温敏性壳聚糖止血膜的止血作用及体内降解吸收

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：尽管温敏性壳聚糖是壳聚糖的一种，但其止血效果、组织相容性及体内代谢吸收情况还需要验证。

目的：探讨温敏性壳聚糖止血膜的止血作用、体内降解和组织相容性。

方法：取SD大鼠48只，随机均分为4组，同时进行两种实验：①制作肝脏创面出血模型，其中3组分别采用温敏性壳聚糖止血膜、纤维素止血棉和明胶海绵止血材料贴敷大鼠肝创面止血，以不做任何处理的为空白对照。记录出血时间及出血量。②在上述3组大鼠的股四头肌内分别再植入对应的止血材料，空白对照组不植入任何材料。术后1，2，3，4，6周取两处创面行大体观察，术后4周行苏木精-伊红染色和电镜观察。

结果与结论：温敏性壳聚糖组、纤维素组止血时间和出血量少于空白对照组、明胶海绵组(P < 0.05)。温敏性壳聚糖止血膜于术后6周完全降解，纤维素止血棉于术后3周完全降解，明胶海绵于术后2周完全降解。温敏性壳聚糖组肝小叶结构完整，肝细胞结构基本正常，肿胀轻，炎症细胞浸润程度轻，电镜显示整个肝细胞外形结构清楚，细胞核无破损，细胞器良好；肌肉纤维结构完整，炎症细胞浸润程度轻，电镜显示肌纤维走向整齐，肌细胞核形态正常，细胞器良好。可见温敏性壳聚糖止血膜具有较好的止血作用和组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 温敏性壳聚糖, 药物控释材料, 纤维素, 明胶海绵, 降解, 组织相容性

Abstract:

BACKGROUND: The thermosensitive chitosan is a kind of chitosan, its hemostatic effect, tissue compatibility and in vivo absorption need further investigations.

OBJECTIVE: To investigate the hemostasis, in vivo degradation and tissue compatibility of thermosensitive chitosan hemostatic film.

METHODS: A total of 48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups, and carried out two experiments at the same time. (1) The incisions of the liver in three groups were covered with the thermosensitive chitosan hemostatic film, cellulose hemostatic cotton and gelatin sponge, respectively. Blank control group received no treatment. The bleeding time and bleeding amount were recorded. (2) The incisions of the quadriceps femoris muscle of rats in the above three groups were embedded with the same hemostatic materials respectively. Blank control group was not embedded. At 1, 2, 3, 4, 6 weeks, the incision tissues of the liver and the quadriceps femoris muscle were harvested for observation. After 4 weeks, the incisions were observed with hematoxylin- eosin staining and transmission electron microscopy.

RESULTS AND CONCLUSION: The bleeding time and bleeding amount of thermosensitive chitosan hemostatic film and cellulose hemostatic cotton groups were significantly lower than those of gelatin sponge and blank control groups (P < 0.05). After 6 weeks, the thermosensitive chitosan hemostatic film was absorbed completely. After 3 weeks, the cellulose hemostatic cotton was absorbed completely. After 2 weeks, the gelatin sponge was absorbed completely. The liver lobules of thermosensitive chitosan hemostatic film were complete, the liver cell were normal structure, showing light swelling and little inflammatory cell infiltration. Under transmission electron microscopy, the liver cells had integral structure, cell nucleus and organelles remained intact. The muscle fibers showed complete structure and little inflammatory cell infiltration. Under transmission electron microscopy, the muscle fibers ranked tidily, with integral cell nucleus and organelles. The thermosensitive chitosan hemostatic film has good hemostasis effect and tissue compatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: chitosan, cellulose, gelatin sponge, degradation

中图分类号:

R318

尹刚，陈汇浩，郭兴锋，魏长征，侯春林. 温敏性壳聚糖止血膜的止血作用及体内降解吸收[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(34): 5461-5465.

Yin Gang, Chen Hui-hao, Guo Xing-feng, Wei Chang-zheng, Hou Chun-lin. Hemostasis and in vivo degradation of thermosensitive chitosan hemostatic film[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(34): 5461-5465.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠均进入结果分析。

2.2 各组大体观察

肝创面止血实验：①温敏性壳聚糖止血膜能快速聚集血液，形成一层凝胶保护膜，快速止血。术后1-6周，腹腔内的肝脏、小肠及大肠周围粘连轻，缺损的肝创面生长良好。②纤维素止血较快，但纤维素止血绵结构松散，吸附血液能力较温敏性壳聚糖止血膜弱，出血较多。术后1-6周，腹腔有一定的粘连，肝脏与周围肠道粘连一起，但较容易分开，肝创面愈合良好，无明显炎性反应。③明胶海绵止血效果较差，出血量较多。术后1-6周，腹腔内粘连较严重，肝脏与肠道组织粘连一起，并且较难分开，肝创面愈合良好，无明显炎症反应。④空白对照组4 min后创面血液继续流出，创面不能止血。术后1-6周，腹腔粘连较重，肝创面愈合良好。

股四头肌实验：①术后1-6周，温敏性壳聚糖组股四头肌粘连轻，原切口周围无明显粘连，肌肉间隙少瘢痕形成，较容易分离，肌肉组织愈合良好。②术后1-6周，纤维素组股四头肌有一定的粘连，肌肉间隙粘连，不易分开，股四头肌创面愈合良好，无明显炎性反应。③术后1-6周，明胶海绵组股四头肌内粘连较严重，较难分开，股四头肌创面愈合良好，无明显炎症反应。④术后1-6周，空白对照组股四头肌内粘连较严重，较难分开。

2.3 各组出血时间及出血量测定 通过统计软件分析，温敏性壳聚糖组、纤维素组、明胶海绵组止血时间和出血量均显著低于空白对照组(P < 0.05)。温敏性壳聚糖组、纤维素组出血量和出血时间显著少于明胶海绵组(P < 0.05)，温敏性壳聚糖组、纤维素组组间出血量和出血时间比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 各组止血材料代谢及组织形态学观察

止血材料代谢观察：①肝创面：温敏性壳聚糖止血膜2周时少量吸收，4周时大部分吸收，6周后基本吸收，未见明显的残留；纤维素止血棉2周时少量残留，3周后基本降解吸收；2周时明胶海绵基本降解吸收。②股四头肌：温敏性壳聚糖止血膜2周时少量吸收，4周时大部分吸收，6周后基本吸收；2周时纤维素棉少量残留，3周时基本降解吸收；2周时明胶海绵基本降解吸收，无明显残留。

苏木精-伊红染色光镜观察：①肝组织：温敏性壳聚糖组肝小叶结构完整，肝细胞结构基本正常，肿胀轻，变性坏死少，炎症细胞浸润程度轻(图1A)；纤维素组肝小叶基本完整，肝细胞肿胀情况轻，变性坏死的肝细胞稍多，炎症细胞浸润程度重(图1B)；明胶海绵组肝小叶基本完整，肝细胞肿胀情况轻，变性坏死的肝细胞多，炎症细胞浸润程度重(图1C)；空白对照组基本正常肝组织结构(图1D)。②股四头肌：温敏性壳聚糖组肌肉纤维结构完整，变性坏死的肝细胞少，炎症细胞浸润程度轻(图2A)；纤维素组肌细胞结构基本完整，炎性细胞少量浸润(图2B)；明胶海绵组肌细胞结构基本完整，炎性细胞较多(图2C)；空白对照基本正常肌肉组织结构(图2D)，见表1。

透射电镜观察：①肝组织：温敏性壳聚糖组整个肝细胞外形结构清楚，细胞核无破损，细胞核内物质分布均匀，细胞质内线粒体、高尔基体丰富，糖原含量较多(图3A)；纤维素组肝细胞肿胀不明显，大体外形结构清楚，细胞核无破损，细胞核内物质分布均匀，细胞质内线粒体、高尔基体丰富，糖原含量较多，滑面内质网增生，扩张不明显(图3B)；明胶海绵组肝细胞肿胀，大体结构紊乱，细胞核不规则或破损，细胞核内的物质分布不均匀，细胞内的线粒体分布少及糖原较少，滑面内质网增生严重，扩张明显(图3C)；空白对照组基本正常肝组织结构(图3D)。②股四头肌：温敏性壳聚糖组肌细胞内纤维走向整齐，肌细胞核形态正常，肌细胞核内物质分布均匀，高尔基体丰富，糖原含量较多(图4A)；纤维素组肌细胞内纤维走向整齐，细胞核形态基本正常，肌细胞核内物质分布均匀，高尔基体较多，糖原含量较多(图4B)；明胶海绵组肌细胞内纤维走向稍紊乱，细胞核破损，不规则，肌细胞核内物质分布不均匀，内质网少，糖原含量较少(图4C)；空白对照组基本正常肌肉组织结构(图4D)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年3至12月在解放军第二军医大学动物实验中心完成。

材料：

实验动物与分组：成年健康SD大鼠48只，体质量190-210 g，雌雄不拘，购自解放军第二军医大学动物实验中心，许可证号：SCXK(沪)2007-0003。将48只大鼠随机分成4组，每组12只，每只大鼠分别建立肝创面出血模型及股四头肌材料代谢模型。

实验方法：

肝创面动物模型的建立：采用腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠。将麻醉好的大鼠固定于解剖台上，常规消毒，沿腹中线剪开皮肤，腹肌，进入腹腔，显露肝中叶，用无菌纱布将肝中叶周围的腹腔液吸干，在暴露的肝中叶远端，用手术刀片切取一长1 cm的肝断面切口，立即擦去血液，其中3组分别将相同大小(2.0 cm×1.0 cm× 0.5 cm)的温敏性壳聚糖止血膜、纤维素止血棉与明胶海绵止血材料覆盖到肝脏切口上。然后每隔30 s大体观察切口出血情况，直至出血停止。空白对照组不作止血处理。记录每组的止血时间和出血量，出血量为覆盖创面无菌纱布前后重量差^[9]，出血完全停止后，缝合切口，饲养。

股四头肌动物模型：在缝合大鼠肝创面模型后，于上述的肝创面模型大鼠大腿内侧消毒，沿大腿内侧切一纵行切口，锐性分离股四头肌，深度达0.5 cm，再将相同大小(0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm)与肝创面对应的止血材料填埋于股四头肌内，缝合股四头肌，并标记，缝合切口，饲养大鼠。空白对照组不埋置材料。

止血材料代谢及组织形态学实验：术后1，2，3，4，6周，每次每组取2只大鼠，以腹腔过量注射3%戊巴比妥钠致死，沿原切口打开腹腔及股四头肌，观察肝创面及股四头肌切口的愈合情况、局部反应及材料代谢吸收情况。术后4周时取肝创面及肌肉组织标本用戊二醛固定，用乙醇梯度依次脱水，石蜡固定，切片，厚度为1 μm，切取15个切片，每3个备用苏木精-伊红染色，共取5个切片进行分析，以确定炎性细胞的情况。用400×的放大倍率下随机选择4个大格，计算每个大格里的炎性细胞数，取这些区域内的炎性细胞的平均数，公式为：炎性细胞数=四大格炎性细胞总数/4，分别记录。

术后4周时，取上述肝创面组织及股四头肌创面肌肉组织，用戊二醛固定，通过固定、干燥、样品装台，通过透射电子显微镜观察肝组织细胞及肌肉组织细胞的微观情况。

主要观察指标：各组组织学观察结果。

统计学分析：通过SPSS 18.0软件将实验数据进行统计学分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

医用生物材料指的是具备医学作用、可作用于机体特殊功用，在临床被广泛应用于各类组织器官，提高疾病诊断，有利于疾病治疗，对机体组织器官不会产生有害作用的一类生物材料^[10-12]。而生物止血材料也是医用生物材料的一种，其具有良好的止血作用，不会对机体产生不良反应。但是目前临床使用的止血材料，有些止血效果不理想，有些过敏反应大^[13-15]，有些价格昂贵。止血材料首先要有良好的止血性能，其次需要组织代谢相容性良好，并且价格适中。壳聚糖的止血作用已经被国内外学者广泛认同^[16-17]，

相关的止血材料也较多，但温敏性壳聚糖的止血效果、组织相容性及体内代谢吸收需要通过实验来观察，作者设计了大鼠肝创面出血模型及股四头肌内代谢吸收实验，来观察温敏性壳聚糖的止血作用、局部组织反应及体内代谢情况。

实验中观察到温敏性壳聚糖止血膜贴于肝创面后，迅速将血液聚集凝固，在创面形成一层凝胶状血液止血膜保护膜，并且与创面黏附牢固，将创面很好地封住，达到了快速凝血、止血作用。温敏性壳聚糖止血膜同样具有壳聚糖的止血特性，通过阴阳离子的吸附作用，将带阴离子的红细胞聚集在一起，形成凝血块，将血液凝固；其次是对血小板的黏附和聚集作用，壳聚糖可明显促进血小板黏附与聚集，从而凝固血液。另外温敏性壳聚糖与血液形成凝胶状血液止血膜保护膜，封堵创面，达到良好的止血作用^[18-22]。温敏性壳聚糖止血膜与创面的黏附力增强可能与温敏性壳聚糖引入了亲水性羟丁基团，增强了其亲水性，增加了与创面的黏附力。同时当温敏性壳聚糖止血膜接触血液接触后，迅速吸附血液，形成凝胶状血凝块，在体温的状态下保持一种凝胶状态，类似于胶水的黏附作用，也增加了其与创面的黏附力，达到封堵创面的作用，减少出血。

在实验中观察到温敏性壳聚糖止血膜2周时少量吸收，4周时大部分吸收，6周后基本吸收，未见明显残留：①苏木精-伊红染色镜下观察到肝小叶结构完整，肝细胞结构基本正常，肿胀轻，变性坏死少，炎症细胞浸润程度轻；肌肉纤维结构完整，变性坏死的肝细胞少，炎症细胞浸润程度轻。②通过透射电镜观察到，整个肝细胞外形结构清楚，细胞核无破损，细胞核内物质分布均匀，细胞质内线粒体、高尔基体丰富，糖原含量较多，滑面内质网增生，扩张不明显；股四头肌纤维走向整齐，肌细胞的细胞核形态正常，肌细胞核内物质分布均匀，高尔基体丰富，糖原含量较多。

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