经系统、免疫系统等多种系统的各种疾病，且较很多传统治疗方法具有无可比拟的优点：①安全：低毒性(或无毒性)。②在尚未完全了解疾病发病的确切机制前也可以应用。③治疗材料来源充足。④治疗范围广阔。⑤是最好的免疫治疗和基因治疗载体。

骨髓间充质干细胞的应用为骨不连的治疗提供了新的方向。临床试验也已明确骨折部位的干细胞浓度、总量与骨折处的骨痂量及成骨能力呈正相关，与骨折愈合时间呈负相关^[13]。

马力等^[14]研究不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的影响，得出结论：Percoll 密度梯度法分离的兔骨髓间充质干细胞，在细胞增殖、清除造血细胞干扰等方面明显优于全骨髓贴壁法分离的兔骨髓间充质干细胞；Mesen Cult、DMEM/F12、LG-DMEM 培养液均适用于兔骨髓间充质干细胞的培养；细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。

王佳南等^[15]通过大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养发现：大鼠骨髓间充质干细胞较佳接种密度为 5×10⁵ cm^-²，合适血清体积分数为10%，首次换液时间为48 h，pH值为7.2左右；在适宜的培养条件下，间充质干细胞在体外生长状态良好，增殖速度快。

2.2.2 骨髓间充质干细胞生物学特征骨髓间充质干细胞可以直接从自体骨髓腔抽吸或从松质骨获得，取材方便，创伤小，细胞处于未分化状态，增殖能力强，可在体外大量培养扩增^[16-17]。

骨髓间充质干细胞在实验室培养分化的过程中展示出具有以下生物学特征：①贴壁性：按一定密度接种骨髓间充质干细胞，细胞为贴壁生长。②自我更新能力：骨髓间充质干细胞在体内具有很强的自我更新能力。③快速形成克隆的能力：骨髓间充质干细胞可迅速增殖，10周内可增殖50倍，在适宜环境下可形成神经细胞、星形细胞、成骨细胞、软骨细胞等细胞克隆。④可塑性：即多向分化潜能。骨髓间充质干细胞一方面是造血诱导微环境的重要成员，另一方面在适当的条件可以分化成为中胚层的组织细胞，甚至可以跨越胚层，向外胚层以及内胚层来源的组织细胞方向分化，其中包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞和神经元样细胞等^[18]。在特定的诱导条件下，透明质酸可促进骨髓间充质干细胞向骨组织分化，分化为成骨细胞^[19]。⑤异质性：骨髓间充质干细胞在分化过程中，同时可分化为不同组织类型的细胞，而且细胞的生长速度是不同的；在不同的实验条件下，其分化的顺序也会有所不同。⑥可移植性。骨髓间充质干细胞的自我更新能力和可塑性，为组织工程学细胞移植治疗提供了准备条件。

2.3 骨髓间充质干细胞治疗骨不连骨不连时患者骨折断端成骨细胞数量较少且活性较低，因此，有必要局部补充具有成骨能力的种子细胞^[20]。将具有成骨能力的骨髓间充质干细胞移植到骨不连部位，通过动物实验及临床研究，观察局部应用骨髓间充质干细胞的疗效，总结并进一步发展该项技术。

2.3.1 体外动物实验早在1989年，Connolly等^[21]通过动物实验发现骨髓中的干细胞浓度与骨髓成骨能力存在正相关，说明骨髓间充质干细胞在骨折的愈合过程中起重要作用。

吴志玲等^[22]抽取兔骨髓制成细胞悬液，体外分离培养骨髓间充质干细胞2周后注射到家兔单侧桡骨缺损处，对侧不予处理，并取第4周末的骨痂进行组织学检查，结果显示骨髓间充质干细胞移植后实验侧骨痂形成快于对照侧，说明骨髓间充质干细胞移植注射可以促进骨缺损修复。

王东奎等^[23]通过影像与组织学对照分析实验验证了兔骨不连模型制作的可行性及科学性。2013年刘亚云等^[24]制作32例兔骨不连模型，开展了行经皮自体浓缩骨髓干细胞移植治疗骨不连的实验研究，得出结论：兔移植自体浓缩的骨髓干细胞参与了骨不连的成骨，有利于骨折的愈合，与自体骨移植效果相当。

2.3.2 临床治疗研究王五洲等^[25]研究冲击波联合骨髓间充质干细胞治疗骨不连得出结论：冲击波联合干细胞移植后平均骨折愈合时间较单纯冲击波治疗骨不连病程缩短了5.8周。王玉龙等^[26]通过研究11例胫骨骨不连患者，采用自体骨髓间充质干细胞，进行体外培养增殖后将其注射入胫骨骨不连部位，发现治疗有效。Cancedda等^[27]报道显示，自体骨髓移植可以用于治疗较大范围的骨不连、骨缺损。

Ma等^[28]采用大鼠胫骨骨不连模型研究冰冻骨髓对骨折愈合的影响，即采用动物自体骨髓，经分离、培养骨髓间充质干细胞后，再次注射入骨不连断端，8周后经影像学及组织工程学分析证实了自体骨髓间充质干细胞移植可以促进骨折愈合和骨修复。

Koob等^[29]报道了骨髓间充质干细胞复合上皮细胞治疗实验性巨大骨缺损取得了较好的效果。张远成等^[30]通过临床观察发现，自体浓缩骨髓间充质干细胞移植在治疗骨不连方面起到了积极作用，施术前肌注重组人粒细胞集落刺激因子，克服了骨髓干细胞数量不足的问题；而结合锁定钢板内固定解决了骨折端的稳定；合并骨缺损的患者适合采用复合人工骨植入技术。有研究证实骨不连部位仍存有骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞注射可增加局部骨髓间充质干细胞的浓度^[31]。

张传开等^[32]于2009至2011年收集3年内41例临床非感染性骨折骨不连患者，其中肱骨骨折6例，胫骨干骨折21例，尺桡骨骨折8例，股骨骨折6例。采集患者骨髓约10 mL，采用全骨髓法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。当骨髓间充质干细胞浓度达到2.4×10⁷ L^-¹，总数为9.6×10⁴个，无菌条件下行自体骨髓间充质干细胞移植术，即在X射线透视下将骨髓间充质干细胞注射到骨折断端处，并术后应用抗生素预防感染。随访9-24个月后临床效果较好，其中优25例，良9例，可5例，差2例，总优良率达79%。也有学者指出，为提高骨不连患者的治愈率，移植的骨髓间充质干细胞浓度应该> 10⁶ L^-¹，总数应该> 3×10⁴个。

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引言

材料方法

讨论

骨不连治疗方法繁多，归纳起来可分为两类，即开放治疗与闭合治疗。在目前的医疗条件下，公认骨不连的治疗仍首推植骨术，但供骨区的创伤，供骨取材受限，受区条件不佳以及爬行替代过程缓慢，使其在临床方面应用受到一定的制约。随着骨不连治疗观念的改变，在闭合治疗方面，也有较大进展。动物实验及临床研究均显示，自体骨髓间充质干细胞移植于骨折骨不连断端处，均可促进骨不连的愈合^[33]。通过以上总结研究，采用骨髓间充质干细胞移植术，诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞来修复骨不连、骨缺损具有一定临床效果，该方法给骨不连的治疗带来光明的前景。且自体骨髓来源广泛，无排斥反应，取材方便，操作简单，患者痛苦小，供骨区的并发症低，基本不受移植区软组织条件的限制，医疗费用较异体、异基因骨髓间充质干细胞移植术显著降低。该技术尤其适用于局部软组织条件差、不宜手术患者。因此，经皮自体骨髓间充质干细胞移植术治疗骨不连可以替代开放的植骨术或者是可以作为开放植骨术后出现骨折延迟愈合及不愈合时的补充治疗。干细胞研究领域的巨大进展预示着在其在治疗骨不连和骨折愈合最佳治疗策略方面具有巨大的潜力，但是骨髓间充质干细胞的培养、鉴定、冷冻及复苏等技术均要求较高的实验室条件^[34]。

虽然人们对骨髓间充质干细胞的研究和骨髓间充质干细胞应用修复骨缺损的研究取得了显著的成就，预示着在其在治疗骨不连方面具有巨大的潜力，但是骨髓间充质干细胞作为种子细胞的应用仍有一些问题困扰：骨髓间充质干细胞的增殖、分化、保存最佳条件难以准确确定；经皮移植自体骨髓间充质干细胞治疗四肢骨折骨不连对感染性骨不连患者无效；未能找到鉴定骨髓间充质干细胞特异性的标记分子，鉴定标准不够完善^[35]；由于没有细胞载体，单纯细胞植入体内后容易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度，因此其成骨能力有限，需要进一步的研究和发展。有关如何将骨组织工程、骨髓间充质干细胞基因治疗的方法与临床四肢骨折骨不连结合起来等问题也是目前急待解决的关键性医疗技术问题。此外，移植成功的前提条件如固定不牢固、创伤伤口感染、成骨障碍及复位不佳等因素，均作为解决导致骨不连的技术性和生物性的因素。

总之，骨不连的治疗比较复杂，单一治疗方案很难奏效，需要联合多种方法，同时正确指导患者行功能锻炼，适当配合物理治疗，如电刺激、低强度脉冲超声波、体外冲击波、磁热疗法、针灸等辅助疗法，多种因素联合刺激，重启骨折修复程序，加速损伤的愈合^[36]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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