同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项研究表明，骨髓间充质干细胞移植可在梗死心肌存活，改善心功能。
目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死后心力衰竭的效果。
方法：经Percoll密度梯度离心培养大鼠骨髓间充质干细胞，将39只雌性Wistar大鼠采用结扎左前降支的方法复制急性心肌梗死模型，随机分为DMEM对照组(n=12)、骨髓间充质干细胞治疗组(n=15)和骨髓单个核细胞治疗组(n=12)。8周后行血流动力学、组织病理学及免疫组化等检测。
结果与结论：两个治疗组左室舒张末压显著降低，左室内压最大上升和下降速率、左室内压最大下降速率与左室收缩压的比值显著升高；术后体质量显著增加，左室相对质量显著减轻；梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数显著降低；梗死区血管数目显著增加。两个治疗组之间比较，除骨髓单个核细胞治疗组室间隔厚度减小、梗死边缘区血管数目增加外，其余指标差异均无显著性意义。免疫组化示骨髓间充质干细胞治疗组梗死区内有BrdU阳性细胞，而在骨髓单个核细胞治疗组梗死区内则基本没有BrdU阳性细胞；两个治疗组在心肌梗死区可见较多desmin阳性和cTnT阳性细胞或细胞团存在。结果提示骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞均能促进梗死区血管新生，降低局部胶原沉积，改善心肌梗死后心室重构，显著改善心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 心肌梗死, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 骨髓单个核细胞, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: A number of studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells can survive in the infarcted myocardium and improve cardiac function.
OBJECTIVE: To investigate the effects of allogeneic rat bone marrow mesenchymal stem cells on heart failure in acute myocardial infarction models of rats and possible mechanisms.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the bone marrow of 39 male Wistar rats by density gradient centrifugation with Percoll. After ligating anterior descending coronary artery, 39 female Wistar rats were randomly divided into three groups: control group (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, n=12), mesenchyma stem cells group (n=15) and mononuclear cells group (n=12). Eight weeks later, hemodynamics and left ventricular function were measured. Histopathological and immunohistochemical examinations were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, left ventricular end diastolic pressure, left ventricular relative weight, the collagen volume fraction of type I and type III in the infarction zone of the left ventricle were all significantly decreased, in contrast to ±dp/dtmax, -dp/dtmax/left ventricular systolic pressure, body weight and vascular density in infarction zone were all significantly increased both in mesenchymal stem cells group and mononuclear cells group. There were no significant differences between two treatment groups except for interventricular septal thickness and vascular density in non-infarction zone. 5-Bromo-2'-deoxyuridine positive cells were observed in the infarction area of mesenchyma stem cells group but no positive cells in mononuclear cells group. Some ball-like cell masses were found positively stained with desmin and cardiac troponin T. Results have suggested that embedded bone marrow mesenchymal stem cells survived in exogenous host hearts. The therapy of mononuclear cells and mesenchymal stem cells could limit the left ventricular remodeling after acute myocardial infarction and improve left ventricular function through angiogenesis inducing and collagen deposition decreasing.

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Key words: stem cells, bone marrow, stem cell transplantation, myocardial infarction

中图分类号:

R394.2

梁丽玲，杨庭树，李萍，冯斌，韩宝石. 同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5983-5987.

Liang Li-ling, Yang Ting-shu, Li Ping, Feng Bin, Han Bao-shi . Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for acute myocardial infarction in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5983-5987.

图/表（结果） 2

2.1 各组血流动力学指标 与对照组相比，两个治疗组左室舒张末压显著降低，两个治疗组间比较无明显差异(表1)。

2.2 左室重构指标 与对照组相比，两个治疗组左、右室实际质量、右室相对质量、左室球形指数以及扩张指数均无显著差异；两个治疗组术后体质量显著增加，左室相对质量显著减轻；而与骨髓间充质干细胞治疗组相比较，骨髓单个核细胞治疗组室间隔厚度显著减小。两个治疗组之间的其余指标无显著差异(表2)。

2.3 左室功能指标 与对照组相比，两个治疗组左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_max)和左室内压最大下降速率(-dp/dt_max)与左室收缩压的比值均显著升高，而左室内压最大上升速率(+dp/dt_max)与左室收缩压的比值均无明显差异。两个治疗组间比较差异无显著性意义(表1)。

2.4 左室间质胶原容积分数的改变 与对照组相比，两个治疗组梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数均显著降低；骨髓间充质干细胞治疗组非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数显著降低。两个治疗组间比较差异无显著性意义(表2和图1)。

2.5 各组梗死区新生毛细血管情况 与对照组相比，骨髓间充质干细胞治疗组和骨髓单个核细胞治疗组梗死区血管数目均显著增加[(11.1±0.4)根/HP，(10.1±0.4)根/HP，(4.2±1.1)根/HP，P < 0.01](图2)，而梗死边缘区血管数目差异均无显著性意义[骨髓间充质干细胞治疗组为(11.8±0.6)根/HP，骨髓单个核细胞治疗组为(11.7±0.5) 根/HP，对照组为(11.5±0.6)根/HP，P > 0.05]。

2.6 移植细胞在心肌内存活并向心肌细胞分化的鉴定 鼠抗BrdU单克隆抗体检测显示，骨髓间充质干细胞治疗组心肌梗死区内可见BrdU阳性细胞，正常心肌组织则没有，而且在梗死区的血管壁发现有BrdU阳性细胞(图3A)，而在骨髓单个核细胞治疗组心肌梗死区内则基本没有BrdU阳性细胞(图3B)。

对照组动物的心肌梗死区域内未发现有desmin阳性和cTnT阳性细胞，表明无存活心肌，无平滑肌细胞及心肌细胞新生(图4A)。骨髓间充质干细胞治疗组和骨髓单个核细胞治疗组在心肌梗死区可见较多阳性细胞或细胞团存在，有的细胞外形和正常心肌没有区别，可见明显的横纹，有的心肌细胞横纹显示不十分清楚，无法确定这些阳性细胞是梗死后的残存心肌，还是新生的平滑肌细胞及心肌细胞(图4B)。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机分组设计，对照动物实验。

时间及地点：实验于2008年7月至2010年7月在解放军总医院实验动物中心完成。

材料：选取两三个月龄雌性Wistar大鼠39只，体质量(284±6) g，由解放军总医院实验动物中心提供。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离与培养：大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，用肝素PBS混合液冲出骨髓腔中的骨髓，经Percoll密度梯度离心法分离培养并传代培养。第5代骨髓间充质干细胞进行移植。

心肌梗死动物模型的建立：按照Pfeffer等报道的方法略加改进复制大鼠急性前壁心肌梗死模型。用1%戊巴比妥钠40-50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，经口气管插管呼吸机辅助呼吸。常规消毒铺单，距胸骨左侧约0.5 cm处沿3、4肋间作纵形切口进胸，暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部2.0-3.0 mm处，以左心耳的下缘为标记，结扎左冠状动脉前降支，观察结扎区域变白，局部心肌运动减弱，两个以上肢体导联或胸导出现ST段抬高 0.2 mV以上提示结扎成功。

细胞移植：在梗死心肌组织及其边缘，分5个点用特制注射器将细胞悬液注入心肌组织，缓慢推注，以防悬液外流，注射完毕后关闭胸腔，缝合肌肉和皮肤。39只Wistar大鼠随机分为3组：①DMEM对照组(n=12)：大鼠心肌梗死后30 min注射100 μL DMEM培养基。②骨髓间充质干细胞治疗组(n=15)：于心肌梗死后30 min接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(100 μL，含5×10⁶骨髓间充质干细胞)。③骨髓单个核细胞治疗组(n=12)：于心肌梗死后 30 min接受同种异体骨髓单个核细胞移植治疗(100 μL，含5×10⁷骨髓单个核细胞)。其中两个治疗组各3只动物的移植细胞预先用BrdU给予标记。

指标检测：于细胞移植8周后进行。结扎右颈动脉远心端，近心端插入充满肝素生理盐水的PE-50导管，记录主动脉及左心室压力曲线，并测量主动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、左室收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)及左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_max)，将左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_max)与左室收缩压的比值作为校正值。

然后处死动物，开胸取出心脏，用PBS冲洗修剪后用电子天平(精确到0.1 mg)分别称取左、右心室实际质量(LVAW、RVAW)，将其与体质量相比，得到左、右心室的相对质量(LVRW、RVRW)。直接测量左心室长轴长(二尖瓣环至心尖)。

在心脏长轴中点处垂直于长轴将左室一分为二，心尖瓣石蜡包埋，3 μm厚切片常规苏木精-伊红染色，观察心肌组织的梗死情况、有无炎症反应和血管瘤形成等其他不良反应出现。

上述3 μm厚截面标本行Masson三色染色制成病理切片，用OLYMPUS IX71自动显微照相系统及微机图像分析系统测定左心腔面积、左心室截面面积(包括左心腔面积)、截面最长径(D_max)和最短径(D_min)、瘢痕弧长以及心内膜和心外膜周长，分别计算心肌梗死面积、左室球形指数和扩张指数，公式如下：

梗死面积=瘢痕弧长/[(外周长+内周长)/2]×100%

左心室球形指数=左心室长轴长/左心室短轴长

(截面直径即短轴长，D= )

左室扩张指数=左心腔面积/左心室截面面积

取心肌组织3 µm石蜡切片，用天狼猩红饱和苦味酸液染色20 min，Harris苏木精液淡染细胞核。偏振光显微镜下Ⅰ型胶原纤维呈红色或黄色，排列紧密，具强双折光性；Ⅲ型胶原纤维呈绿色，细纤维，弱双折光性。于左室梗死区和非梗死区室间隔非血管区随机选择8个视野(×200)，用上述照相-分析系统检测Ⅰ、Ⅲ型胶原面密度代表其胶原容积分数(CVF)。

取梗死区及其边缘心肌组织，切片，分别以鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体、鼠抗BrdU单克隆抗体以及抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体和鼠抗结蛋白(desmin)单克隆抗体作为第一抗体，按SP法常规操作进行免疫组织化学鉴定，分别检测梗死区和梗死边缘区血管密度、观察BrdU标记的细胞能否在心肌组织存活以及梗死区有无平滑肌细胞和心肌细胞新生。

其中BrdU免疫组化染色阳性部位为细胞核。Ⅷ因子染色每张切片在梗死区和梗死边缘区分别随机选择5个视野，在高倍镜下计数血管数目，其平均数代表每个高倍视野的血管数目。

统计学分析：数据由第一作者采用SPSS 10.0软件进行分析。测量数据以x(_)±s表示，各组间比较采用单因素方差分析和秩和检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

细胞性心肌成形术是目前冠心病和心力衰竭治疗、研究的热点，为终末期心脏病患者的治疗带来了新的希望^[1-3]。骨髓干细胞临床上取材简便，易于从自体采集，避免了胚胎干细胞所面临的伦理学纠纷，自体移植不存在免疫排斥反应，而且由其分化来的心肌细胞能与周围细胞形成有效的电-机械耦联^[4]，弥补了骨骼肌干细胞的不足，因此骨髓干细胞是目前比较有优势的移植细胞来源。

本实验采用BrdU进行标记，采用免疫组化技术检测到骨髓间充质干细胞治疗组心肌梗死区内有BrdU阳性细胞，正常心肌组织则没有，而且在梗死区的血管壁发现有BrdU阳性细胞，表明移植的干细胞参与了梗死区的血管新生，而在骨髓单个核细胞治疗组心肌梗死区内则基本没有BrdU阳性细胞。但是，至于这些细胞是否是骨髓间充质干细胞分化的有功能的心肌细胞，由于受抗体来源以及实验条件的限制，没有对BrdU阳性细胞进行双重检测分析，因此，这种转化是否确切存在，以及转化的细胞是否可以和正常心肌细胞形成缝隙连接仍有待进一步证实。

本实验大鼠心功能通过测定左室收缩压和左室舒张末压以及计算左室内压最大上升/下降速率和其校正值来判断。结果显示，与对照组相比，骨髓间充质干细胞治疗组和骨髓单个核细胞治疗组左室舒张末压均显著降低，左室内压最大上升/下降速率和左室内压最大上升/下降速率与左室舒张末压的比值均显著升高，而两个治疗组间比较无明显差异。骨髓间充质干细胞和骨髓单个核细胞治疗均能改善心脏功能，而且不但对心脏收缩功能有益，对心脏舒张功能也有益。此外，左室重构指标、胶原容积分数以及血管密度检测显示，与对照组相比，骨髓间充质干细胞治疗组和骨髓单个核细胞治疗组左室相对质量显著减轻，梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数显著降低，梗死区血管数目显著增加，但两个治疗组之间无显著差异。

综上分析，骨髓间充质干细胞和骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死均有效，可能通过不同的机制综合改善心脏的收缩及舒张功能，包括：①骨髓干细胞梗死心肌移植的心肌再生作用。在本研究中，骨髓单个核细胞治疗组未观察到BrdU阳性的细胞，骨髓单个核细胞治疗组和骨髓间充质干细胞治疗组之间的这种差异，可能与移植细胞的组分以及数量有关，但有理由相信，即使骨髓单个核细胞移植细胞数量达到相当大的程度，即使能在心肌梗死区域检测到移植细胞存活，其数量也必定极为有限。因此，移植干细胞在梗死心肌的再生并不是其改善心功能的主要原因。②骨髓干细胞移植对血管再生的影响：生理条件下，成熟器官的血管内皮细胞处于静止的非增殖状态，很少发生血管再生。任何刺激血管壁的内皮细胞的增殖和迁移的因子都能促进血管形成的进行。已知多种生长因子能促进血管形成^[5-6]。本实验应用大鼠急性心肌梗死模型，将骨髓干细胞植入梗死心肌区域，通过Ⅷ因子免疫组织化学方法检测血管密度，结果表明两个细胞移植组梗死区血管密度均明显高于对照组。骨髓干细胞在大鼠急性心肌梗死模型中能有效地促进血管形成，可能机制是缺血环境使骨髓干细胞中的内皮祖细胞分化为内皮细胞，以及骨髓细胞分泌某些细胞因子。另外，在BrdU免疫组化染色中，发现某些血管内皮细胞BrdU阳性，因此，骨髓间充质干细胞也可能直接向血管内皮细胞分化，参与血管新生。③骨髓干细胞梗死心肌移植对细胞因子分泌的影响：心脏间质细胞不仅是心脏的支持细胞，且具有自分泌和旁分泌功能，分泌生物活性物质影响自身和邻近的心肌细胞的结构和功能。另外，骨髓单个核细胞本身含有大量的幼稚白细胞和淋巴细胞等，局部注射后会加重缺血区域的炎症反应，释放大量细胞因子。也有许多学者认为，这可能是骨髓单个核细胞移植改善心功能的主要原因，而并非骨髓单个核细胞分化引起心肌再生的作用。④骨髓干细胞梗死心肌移植对心肌基本结构的保护作用：胶原纤维作为一种组织结构蛋白，在心肌内组成胶原网，将心肌细胞相互连接成一体，直接影响它们的收缩和舒张以及在完整组织中的形态，对心脏的功能有重要的影响。本实验结果表明，两个治疗组心肌梗死区内细胞呈现有序排列，而对照组结构紊乱，两者形成对比。Masson三色染色显示移植组胶原纤维融合较少，排列有序，而对照组胶原纤维融合明显，排列较紊乱，心肌组织的基本结构受到彻底破坏。胶原容积分数测定显示两个治疗组梗死区的Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积均明显减少。表明骨髓干细胞移植可防止胶原纤维的融合，保护心肌组织的基本结构有序排列。

总之，同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死，移植细胞可以在心肌梗死区域存活，可以促进梗死区血管新生，降低局部胶原沉积，改善心肌梗死后心室重构，显著改善心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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