NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5209-5213.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.021

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NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达

欧剑锋¹，任晖²，王存邦¹，白海¹

解放军兰州军区兰州总医院，1血液病科，2乳腺科，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2014-07-04 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 白海，博士，主任医师，解放军兰州军区兰州总医院血液病科，甘肃省兰州市 730050
作者简介:欧剑锋，男，1968年生，汉族，2009年四川大学毕业，博士，主治医师，主要从事血液疾病的基础和临床研究。
基金资助:
甘肃省自然科学基金项目(1010RJZA054)

Construction and expression of NDRG2 retroviral vector

Ou Jian-feng¹, Ren Hui², Wang Cun-bang¹, Bai Hai¹

1Department of Hematology, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 2Department of Breast Surgery, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2014-07-04 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Bai Hai, M.D., Chief physician, Department of Hematology, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Ou Jian-feng, M.D., Attending physician, Department of Hematology, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 1010RJZA054

摘要/Abstract

摘要：

背景：NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是一个新的抑癌基因，既可以增强经典抑癌通路的抗肿瘤效应，又可以对正常细胞的癌变起到监控。有关NDRG2在骨髓瘤发生中的功能和作用至今还未见报道。
目的：构建NDRG2基因反转录病毒表达载体，利用包装的病毒感染人骨髓瘤细胞系U266，检测NDRG2的表达情况。
方法：设计与合成引物，提取U266细胞的RNA，反转录和PCR扩增，经BamHⅠ和TaqⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收进行连接转化，并再次酶切鉴定；并将构建的载体包装为反转录病毒，感染U266细胞，筛选出稳定表达NDRG2的U266细胞(U266-NDRG2)克隆扩大培养，利用Western blot实验检测筛选到的U266细胞中NDRG2的表达。
结果与结论：成功构建了携带NDRG2基因表达的重组载体pBaba-puro-NDRG2，并包装为反转录病毒，筛选到的U266细胞(U266-NDRG2)中NDRG2蛋白表达明显高于U266-cherry细胞和U266细胞。结果可见利用反转录病毒载体基因重组技术成功构建出携带相应基因的反转录病毒，为研究NDRG2在人骨髓瘤中的作用奠定了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 骨髓瘤细胞, 基因, 基因转染, 反转录病毒载体, NDRG2基因, 甘肃省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: N-Myc downstream regulated gene 2 (NDRG2) is a new tumor supressor gene, and it can either improve anti-tumor effect by classic pathway or monitor carcinogenesis. But there is yet no report addressing NDRG2 role in myeloma occurrence.
OBJECTIVE: Using pBaba-puro retroviral vector to construct recombinant vector which carrying NDRG2 gene and pack virus, then to screen U266 cells stably expressing NDRG2.
METHODS: Primers were designed and synthesized. RNA was extracted from U266 cells, and then applied to reverse transcription for the template and latter PCR amplification. After PCR amplification and digested by Taq I and BamHI, agarose gel electrophoresis was used to detect the correct fragments. We used the vectors to package the retrovirus and infected the U266 cells. The U266 cells stably expressing NDRG2 were screened and NDRG2 protein was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The vector carrying NDRG2 was successfully constructed. The retrovirus was also packaged and infected U266 cells. The U266 cells stably expressing NDRG2 were screened. In these U266 cells, NDRG2 expression was increased significantly. The use of recombinant retrovirus vector technology can successfully construct a retrovirus carrying the corresponding gene which can be used for the following study on NDRG2 function in human myeloma.

全文链接：

Key words: multiple myeloma, genes, transfection, retroviridae

中图分类号:

R394.2

欧剑锋，任晖，王存邦，白海. NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5209-5213.

Ou Jian-feng, Ren Hui, Wang Cun-bang, Bai Hai . Construction and expression of NDRG2 retroviral vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5209-5213.

图/表（结果） 3

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年3月在解放军兰州军区兰州总医院血液科实验室完成。

材料：TechGene PCR扩增仪、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、含20 ng MgCL₂的Buffer、琼脂糖凝胶电泳仪、胶回收试剂盒均购自Tiangen天根生化科技有限公司。BamHⅠ和TaqⅠ限制性内切酶、T₄连接酶购于TakaRa公司。反转录病毒包装系统由Shuo Dong教授(Baylor College of Medicine)惠赠。293T、U266细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，由解放军兰州军区兰州总医院血液科实验室保存。LB固体培养基，大肠杆菌DH5感受态细胞均由解放军兰州军区兰州总医院血液科实验室提供。NDRG2、β-actin一抗以及相应二抗均购自Santa Cruz公司。

实验方法：

总RNA提取与反转录：按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取U266细胞的总RNA，经紫外分光光度计测定纯度和浓度合格后按照反转录试剂盒操作合成cDNA的第一条链，-20 ℃保存以备后用。

引物设计及PCR扩增：根据GeneBank收录的NDRG2基因序列设计1对PCR扩增引物，并设计加入BamHⅠ和TaqⅠ两种酶切位点，引物序列为：上游5’-GAG ATA TGC TCT TAA CCA CCC G-3’，下游5'-GCT GCC CAA TCC ATC CAA-3’，引物送上海生工公司合成。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸1 min。将PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段产物以胶回收试剂盒进行回收纯化处理。

反转录病毒载体构建：用两种限制性内切酶同时对上步胶回收产物与载体pBabe-puro进行双酶切，酶切体系 20 μL：胶回收产物DNA或载体质粒6 μL，酶BamHⅠ和TaqⅠ各1 μL，缓冲液2 μL，水10 μL(37 ℃，3 h)。酶切后的目的片段和载体DNA经琼脂糖凝胶电泳后，根据正确的碱基片段大小胶回收。将胶回收产物进行连接反应，连接体系10 μL：载体2 μL，目的基因片段6 μL，缓冲液1 μL，T₄连接酶1 μL(16℃过夜)。将连接产物转化至大肠杆菌DH5感受态，接种于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落，摇菌过夜并抽提质粒。酶切鉴定重组质粒，DNA电泳确定片段大小是否正确，将鉴定正确的克隆送测序进一步确定。最后，选择正确的克隆，培养并提取质粒，-20 ℃保存以备后用。

反转录病毒的制备及滴度测定：将293T细胞以每孔 2×10⁵个(500 μL)接种于24孔板，并以无血清及无抗生素DMEM培养基培养过夜后使得细胞生长密度达到60%-80%；提前提取反转录病毒载体质粒和非特异性对照质粒，并定量备用；按照脂质体使用说明书，将各种质粒与脂质体配比混合后共转染293T细胞；37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱中培养18 h后更换完全DMEM培养基继续培养24 h，并收集培养上清；将293T细胞以每孔5 000个接种于6孔板中，培养24 h后每孔加入适量病毒感染48 h，通过流式细胞仪检测293T细胞红色荧光cherry阳性表达率，根据公式计算病毒滴度：滴度(TU/mL)=1×10⁵(293T细胞数)×cherry阳性表达率(%)×100/每孔病毒液的体积含量(μL)。

感染并筛选稳定表达NDRG2的U266细胞：将U266细胞以每孔 2×10⁵个(500 μL)接种于24孔板，正常培养；每孔加入适量病毒感染48 h后使用含嘌呤霉素(4.0 mg)的培养基进行筛选，每3 d更换含嘌呤霉素的完全培养基，直至未被感染的细胞全部死亡时，筛选结束；对筛选克隆换正常培养基扩增培养，即获得稳定表达NDRG2的U266细胞。
Western blot检测NDRG2表达：收集细胞样品，检测NDRG2的蛋白表达水平。提取处理后的细胞总蛋白用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液充分裂解，然后用BCA法(pierce)进行蛋白定量，取50 µg处理好的蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，100 V恒压转移2 h后5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将NC膜与抗体孵育，4 ℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室温孵育1 h，再次洗膜3次，每次5 min，利用LI-COR Bioscience的Odyssey Infrared Imaging System对靶分子的蛋白表达水平进行定量化的检测，分析结果。主要观察指标：构建载体的片段大小、病毒的滴度和对细胞的感染情况以及NDRG2在人骨髓瘤细胞U266中的表达。

全文链接：

讨论

随着人们对肿瘤分子水平发病机制的研究，越来越多的致癌基因突变被发现，加之靶向药物的开发与应用，极大地推进了肿瘤个体化治疗的进展。因此，解析肿瘤的发病机制，明确相关致病靶分子，对于提高肿瘤个体化治疗至关重要。人骨髓瘤是血液系统中浆细胞异常增生，导致侵犯骨髓的一种恶性造血系统疾病。当人体浆细胞发生癌变后，会复制产生大量的恶性浆细胞，称之为骨髓瘤细胞^[10]。这种恶性细胞会引起机体发生高钙血症、肾功能减退、贫血以及骨骼功能障碍等^[11]。化疗和放疗为骨髓瘤的主要治疗方式，但是仍然有大部分的患者无法从治疗中获益。因此，进一步理解骨髓瘤的发病机制，研究关键致癌分子，明确其在发病中的关键作用，对于骨髓瘤的治疗和研究将大有裨益。

NDRG2基因是解放军第四军医大学的研究团队于1999年应用PCR消减杂交技术研究脑组织差异表达基因时所发现的一种含APC样结构域的新基因^[12]。NDRG2基因组全长9.33 kb，其定位于染色体14q11.1，含有16个外显子；mRNA全长为2 024 bp，编码357个氨基酸。表达谱分析结果显示，NDRG2广泛表达于多种正常组织器官中，尤其以心肌及脑组织表达含量最高^[13]，并且在多种肿瘤组织中低表达，与肿瘤细胞恶性生物学行为及患者分期、侵袭程度和临床预后密切相关^[14-17]。

目前国内国际研究团队展开了许多针对NDRG2基因功能相关的研究，主要围绕NDRG2的抗癌作用和机制方面做了大量的研究。NDRG2在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺肿瘤、结直肠癌、膀胱癌等多种人体肿瘤中表达均低于正常组织，上调NDRG2表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖^[18-21]；NDRG2启动子区域的甲基化、突变及基因缺失在多种肿瘤细胞系中可见，这是NDRG2在肿瘤中低表达的原因之一^{[7, 22-26]}；NDRG2受Myc基因的调控，其表达水平与结直肠癌分化密切相关^[27-29]；NDRG2 mRNA水平可作为监测结直肠癌复发和评估患者预后的参考特征^[30]；NDRG2受缺氧应激调控，在缺氧状态下缺氧诱导因子可通过直接结合NDRG2启动子区域3个缺氧反应元件(HREs)活化NDRG2表达，并随之发生由胞浆向核内的转移，进而调控相关基因的转录^[31-33]；NDRG2受到p53的直接调控，并随之参与了p53依赖的细胞凋亡过程^{[17, 34-35]}；AKT抑制剂可减少热疗对胃癌细胞NDRG2磷酸化水平的增加作用，提示热疗可能以AKT依赖的方式诱导了胃癌细胞中NDRG2的磷酸化^[36-38]。尽管如此，有关NDRG2在造血系统疾病，尤其是人骨髓瘤中的作用还未见报道。本研究主要构件了NDRG2基因反转录病毒表达系统，包装病毒，并且筛选稳定表达NDRG2基因的人骨髓瘤细胞系U266，这将为NDRG2在人骨髓瘤中的作用研究奠定了基础。

反转录病毒介导的基因表达是20世纪80年代发展起来的一种高效基因转移技术，它是借助反转录病毒载体与外源基因重组后，经包装细胞系包装产生缺陷型重组反转录病毒进而感染靶细胞，从而完成介导靶基因表达的目的^[39]。因此，本研究也选用反转录病毒进行载体构建，重组的反转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染能力的复制缺陷型病毒，将介导NDRG2表达的病毒转染靶细胞人骨髓瘤细胞系U266，并且筛选稳定表达NDRG2蛋白的细胞系，可用于研究NDRG2在人骨髓瘤发病中的作用。

本研究成功构建了NDRG2基因表达的反转录病毒载体，包装病毒并感染细胞，筛选获得NDRG2稳定表达的人骨髓瘤细胞系U266，为后续实验研究做好铺垫。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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[1]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.
[2]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[3]	张永强, 潘凤, 孙鹏, 谭明辉, 轩留明, 王勤章. Gja1基因重组慢病毒对糖尿病豚鼠膀胱病变模型中缝隙连接蛋白43蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1161-1165.
[4]	徐聪, 赵赫, 孙岩. 生物材料导管修复面神经损伤与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1089-1095.
[5]	薛婷, 张新日, 孔晓梅. 纳米材料多模态显像示踪技术在间充质干细胞治疗尘肺中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1133-1140.
[6]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	崔连旭, 江文康, 陆大鸿, 许峻荣, 刘小翠, 王丙云. 临床级人脐带间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠神经功能的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 835-839.
[10]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[11]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[12]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[13]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[14]	郝柳芳, 段红梅, 王子珏, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 转基因小鼠脊髓损伤后室管膜细胞的时空动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 883-889.
[15]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.

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