胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.020

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5203-5208.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

李治¹，赵伟¹，刘伟²，周晔²，贾京桥³，杨立枫¹

沈阳医学院附属中心医院，1骨科，2产科，辽宁省沈阳市 110024；3辽宁省维尔克干细胞生物科技有限公司，辽宁省本溪市 117000

收稿日期:2014-06-25 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 杨立枫，沈阳医学院附属中心医院骨科，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:李治，男，1973年生，汉族，辽宁省沈阳市人，吉林大学在读博士，主任医师，主要从事脊髓及神经损伤的干细胞治疗研究。
基金资助:
辽宁省科技厅科研项目(2012225014)

Chondrogenic differentiation of placenta-derived mesenchymal stem cells in vitro

Li Zhi¹, Zhao Wei¹, Liu Wei², Zhou Ye², Jia Jing-qiao³, Yang Li-feng¹

1Department of Orthopedics, 2Department of Obstetrics, Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 3Liaoning Wellcare Stem Cell Biotechnology Co., Ltd., Benxi 117000, Liaoning Province, China

Received:2014-06-25 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Yang Li-feng, Department of Orthopedics, Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
About author:Li Zhi, Studying for doctorate, Chief physician, Department of Orthopedics, Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
Supported by:
the Scientific Research Program of Liaoning Science and Technology Bureau, No. 2012225014

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎盘间充质干细胞已被证实有较强的增殖能力，且能向成骨细胞、成神经细胞、类肝样细胞等诱导分化，但对其成软骨细胞诱导分化的研究不多。
目的：在体外诱导人胎盘间充质干细胞成软骨细胞分化。
方法：体外培养人胎盘间充质干细胞并鉴定。取第3代胎盘间充质干细胞，调整细胞悬液浓度为1.6×1010 L-1，在24孔板中央分别滴5，10，15 μL细胞悬液，培养2 h(目的是形成微团)；然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基培养14 d，阿利新蓝染色，进行大体观察及倒置显微镜观察。
结果与结论：应用间充质干细胞培养基培养的对照组，细胞增殖形成大量贴壁细胞，贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态；应用软骨诱导培养基培养后，细胞只保持微团，不继续增殖形成贴壁细胞，微团基部无贴壁细胞，随着接种细胞数量的增加，微团直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力，可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 分化, 胎盘间充质干细胞, 培养, 成软骨细胞, 体外诱导, 阿利新蓝染色, 细胞微团, 膝关节, 退行性改变, 半月板损伤

Abstract:

BACKGROUND: Placenta-derived mesenchymal stem cells have been shown to have a strong proliferative capacity, and can differentiate into osteoblasts, neuroblasts, hepatocyte-like cells, but there are few studies about their chondrogenic differentiation.
OBJECTIVE: To induce the differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes in vitro.
METHODS: Human placenta-derived mesenchymal stem cells were culture in vitro and identified. Passage 3 cells were used to prepare cell suspensions at the concentration of 1.6×1010 cells/L, and then cultured in 24-well plates at a volume of 5, 10, 15 μL for 2 hours for the purpose of forming micelles. After that, the samples were cultured in mesenchymal stem cell medium or cartilage induction medium for 14 days. Alcian blue staining, general observation and inverted microscope observation were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: A great amount of adherent cells formed in the mesenchymal stem cell medium, which possessed typical morphology of mesenchymal stem cells. After cultured in cartilage induction medium, the cells only maintained micelles and did not proliferate continuously to form adherent cells. The base of these micelles had no adherent cells, and the diameter of micelles became increasing with the increasing number of inoculated cells. These findings suggest that human placenta-derived mesenchymal stem cells have the chondrogenic ability, and can be used as seed cells for tissue engineering and cell therapy.

全文链接：

Key words: stem cells, embryonic stem cells, placenta, chondrocytes

中图分类号:

R394.2

李治，赵伟，刘伟，周晔，贾京桥，杨立枫. 胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5203-5208.

Li Zhi, Zhao Wei, Liu Wei, Zhou Ye, Jia Jing-qiao, Yang Li-feng . Chondrogenic differentiation of placenta-derived mesenchymal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5203-5208.

图/表（结果） 1

2.1 胎盘来源间充质干细胞形态及细胞表面标志物检测结果人胎盘间充质干细胞在间充质干细胞培养基中培养，细胞增殖形成大量贴壁细胞，放大40倍倒置显微镜观察，贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态，即纺锤体型，折光性强。

用流式细胞仪检测结果显示，阳性表达CD90、CD44、CD105和CD73，不表达CD34、CD14和CD45。流式细胞仪检测结果表明实验培养的细胞具备干细胞的表面标志物，可证实为胎盘间充质干细胞。

2.2 成软骨细胞诱导后阿利新蓝染色结果

倒置显微镜观察：对照组1：形成微团时所用的胎盘来源间充质干细胞的细胞悬液体积为5 μL，细胞悬液浓度为1.6×10¹⁰ L^-¹，在间充质干细胞培养基中培养，每3 d换液1次。细胞增殖形成大量贴壁细胞，14 d后阿利新蓝染色，放大40倍倒置显微镜观察，贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态，即纺锤体型，折光性强，色成淡蓝色(图1A)。

对照组2：形成微团时用细胞浓度为1.6×10¹⁰ L^-¹的胎盘来源间充质干细胞悬液10 μL，可见细胞增殖形成大量贴壁细胞外，还会形成细胞膜状反折，14 d后阿利新蓝染色，倒置显微镜观察，贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态(图1B)。

对照组3：形成微团时用细胞浓度为1.6×10¹⁰ L^-¹的胎盘来源间充质干细胞悬液15 μL，4 d后行阿利新蓝染色，倒置显微镜观察，微团的基部具有大量贴壁细胞，微团不圆润(图1C)。

实验组1：形成微团时所用的胎盘来源间充质干细胞的细胞悬液体积为5 μL，细胞悬液浓度为1.6×10¹⁰ L^-¹，在软骨诱导培养基中培养，每3 d换液1次。14 d后行阿利新蓝染色，放大40倍倒置显微镜观察，细胞只会保持微团，不会继续增殖形成贴壁细胞，微团基部无贴壁细胞，微团悬浮培养基中，微团直径约1 mm。倒置显微镜下无法观察到微团内的细胞形态，但可观察到实验组中微团的边缘向外延伸出少数的丝状细胞结构(图1D)。

实验组2，3：形成微团时用细胞浓度为1.6×10¹⁰ L^-¹的胎盘来源间充质干细胞悬液10，15 μL，倒置显微镜观察悬浮培养基中的微团直径约1.5，2 mm，其形态与实验组1相似(图1E，F)。

大体观察结果：各组胎盘来源间充质干细胞的数码相机照相结果见图2。

对照组1，2中细胞在间充质干细胞培养基中增殖良好，形成大量贴壁细胞长满24孔板(图2A，B)；对照组3中有细胞团出现(图2C)；实验组细胞在软骨诱导培养基中培养，未见贴壁细胞，微团直径约1.0，1.5，2.0 mm(图2D-F)。

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引言

近年来，干细胞研究得到了蓬勃的发展，尤其是间充质干细胞已经成为一种新的治疗手段广泛应用于临床^[1-5]。目前最常用的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞^[6-7]，骨髓间充质干细胞可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥；骨髓间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及^[8-10]。不过骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较少，而且随着年龄的增加，在骨髓中的含量减少，其增殖分化能力也逐渐减弱；同时骨髓间充质干细胞的取材是有创侵入性操作，增加了捐献者的痛苦和感染的机会，所以骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制^[11-13]。

胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，也含大量的干细胞。足月胎盘是分娩的废弃物，取材容易，对供者不造成损伤，无伦理问题，而且胎盘体积大，获得干细胞相对较多，所以胎盘间充质干细胞更方便适用于临床^[14-16]。朱少芳等^[17]用酶消化法从胎儿蜕膜侧胎盘组织成功分离培养出胎盘间充质干细胞，并观察其生物学特性和抗凋亡细胞因子(血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子)的分泌水平，结果证实胎盘间充质干细胞的生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，并能分泌血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子。李芳等^[18]比较了酶消化和整体灌注分离人胎盘间充质干细胞的效果，发现酶消化和整体灌注的方法都可以分离人胎盘间充质干细胞，但整体灌注的方法分离得到的胎盘间充质干细胞纯度更高。

已有研究证实，胎盘间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞类似的功能和特性，两者的多向分化潜能也类似^[19-20]，且胎盘间充质干细胞的增殖能力更强。国内外很多研究者发现，胎盘间充质干细胞在体外实验中可被诱导分化为中胚层的心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞，内胚层的胰岛细胞、肝细胞以及外胚层的神经元、星形胶质细胞；而且这些结果同样在心肌梗死和帕金森大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓损伤灵长类动物模型等体内模型中得到了证实^[21-26]。

目前，关于胎盘间充质干细胞体外向软骨细胞诱导的报道不是很多^[27-28]。张钰^[28]在体外成功培养并大量扩增生物学性状稳定的人胎盘间充质干细胞的基础上，在单层培养条件下，成功将人胎盘间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，诱导得到的细胞具有软骨细胞形态特征，并能分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原。本实验从足月胎盘中获取胎盘间充质干细胞，利用阿利新蓝染色观察成软骨诱导后细胞团形态变化，同时探讨接种细胞数量对其的影响，为人胎盘来源间充质干细胞将来进一步应用于修复人膝关节退行性改变或膝关节半月板损伤提供实验依据。

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2013年10月至2014年5月在沈阳医学院附属中心医院实验室完成。

材料：

胎盘：实验用胎盘由沈阳医学院附属中心医院妇产科提供，为正常足月剖宫产胎盘，产妇年龄为23-35岁，经体检产妇身体健康，梅毒、HIV、CMV、HBSAg、HCV检测均为阴性，无传染性疾病及妊娠并发症史，产妇及家属对实验均知情同意并签署“知情同意书”。

培养基：①间充质干细胞培养基：UltroSer G + UltraCul Ture +谷氨酰胺。②软骨诱导培养基(chondrogenesis differentiation medium)：含10 μg/L 转化生长因子β3， 100 μg/L胰岛素，10^-⁷ mol/L地塞米松，6.25 mg/L转铁蛋白，50 μg/L维生素C，H-DMEM培养基。

胎盘来源间充质干细胞成软骨诱导实验用试剂：
试剂	来源	货号
低糖DMEM	invitrogen	11054-020
GLUTAMAX™-I	invitrogen	35050-061
多聚甲醛	阿法埃莎(中国)化学有限公司	A11313

方法：

胎盘来源间充质干细胞的分离及培养：无菌条件下取胎盘的胎儿面蜕膜组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗，冲洗干净无血迹后用剪刀将其剪碎，剪成1 mm×1 mm× 1 mm的碎片，然后加入1%Ⅳ型胶原酶10 mL，37 ℃水浴消化30 min。消化完成后用DMEM中止消化，充分均匀吹打后用100目筛网过滤，然后将过滤得到的细胞悬液离心 (1 200 r/min离心5 min)，弃上清，加入完全培养基(含低糖DMEM，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗)10 mL，计数板计数后调整细胞浓度，以3×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种至细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每三四天换液1次，待细胞生长铺满至瓶底80%-90%时按常规方法进行传代。胎盘来源间充质干细胞在间充质干细胞培养基中培养(本实验室提供)，培养到第3代进行实验，倒置显微镜观察细胞形态。

胎盘来源间充质干细胞的鉴定：取第3代胎盘间充质干细胞，以0.25%胰酶消化3 min后制成单细胞悬液。调整细胞浓度，分别加入抗人CD44、CD90、CD73、CD105、CD14、CD34和CD45的单克隆抗体，冰上避光反应 20 min，PBS洗2次后离心5 min(4 ℃，1 000 r/min)，弃上清，加入2 mL冷PBS吹打混匀，用流式细胞仪检测其细胞表面标志物。

胎盘来源间充质干细胞的成软骨细胞诱导及分组：用胰酶将胎盘来源间充质干细胞洗下，生理盐水离心洗涤2次。用MSC Attachment medium将细胞重悬至1.6×10¹⁰ L^-¹，小心滴不同数量的重悬细胞至24孔板中央，周围加生理盐水，置于生物安全柜培养2 h(目的是形成微团)。然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基1.0-2.0 mL，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂的培养箱中培养，两三天换液。

6个实验组分组处理方式：
组别	细胞悬液浓度	细胞悬液体积	培养基
实验组1	1.6×10¹⁰L^-¹	5 μL	软骨诱导培养基
实验组2	1.6×10¹0 L^-¹	10 μL	软骨诱导培养基
实验组3	1.6×10¹⁰ L^-¹	15 μL	软骨诱导培养基
对照组1	1.6×10¹⁰ L^-¹	5 μL	间充质干细胞培养基
对照组2	1.6×10¹⁰ L^-¹	10 μL	间充质干细胞培养基
对照组3	1.6×10¹⁰ L^-¹	15 μL	间充质干细胞培养基

阿利新蓝染色：各组细胞培养14 d后，用40 g/L多聚甲醛固定，阿利新蓝染色，数码相机照相。倒置显微镜观察细胞形态。

主要观察指标：胎盘来源间充质干细胞的形态，成软骨细胞诱导后阿利新蓝染色结果。

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讨论

关节软骨的自我修复能力有限^[29-30]，目前临床上用于治疗软骨损伤或关节退行性改变的方法和药物的远期治疗效果不佳，均难以达到满意的疗效。如自体同源软骨移植术(autologous chondrocyte transplantation，ACT)，不但需要二次手术增加了患者的痛苦，且远期效果不佳，容易导致关节软骨退变；而一些抗炎症的药物，长期应用不良反应较大，因此组织工程方法成为软骨损伤或关节退行性改变治疗领域的研究热点^[31-33]。

种子细胞的来源一直是限制软骨组织工程发展的主要瓶颈。目前常用的细胞都有一些缺陷：软骨细胞易发生老化及去分化，丧失形成软骨的能力^[34]，而且其增殖能力随年龄的增长逐渐下降；胚胎干细胞则有伦理学争议及致瘤性问题；从肌肉、滑膜取材分离干细胞将造成不易修复的损伤^[35-36]；脂肪干细胞及骨髓干细胞数量极少，不易获取，而且脂肪来源干细胞的成骨及成软骨作用较差^[37-38]；脐带体积小，因此脐带来源的间充质干细胞的数量有限，很难满足临床治疗需要。胎盘容易获得并且体积大获得的细胞数量多，科研成本低廉，不涉及伦理问题^[39-41]，而且胎盘间充质干细胞增殖能力强，免疫原性弱，如果能证实人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力，可为组织工程、细胞治疗等应用增加一种新的种子细胞来源^[42-44]。

阿利新蓝是一种水溶性氰化亚肽铜盐，属于阳离子染料，是显示酸性黏液物质最特异的染料，染料与酸性基团形成盐键。利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别，可用于软骨细胞的鉴定，软骨组织的内酸性黏多糖的定量分析。

本实验利用阿利新蓝染色评价胎盘间充质干细胞的成软骨诱导结果，发现应用软骨诱导培养基培养后，胎盘间充质干细胞只保持微团，不继续增殖形成贴壁细胞，微团基部无贴壁细胞，另外随着初始接种细胞数量的增加，形成微团的直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力，可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源，将来可进一步研究将其应用至修复人膝关节的退行性改变或膝关节半月板损伤，因此人胎盘来源间充质干细胞具有广泛的临床应用前景。

不过，本实验只是最初步的研究，仅仅证明了胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力，下一步的实验将把胎盘间充质干细胞诱导为软骨样细胞，观察诱导细胞的形态并鉴定其是否具有软骨细胞的功能，能否分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原，为进一步的动物体内实验提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

Chondrogenic differentiation of placenta-derived mesenchymal stem cells in vitro

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