小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (45): 7306-7311.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

胡三强¹，王妍妍²，马永宾²，胡嘉波²

¹连云港市妇幼保健院检验科，江苏省连云港市 222000；²江苏大学医学院，江苏省镇江市 212013

出版日期:2014-11-05 发布日期:2014-11-05
通讯作者: 胡嘉波，博士，教授，江苏大学医学院，江苏省镇江市 212013
作者简介:胡三强，男，1973年生，江苏省东海县人，汉族，2012年江苏大学毕业，硕士，主要从事干细胞方面的研究。
基金资助:
江苏大学高级人才专项资助(09JDG037)；国家自然科学基金资助项目(31071421)

Isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers

Hu San-qiang¹, Wang Yan-yan², Ma Yong-bin², Hu Jia-bo²

¹Department of Clinical Laboratory, Lianyungang Maternal and Child Health Hospital, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China; ²School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China

Online:2014-11-05 Published:2014-11-05
Contact: Hu Jia-bo, M.D., Professor, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China
About author:Hu San-qiang, Master, Department of Clinical Laboratory, Lianyungang Maternal and Child Health Hospital, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Senior Personnel Special Fund of Jiangsu University, No. 09JDG037; the National Natural Science Foundation of China, No. 31071421

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立一种既可以大量制备，又易于保存并保持较高活性的饲养层细胞是人胚胎干细胞培养研究的重要环节。

目的：建立昆明小鼠胚胎成纤维细胞的最佳分离培养方法，评价其用于人胚胎干细胞饲养层研究的可行性。

方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养昆明小鼠胚胎成纤维细胞，观察其生物学特性，制备胚胎成纤维细胞饲养层，检测人胚胎干细胞在饲养层上培养的生长状态。

结果与结论：制备昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.5 d。不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的胚胎成纤维细胞生长状态好，获得的成纤维细胞纯度高，增殖活跃。冻存2周，1，3，6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。小鼠胚胎成纤维细胞在第2-4代增殖旺盛，第5代以后细胞增殖活力明显下降。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞长期传代后呈典型的未分化形态，碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色均为阳性。结果表明建立的昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养法可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 人胚胎干细胞, 小鼠胚胎成纤维细胞, 饲养层, 国家自然科学基金

Abstract:

OBJECTIVE: To establish the optimal method for isolation and culture of Kunming mouse embryonic fibroblasts, and to evaluate the feasibility of preparing feeder layers for culture of human embryonic stem cells.

METHODS: Embryonic fibroblasts were isolated and cultured by different concentrations of trypsin from Kunming mouse fetuses in vitro. The biological characteristics and growth rule of mouse embryonic fibroblasts were investigated, and then the feeder layers for human embryonic stem cells culture were produced. The growth of human embryonic stem cells on the prepared feeder layer was tested.

RESULTS AND CONCLUSION: The optimal fetal age for preparing Kunming mouse embryonic fibroblast feeder layer was 13.5 days. Kunming mouse embryonic fibroblasts at different concentrations grew well with high purity and active proliferation by trypsin digestion method. There was no significant difference in the survival rate of cells after cryopreservation for 2 weeks, 1 month, 3 months and 6 months. The cells were proliferative from the second to fourth passage and declined sharply after the fifth passage. Human embryonic stem cells which grew on Kunming mouse embryonic fibroblasts feeder layers were still to remain the typical undifferentiated morphology and were strongly positive for alkaline phosphatase and periodic acid-Schiff after long-term subculture. The mouse embryonic fibroblasts can be used as the stable and high-quality feeder cells for human embryonic stem cells.

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Key words: embryonic stem cells, fibroblasts, trophoblasts

中图分类号:

R394.2

胡三强，王妍妍，马永宾，胡嘉波. 小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7306-7311.

Hu San-qiang, Wang Yan-yan, Ma Yong-bin, Hu Jia-bo. Isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7306-7311.

图/表（结果） 5

2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的生长特征和形态学观察原代小鼠胚胎成纤维细胞培养24 h后可见绝大部分贴壁细胞呈成纤维细胞样，细胞体积较小，杂细胞较少(图1A)，第1代细胞形态逐渐一致，细胞较为透明，细胞质内颗粒少，细胞轮廓清晰，细胞也逐渐增大。第3代细胞增殖速度较快，呈典型成纤维细胞形态特征(图1B，C)。第5代胞浆内颗粒明显增多，可观察到较明显的胞质空泡，细胞间空隙加大，呈现明显的老化状态(图1D)。

第3代细胞Giemsa染色后可以观察到呈成纤维细胞典型的梭形、不规则星形或多边形，胞浆颗粒较少，胞质均匀，中间可见卵圆形细胞核，核质疏松细致，胞核中可见多个核仁(图1E，F)。

2.2 复苏后的胚胎成纤维细胞存活率对冻存后2周、1，3，6个月的第1代小鼠胚胎成纤维细胞进行复苏，用锥虫蓝染色法测定细胞存活率。结果显示，第1代小鼠胚胎成纤维细胞在冻存后半年内复苏的细胞存活率稳定在一个恒定的水平，不同时间复苏的细胞存活率差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 生长曲线分析对第2，5代小鼠胚胎成纤维细胞生长曲线进行分析，结果表明第2代小鼠胚胎成纤维细胞增殖速率高于第5代，第8天就进入平台期，而第5代小鼠胚胎成纤维细胞第9天仍未进入平台期(图2)。

2.4 人胚胎干细胞在成纤维细胞饲养层上生长状况人胚胎干细胞接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层3，4 d后形成典型干细胞克隆，聚集生长呈鸟巢状，边缘与饲养层边界清晰(图3A)，Giemsa染色可见细胞排列紧密，细胞小，圆形，核质比高，胞浆几乎看不到，核内可见1-3个核仁(图3B，C)。

2.5 人胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和过碘酸-雪夫染色结果小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞克隆进行碱性磷酸酶染色检测，结果显示人胚胎干细胞克隆呈紫红色，碱性磷酸酶表达呈强阳性，而周围的饲养层细胞阴性(图4A)。过碘酸-雪夫染色显示，人胚胎干细胞克隆呈深紫红色的强阳性，饲养层呈阴性(图4B)。

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引言

胚胎干细胞是指来源于着床前囊胚期的内细胞团或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖细胞的一种多潜能细胞^[1-2]。1981年，Evans等^[1]利用实验中获得的延迟着床的囊胚并从中分离培养获得了增殖且未分化的小鼠囊胚内细胞团，培养于 STO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)饲养层上，首次分离得到胚胎干细胞。1998年，Thomson等^[3]从体外受精发育至囊胚阶段的人胚胎中分离获得内细胞团，将其接种于小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)饲养层上，经分离培养逐渐形成能长期稳定传代的人胚胎干细胞，首次成功建立了人胚胎干细胞系。胚胎干细胞是在体外无限增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞，这种特性使其在诱导分化、遗传病防治、器官移植等方面具有前景广阔的临床应用价值^[4-10]，同时在新基因的发现、新药开发、功能基因的组织学研究、致畸实验等方面也具有广泛的应用前景^[11-14]。选择最优化的细胞培养体系对于胚胎干细胞的研究及临床应用至关重要。饲养层对胚胎干细胞自我更新及全能性的维持起重要作用，目前其机制仍未完全阐明，很大程度上与饲养层所提供的细胞接触及复杂的蛋白分子环境有关。

小鼠胚胎成纤维细胞因其取材方便、易于制备和作用效果好等优点而成为胚胎干细胞培养首选的且最常用的饲养层细胞^[15]，本实验旨在探索昆明小鼠胚胎成纤维细胞分离培养和饲养层制备的最佳条件，为研究人胚胎干细胞提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞形态学观察实验。

时间及地点：实验于2010年7月至2012年5月在江苏大学医学研究所完成。

材料：

实验动物及人胚胎干细胞：性成熟雌、雄昆明小鼠(6-8周龄)由江苏大学动物实验中心提供。人胚胎干细胞(SHhES2)由上海交通大学医学院金颖博士馈赠。

主要试剂：胎牛血清、低糖DMEM、Knockout DMEM、Knockout SR、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰酶(美国 Invitrogen公司)；碱性磷酸酶(ALP)细胞化学染色试剂盒及过碘酸-雪夫(PAS)细胞化学染色试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)；β-巯基乙醇、明胶、Ⅳ型胶原酶(美国Sigma公司)；丝裂霉素C (Roche公司)；Giemsa染色液原液为本实验室自制。

L-谷氨酰胺+β-巯基乙醇的配制：称取0.073 g L-谷氨酰胺用PBS完全溶解至5 mL，再加入3.5 μL β-巯基乙醇混匀后用0.22 μm无菌小滤器过滤备用。

实验方法：

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞分离培养：①每天18:00-19:00时将雌、雄小鼠按3∶1比例合笼。第2天 8:00时分笼，并观察雌性小鼠有无阴栓，有阴栓确定为怀孕，记0.5 d，并分开单独饲养。②取孕13.5 d小鼠断颈处死，置于体积分数为75%乙醇消毒3 min。无菌打开孕鼠腹腔，可见腹腔两侧呈“V”字型串珠样子宫，用镊子提起子宫(不能碰到皮毛，以防污染)，并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织，剥离子宫。将子宫放入含有PBS的一次性无菌培养皿中，漂洗两三遍，去除淤血。③用眼科剪和镊子去除胎盘、羊膜等胚胎外组织，取出胚胎放入另一平皿，用PBS洗涤，直到没有血迹为止。④用眼科剪和镊子去除胚胎的头部、四肢及内脏，留取躯干部(注：头部、四肢及内脏需去除干净)，将躯干部放入玻璃平皿中，用PBS洗涤1次。⑤用眼科剪将胚胎躯干部剪碎成糊状，加入5 mL PBS混匀，移入离心管中，自然沉降3 min后将上清液轻轻吸出弃掉。⑥加入3 mL 0.063%胰酶轻轻吹打后室温下自然沉降2 min，将上清液轻轻吸出弃掉。⑦加入3 mL 0.125%胰酶轻轻吹打后室温下消化3 min，将上部的单细胞悬液轻轻吸出放入另一离心管中，加等量培养基终止消化，重复消化两次。若还有未消化的组织，再加入3 mL 0.25%胰酶轻轻吹打至完全消化，终止消化。⑧混匀离心管收集所有细胞悬液，自然沉降1 min，将大块沉淀吸出弃掉。800 r/min离心5 min，弃上清，体积分数为10%胎牛血清的DMEM重悬至5 mL。充入计数板计数，按5×10⁶/瓶接种到25 cm²培养瓶中，补足体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液，记为原代(P0)。37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，换液以去除未贴壁细胞及细胞碎片。细胞融合至80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按 1∶3-1∶4 比例传代培养，记为第1代。

小鼠胚胎成纤维细胞冻存、复苏及存活率测定：取生长状态良好，且融合率为80%-90%小鼠胚胎成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，800 r/min离心5 min，弃上清。加入预冷的冻存液重悬，移入冻存管，封口膜封口，并做好标记。置4 ℃ 30 min，-20 ℃ 2 h，-80 ℃保存备用。在细胞冻存后2周，1，3，6个月每次取3管冻存的原代小鼠胚胎成纤维细胞进行复苏。将冻存管迅速从-80 ℃超低温冰箱中取出，置于37 ℃水浴，使其迅速融化，逐滴加入小鼠胚胎成纤维细胞培养液至10 mL，洗涤1次，培养液重悬，取少量细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混匀，在 3 min内用血细胞计数板在显微镜下分别计数200个细胞，存活率=拒染细胞数/200×100%，每管计数2次，取均值。其余细胞接种到培养瓶中，体积分数为5% CO₂、37 ℃、饱和湿度条件下继续培养。

Giemsa染色：取融合率为50%-60%的小鼠胚胎成纤维细胞，弃培养液，用PBS洗涤2次，自然晾干。用甲醇固定5 min，弃甲醇，自然晾干。加新配的Giemsa染液(10% Giemsa原液+90%pH6.8的PBS)染色25 min，连同染色液直接在流水下轻轻冲洗干净(不可先弃染液再冲洗，以免留下染色液残渣)。自然晾干后镜检拍照。人胚胎干细胞染色10-15 min即可，时间不可过长，否则人胚胎干细胞染色过深形态不易辨认，必要时可在染色过程中用倒置显微镜观察以便确定染色时间。

小鼠胚胎成纤维细胞生长曲线：取融合率为80%-90%的第1代和第4代细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，含体积分数为10%胎牛血清的DMEM重悬，1×10⁴个/孔接种于24孔板，次日计数，每天计数6孔，每3 d换液1次，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标作图绘制标准曲线。

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备：人胚胎干细胞传代前1 d制备饲养层细胞。①0.1%明胶水溶液加入培养瓶，覆盖培养瓶底部包被培养瓶，置37 ℃培养箱孵育2 h后备用。②取细胞融合率约90%的第2-4代小鼠胚胎成纤维细胞，弃原培养液，将2 mL含10 mg/L丝裂霉素C及体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液加入培养瓶，置37 ℃培养 2 h。③弃丝裂霉素C，用PBS洗5次，每次2 min(动作要轻柔，以免细胞层脱落，必要时可在镜下观察细胞层有无脱落)。④加入0.25%胰酶2 mL消化，加入等体积的含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞脱壁。⑤收集消化细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM重悬，用血细胞计数板计数。⑥取出经明胶包被培养瓶，弃去明胶水溶液，以5.0×10⁵个/瓶接种细胞，含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养，备用。使用前需换用胚胎干细胞培养液。

细胞化学染色：传代第3天人胚胎干细胞，按照碱性磷酸酶(ALP)细胞化学染色试剂盒及过碘酸-雪夫(PAS)细胞化学染色试剂盒说明书进行细胞化学染色(不用苏木精复染)，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

主要观察指标： ①小鼠胚胎成纤维细胞形态。②复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞存活率。③小鼠胚胎成纤维细胞生长曲线。④饲养层上的人胚胎干细胞形态。⑤人胚胎干细胞碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色结果。

统计学分析：采用SPSS 18.0统计软件进行。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

体外培养干细胞的基本原则是在促进干细胞永久性分裂增殖的同时，维持其未分化的状态，前者是对数量上的要求，后者是对其功能的保证。为满足这两个条件，选择合适的培养体系是关键, 这涉及了饲养层、基本培养基、血清及其他培养添加物等诸多因素的作用，其中饲养层质量的优劣是影响干细胞生长的重要因素^[16-19]。有学者尝试使用各种饲养层细胞并对其生物学特性以及对干细胞生长的支持作用进行深入探索^[20-28]。在各种饲养层中，小鼠胚胎成纤维细胞因其取材方便、易于制备而成为干细胞培养首选且最常用的饲养层细胞^[15]，其促增殖作用主要是能分泌促有丝分裂因子、细胞分化抑制因子(如LIF)等，但其确切机制目前尚未完全明确。小鼠胎龄的选择是分离高质量小鼠胚胎成纤维细胞的影响因素之一^[16]。本实验显示，小于12.5 d胎鼠胚胎很小，刚能分清头、体、尾且太柔嫩，很难将胎鼠的头、尾、四肢及内脏完全去除，所获得的小鼠胚胎成纤维细胞中杂细胞多，且极易消化过度，从而影响了小鼠胚胎成纤维细胞的质量。而大于15.5 d胎鼠，虽然细胞纯度较高，但成纤维细胞数量明显减少，体积较大，颗粒多，生长缓慢。而选用13.5 d的胎鼠，分离出的小鼠胚胎成纤维细胞贴壁快，生长迅速，无论是所获细胞的纯度和数量，都表现出明显的优势。

分离培养小鼠胚胎成纤维细胞的主要方法有胰蛋白酶消化法和组织块贴壁培养法，组织块培养得到的细胞较纯，但数量较少，且细胞增殖缓慢，培养周期长，不利于胚胎干细胞的长期传代^[29-30]。胰蛋白酶消化法简单方便，但胰蛋白酶浓度过高、消化时间过长易对细胞造成损伤，导致细胞颗粒多，状态差^[16]，并且在制备培养过程中，死细胞和杂细胞(非成纤维细胞)较多。因此胰蛋白酶的浓度和消化时间特别重要，本研究在胰蛋白酶分步消化法的基础上作了部分改进^[15]，在组织剪碎后先用PBS重悬，自然沉降后先弃上层的单细胞悬液，然后用低浓度的胰蛋白酶短时间消化后再弃上层的单细胞悬液，这样就可以去除在剪的过程中损伤的细胞以及胎鼠皮肤和其他组织的上皮细胞，虽然损失了部分细胞，但可以提高成纤维细胞的纯度。此外，本研究采用0.125%胰蛋白酶分步消化法，将消化下来的单细胞及时移出从而减少了胰蛋白酶对细胞的持续损伤。通过以上方法制备的小鼠胚胎成纤维细胞与常规的胰蛋白酶消化法相比死细胞和杂细胞少，在第1代即可得到较纯化的小鼠胚胎成纤维细胞，且细胞增殖速度较快，是一种理想的分离小鼠胚胎成纤维细胞方法。对冻存半年内不同时间复苏的小鼠胚胎成纤维细胞进行存活率测定，发现其活性维持在较高水平，表明小鼠胚胎成纤维细胞适合一次大批量制备冻存后长期使用，以满足人胚胎干细胞培养需要。

实验结果表明，第5代之前小鼠胚胎成纤维细胞生长状态好，随后出现衰老现象，又由于原代含有少许杂细胞，所以一般选择第1-4代细胞作为饲养层。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上可以稳定地传代并保持未分化状态。同时，传代后的人胚胎干细胞仍呈碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫染色强阳性，与先前报道的结果一致^[31]。碱性磷酸酶阳性是人胚胎干细胞的特性之一，但过碘酸-雪夫阳性是否也是人胚胎干细胞的特性之一以及其他的胚胎干细胞是否也是过碘酸-雪夫染色阳性还有待进一步验证。

综上所述，实验制备的小鼠胚胎成纤维细胞死细胞少，在第1代即可得到较纯化的小鼠胚胎成纤维细胞，且细胞增殖速度较快。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上可以稳定地传代并保持未分化状态。

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