原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4450-4454.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.004

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响

王吉刚，周凡，刘彦琴，白颖，刘景华，吴丹彤

解放军沈阳军区总医院血液科，辽宁省沈阳市 110016

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 周凡，硕士，主任医师，解放军沈阳军区总医院血液科，辽宁省沈阳市 110016
作者简介:王吉刚，男，云南省沾益县人，博士，副主任医师，主要从事白血病微环境对白血病生物学特性影响的研究。
基金资助:
辽宁省科学技术计划重大、重点项目(2009225009-11)

Influences of co-culture with primary bone marrow stromal cells on imatinib sensitivity and cell cycles of K562 cells

Wang Ji-gang, Zhou Fan, Liu Yan-qin, Bai Ying, Liu Jing-hua, Wu Dan-tong

Department of Hematology, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Zhou Fan, Master, Chief physician, Department of Hematology, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Wang Ji-gang, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
Supported by:
the Key Science and Technology Program of Liaoning Province, No. 2009225009-11

摘要/Abstract

摘要：

背景：与骨髓基质细胞黏附可介导白血病细胞耐药，而对于黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言，骨髓基质细胞在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。
目的：构建慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型，探讨慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响。
方法：自慢性髓细胞白血病患者骨髓分离、培养骨髓基质细胞，与K562细胞共培养构建骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型。MTT法检测伊马替尼IC50，Annexin V-FITC/PI标记暴露于0.5 μmol/L伊马替尼72 h的K562细胞，流式细胞仪检测K562细胞凋亡率。收集与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞，流式细胞仪检测细胞周期及细胞周期蛋白(Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E)的表达。
结果与结论：基质细胞共培养组及悬浮培养组K562细胞伊马替尼IC50分别为(0.52±0.02) μmol/L和(1.27± 0.05) μmol/L，两者比较差异有显著性意义(P < 0.01)。0.5 μmol/L伊马替尼处理72 h，共培养组及悬浮培养组凋亡率分别为(15.48±4.17)%和(32.01±6.83)%，两者比较差异有显著性意义(P < 0.01)。与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞G₀-G₁期细胞的比例为(48.81±8.27)%，明显高于悬浮培养组(25.78±3.26)%(P < 0.01)。慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养能介导K562细胞对伊马替尼耐药，其机制可能与基质细胞共培养使K562细胞发生G₀/G₁细胞周期阻滞有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 慢性髓细胞白血病, 骨髓基质细胞, 伊马替尼, 细胞周期, 耐药

Abstract:

BACKGROUND: Leukemia cells can obtain drug resistance phenotype mediated by adhesion to bone marrow stromal cells. But, for chronic myelogenous leukemia with adhesion functional defects, the role and mechanism of bone marrow stromal cells in imatinib-resistant formation remain unclear.
OBJECTIVE: To construct the co-cultured model of bone marrow stromal cells–K562 cells and to investigate the influences of the co-culture with bone marrow stromal cells from the patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib sensitivity of K562 cells and cell cycle.
METHODS: The co-culture model was constructed by co-culturing K562 cells with bone marrow stromal cells isolated and cultured from the patients with chronic myelogenous leukemia. The IC50 values of K562 cells exposed to imatinib were quantified by MTT assay. The apoptotic rates of K562 cells exposed to 0.5 μmol/L imatinib for 72 hours were detected by flow cytometry through Annexin V-FIT/PI labeling. The cell cycles, cell cycle protein (cyclin A, cyclin D1 and cyclin E) expression of K562 cells co-cultured with bone marrow stromal cells for 72 hours were analyzed by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The IC50 values of co-culture group and suspension culture group were respectively (0.52±0.02) μmol/L and (1.27±0.05) μmol/L, and their comparison showed significant differences (P < 0.01). After 72 hours of treatment with 0.5 μmol/L imatinib, the apoptotic rates in the co-culture group and suspension culture group were respectively (15.48±4.17)% and (32.01±6.83)%, and their comparison showed significant differences (P < 0.01). The percentages of G₀-G₁phase of K562 cells co-cultured with bone marrow stromal cells for 72 hours were (48.81±8.27)%, which were significantly higher than the suspension culture group (25.78±3.26%) (P < 0.01). The co-culture with bone marrow stromal cells from the patients with chronic myelogenous leukemia could mediate K562 cells resistance to imatinib. The mechanism was possibly related with G₀/G₁arrest of K562 cells induced by co-culture with bone marrow stromal cells.

全文链接：

Key words: leukemia, myelogenous, chronic, BCR-ABL positive, bone marrow cells, K562 cells, cell cycle

中图分类号:

R394.2

王吉刚，周凡，刘彦琴，白颖，刘景华，吴丹彤. 原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4450-4454.

Wang Ji-gang, Zhou Fan, Liu Yan-qin, Bai Ying, Liu Jing-hua, Wu Dan-tong. Influences of co-culture with primary bone marrow stromal cells on imatinib sensitivity and cell cycles of K562 cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4450-4454.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型观察接种K562细胞后4 h，约30%的K562细胞黏附于基质细胞层，培养24 h黏附的K562细胞约40%，培养48 h黏附的K562细胞比例无升高，但可观察到少数K562细胞向基质细胞层迁移。实验中观察到暴露于伊马替尼可诱导K562细胞黏附于基质细胞层，且向基质细胞层迁移现象更易见，部分K562细胞嵌合于基质细胞层，同时也观察到部分K562细胞因伊马替尼作用后发生固缩或呈碎块状(图1A)。扫描电镜观察模型发现K562细胞通过伪足龛于融合基质细胞层所形成的“网眼”中 (图1B)。

2.2 骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼IC₅₀的影响经0-5 μmol/L伊马替尼梯度浓度处理48 h，MTT法测定伊马替尼作用K562细胞的IC₅₀值，共培养组及悬浮培养组分别为(0.52±0.02) μmol/L和(1.27±0.05) μmol/L，两者比较，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 骨髓基质细胞共培养对伊马替尼诱导K562细胞凋亡的影响经0.5 μmol/L伊马替尼处理72 h，AnnexinV- FITC/PI标记流式细胞术检测K562细胞的凋亡率，共培养组凋亡率为(15.48±4.17)%，而悬浮培养组为(32.01± 6.83)%，提示骨髓基质细胞共培养显著抑制了伊马替尼对K562细胞的凋亡诱导效应(P < 0.01)。

2.4 骨髓基质细胞共培养对K562细胞周期的影响悬浮组K562细胞G₀-G₁期比例为(25.78±3.26)%，S和G₂-M期分别为(48.79±5.71)%和(24.82±3.87)%，而共培养组K562细胞G₀-G₁期细胞的比例明显升高，达(48.81±8.27)%，G₂-M期细胞比例明显降低为(8.31±2.38)%，共培养组G₀-G₁期细胞比例和G₂-M期细胞比例与悬浮组相应时相比较相差非常显著(P < 0.01)，而S期细胞的比例差异无显著(P > 0.05)，见表1。

2.5 骨髓基质细胞共培养对K562细胞Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E表达的影响骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞经流式细胞仪分析Cyclin A、Cyclin D1及CyclinE的表达，与悬浮培养组比较，Cyclin A及Cyclin D1表达明显下调，其平均荧光强度指数(MFI)差异有显著性意义(P < 0.01)，而cyclin E的表达无显著差异(P > 0.05)，见表2。

参考文献

[1]Castangeth F.Palandri F. Amabile M,et al.Resuits of high-dose imatinib mesylate in intermediate Sokal risk chronic myeloid leukemia patients in early chronic phase：a phase 2 trial of the GIMEMA CML Working Party.Blood.2009;113(15):3428-3434.
[2]Lee F,Fandi A,Voi M.Overcoming kinase resistance in chronic myeloid leukemia.Int J Biochem Cell Biol.2008;40(3):334-343.
[3]Schraufstatter IU,Discipio RG,Khaldoyanidi S.Mesenchyreal stem cells and their microcnvironment.Fmnt Biosci. 2011; 16(12):2271-2288.
[4]NeⅣi B,fhirez P,Rettig MP,et al.Chemosensitization of acute myeloid leukernia(AML)following mobilization by the CXCR4 antagonist: AMD3100.Blood. 2009;113(24):6206-6214.
[5]Seke Etet PF, Vecchio L, Nwabo Kamdje AH. Signaling pathways in chronic myeloid leukemia and leukemic stem cell maintenance: key role of stromal microenvironment.Cell Signal. 2012;24(9):1883-1888.
[6]王吉刚,梁后杰,史曦凯,等.腺病毒介导CTLA4Ig基因在骨髓基质细胞中的表达[J].中华血液学杂志,2003,24(12):661-663.
[7]Weisberg E, Liu Q, Zhang X, et al. Selective Akt inhibitors synergize with tyrosine kinase inhibitors and effectively override stroma-associated cytoprotection of mutant FLT3-positive AML cells.PLoS One. 2013;8(2):e56473.
[8]Anderson K-C.Targeted therapy of multiple myeloma based upon tumor-microenvironmental interactions.Exp-Hematol. 2007;35(4 Suppl 1):155-162.
[9]Bhatia R, Munthe HA, Verfaillie CM. Role of abnormal integrin-cytoskeletal interactions in impaired beta1 integrin function in chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitors.Exp Hematol. 1999;27(9):1384-1496.
[10]Lundell BI,McCarthy JB,Kovach NL & Verfaillie CM. Activation-dependent alpha5beta1 integrin-mediated adhesion to fibronectin decreases proliferation of chronic myelogenous leukemia progenitors and K562 cells.Blood. 1996, 87(11): 2450−2458.
[11]Martín-Henao GA, Quiroga R, Sureda A, et al. L-selectin expression is low on CD34+ cells from patients with chronic myeloid leukemia and interferon-a up-regulates this expression. Haematologica. 2000;85(2):139-146.
[12]Ponte AL, Marais E, Gallay N, et al. The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells. 2007;25(7):1737-1745.
[13]Chu HC, Lee HY, Huang YS, et al. Erythroid differentiation is augmented in Reelin-deficient K562 cells and homozygous reeler mice. FEBS Lett. 2014;588(1):58-64.
[14]Lim S, Saw TY, Zhang M, et al. Targeting of the MNK-eIF4E axis in blast crisis chronic myeloid leukemia inhibits leukemia stem cell function. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(25): E2298-2307.
[15]Manzotti G, Mariani SA, Corradini F, et al. Expression of p89(c-Mybex9b), an alternatively spliced form of c-Myb, is required for proliferation and survival of p210BCR/ABL- expressing cells. Blood Cancer J. 2012y; 2(5):e71.
[16]Vianello F,Villanova F,Tisato V,et al.Bone marrow mesenchymal stromal cells non-selectively protect chronic myeloid leukemia cells from imatinib-induced apoptosis via the CXCR4／CXCLl2 axis.Haematologica. 2010;95(7): 1081-1089.
[17]Konopleva M, Konoplev S, Hu W, et al. Stromal cells prevent apoptosis of AML cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins. Leukemia. 2002;16(9):1713-1724.
[18]Nefedova Y,Landowski TH,Dalton WS. Bone marrow stromal-derived soluble factors and direct cell contact contribute to de novo drug resistance of myeloma cells by distinct mechanisms. Leukemia. 2003;17(6):1175-1182.
[19]Wang X, Wang C, Yan SK, et al. XIAP is upregulated in HL-60 cells cocultured with stromal cells by direct cell contact. Leuk Res. 2007;31(8):1125-1129.
[20]Kim CH, Wu W, Wysoczynski M, et al. Conditioning for hematopoietic transplantation activates the complement cascade and induces a proteolytic environment in bone marrow: a novel role for bioactive lipids and soluble C5b-C9 as homing factors. Leukemia. 2012;26(1):106-116.

引言

慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)以9号和22号染色体相互移位形成BCR-ABL融合基因为遗传学标志，即费城染色体。该融合基因编码的融合蛋白P210BCR-ABL为一210 ku的非受体酪氨酸激酶，持续活化的酪氨酸激酶活性使Ras-MAPK、PI3K-Akt及Stat5等多条信号通路自身磷酸化，从而导致细胞过度增殖、凋亡受抑和细胞黏附缺陷。目前的一线治疗为酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib，IM)，该药系基于P210BCR-ABL在慢性髓细胞白血病发病中的核心作用而设计的以BCR-ABL融合基因为靶点的2-苯氨嘧啶衍生物，通过竞争性抑制BCR-ABL酪氨酸激酶ATP结合位点，防止了酪氨酸自身磷酸化，而使底物磷酸化导致促白血病信号通路中断。研究显示伊马替尼可使68%的慢性髓细胞白血病患者获得完全细胞遗传学缓解，但伊马替尼耐药及治疗失败已成为困扰临床的主要问题^[1]。目前报道的伊马替尼耐药机制研究主要集中于BCR-ABL激酶点突变及BCR-ABL表达扩增方面^[2]。近年研究证实，白血病细胞骨髓微环境为白血病细胞提供了“庇护所”，保护细胞免受化疗药物的毒性作用，这种通过白血病细胞与骨髓基质细胞黏附而获得的耐药表型，称之为细胞黏附介导耐药^[3-4]。对黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言，其骨髓微环境在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。因此，有必要从微环境的角度进一步深入研究慢性髓细胞白血病伊马替尼耐药的生物学背景。鉴于白血病患者的基质细胞在黏附分子表达、细胞外基质成分及细胞因子分泌等方面存在异常，并在白血病的发生、发展中起作用^[5]。

实验自慢性髓细胞白血病患者分离培养骨髓基质细胞，与K562细胞共培养以模拟骨髓微环境，探讨其对K562细胞伊马替尼耐药敏感性及细胞周期的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外对照观察。

时间及地点：于2011年3月至2012年11月在解放军沈阳军区总医院血液科完成。

材料：

标本来源：纳入确诊未经治疗的慢性髓细胞白血病患者骨髓标本12份，其中男性6例，女性6例，年龄17-55岁，中位年龄44岁。患者知情同意，并签署知情同意书。每份骨髓2.0-3.0 mL，50 U/mL肝素抗凝。

实验方法：

原代骨髓基质细胞分离、培养：培养体系为RPMI1640培养液，内含(2.0-4.0)×10⁹ L^-¹单个核细胞，体积分数12.5%马血清，体积分数12.5%小牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/L的链霉素，10^-⁶ mol/mL氢化考的松注射液。具体参照文献[6]进行。

K562细胞系的培养：将K562细胞系(解放军沈阳军区总医院中心实验室提供)接种于含有体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中，饱和湿度下培养，取对数生长期的细胞用于实验。

骨髓基质细胞-K562细胞系共培养体系的建立：取活性较好，第三四代处于对数生长期的骨髓基质细胞用于实验，达90%融合时，⁶⁰Co射线照射15 Gy，剂量率为 100 cGy/min，以消除内源性造血集落；用含体积分数2%新生牛血清的RPMI1640培养液充分洗涤基质细胞层，以去除死细胞；用0.25%的胰蛋白酶消化基质细胞，洗涤去胰蛋白酶，计数后按4×10⁴/cm²接种于培养瓶或孔板；培养24 h，大多数基质细胞贴壁、舒展形成基质细胞层，去除悬浮未贴壁基质细胞；按1×10⁹ L^-¹以完全培养液悬浮K562细胞后将其接种于基质细胞层，并加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液继续培养24 h即可用于实验。将该共培养体系构建于盖玻片上即可用于扫描电镜的观察。

MTT法测定伊马替尼IC₅₀：取对数生长期的K562细胞，按2×10⁵/孔，培养体系为90 μL/孔，共培养组将K562细胞接种细胞于骨髓基质细胞包被的96孔板，并设基质细胞单培养组作为对照；悬浮培养组将K562细胞接种于未经骨髓基质细胞包被的96孔板，培养24 h；按10 μL/孔加入不同浓度的伊马替尼储存液，使实验组和对照组的终浓度分别为0.15，0.3，0.6，1.25，2.5及5 μmol/L，每个药物浓度设6个复孔，并分别设置空白对照组。培养72 h，按20 μL/孔加入5 g/L的MTT，孵育4 h，终止培养，1 000 r/min离心5 min，去上清；按100 μL/孔加入DMSO溶解MTT，酶标议570 nm测A值，共培养组A值减去基质细胞单培养组A值后再计算伊马替尼对K562细胞的半数抑制浓度，即IC₅₀，并重复3遍取均数。

细胞凋亡实验：将骨髓基质细胞共培养及悬浮培养的K562细胞暴露于0.5 μmol/L伊马替尼72 h收集细胞，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书标记细胞，用流式细胞术检测K562细胞凋亡率。

流式细胞仪检测细胞周期分布：收集与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞，PBS洗涤2次，以体积分数70%的乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗涤3次，加RNase酶，37 ℃水浴消化30 min，以去除RNA，冰浴终止消化，加入50 mg/L碘化丙啶(PI)染色20 min，漩涡混匀，流式细胞仪检测并分析G₀-G₁期、S和G₂-M期细胞的百分比。

流式细胞仪检测Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E的表达：收集与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞，PBS (1 000 r/min离心5 min，r=12.5 cm)洗涤2次，计数细胞，1×10⁶/管分管，每管加1 000 μL固定液，室温10 min， 1 000 r/min离心5 min(r=12.5 cm)弃上清，PBS洗涤1次，加1 000 μL破膜剂，室温15 min，1 000 r/min离心5 min (r=12.5 cm)弃上清，加100 μL破膜剂重悬细胞，分别加入 5 μL Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E一抗，同时设同型对照，室温孵育30 min，1 000 r/min离心5 min(r=12.5 cm)弃上清，PBS洗涤1次，加入已稀释的FITC-羊抗鼠二抗100 μL，室温避光孵育30 min，PBS洗涤1次，加入1 000 μL PBS重悬细胞，FACS分析蛋白表达，以平均荧光强度指数(MFI)表示蛋白表达量。

主要观察指标： ①骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性的影响(IC₅₀及凋亡率)。②骨髓基质细胞共培养对K562细胞的细胞周期及细胞周期调控蛋白(Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E)表达的影响。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 15.0软件进行统计处理，数据以x(_)±s表示，采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

作为慢性髓细胞白血病治疗的里程碑及靶向性药物治疗的代表，酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼使慢性髓细胞白血病的治疗出现转机，但耐药已成为困扰临床的主要问题，目前其耐药机制研究主要集中于BCR-ABL激酶点突变及BCR-ABL表达扩增方面^[7-8]。近年有研究者将多发性骨髓细胞及急性髓细胞白血病细胞与细胞外基质成分纤维连接蛋白(fibronectin，FN)或骨髓基质细胞系黏附培养，发现肿瘤细胞与周围微环境的黏附作用与其耐药产生有关，提示肿瘤微环境可能成为逆转血液系统肿瘤细胞多药耐药新的突破口。但对于黏附缺陷的慢性髓细胞白血病，其骨髓微环境在伊马替尼耐药中的作用及机制尚不清楚^[9-10]。白血病细胞的骨髓微环境，包括白血病细胞-基质细胞间相互作用、细胞外基质成分及可溶性因子等方面，且细胞外基质成分和可溶性因子均由基质细胞产生，因此基质细胞是白血病微环境的核心。鉴于白血病患者的基质细胞在黏附分子表达、细胞外基质成分及细胞因子分泌等方面存在异常，并在白血病的发生、发展中起作用^[5]。为此，实验采用自初诊未治的慢性髓细胞白血病患者分离培养的基质细胞构建共培养模型。β1整合素是介导白血病细胞黏附于骨髓基质最重要的黏附分子，但慢性髓细胞白血病细胞β1整合素表达缺陷导致白血病细胞与骨髓基质及细胞外基质的黏附力明显降低^[11-12]。尽管如此，在共培养模型构建中发现，接种K562细胞4 h后仍有约30%的K562细胞黏附于基质细胞层，随着培养时间延长，黏附的K562细胞增多，并可观察到少部分K562细胞向基质细胞层迁移。有学者研究证实，慢性髓细胞白血病细胞低水平表达L-选择素，提示除β1整合素外可能尚有其他的黏附分子参与介导白血病细胞与基质细胞的黏附，使其具备一定的向骨髓基质细胞迁移及黏附能力^[13]。该研究中发现，伊马替尼可诱导K562细胞黏附于基质细胞层及向基质细胞层迁移，培养48 h可观察到部分K562细胞嵌合于基质细胞层中，扫描电镜观察模型发现K562细胞通过伪足龛于融合基质细胞层所形成的“网眼”中，形成了白血病细胞“屏蔽性”的位相结构^[14-15]。上述现象或许提示伊马替尼能诱导K562细胞与骨髓基质间黏附力的恢复，鉴于基质细胞衍生因子1/趋化因子受体CXCR4轴在白血病细胞与骨髓微环境相互作用中起关键作用，Vianello等^[16]研究发现，在骨髓基质细胞的保护下，CD34⁺慢性髓细胞白血病细胞可以免受酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼诱导的细胞凋亡，而用CXCR4抑制剂AMD3100阻断CXCR4/CXCLl2轴至少可以部分恢复此类白血病细胞对伊马替尼的敏感性。

实验采用MTT法行细胞毒实验测定伊马替尼对K562细胞的IC₅₀，结果发现骨髓基质细胞共培养明显抑制了K562细胞对伊马替尼的敏感性，共培养组IC₅₀为(1.27± 0.05) μmol/L，较悬浮培养组(0.52±0.02) μmol/L明显升高。在细胞凋亡实验中发现，骨髓基质细胞共培养抑制了伊马替尼对K562细胞的诱导凋亡诱导效应，从而体外证实了慢性髓细胞白血病骨髓微环境能介导伊马替尼耐药。

细胞周期是个高度有序的过程，这种有序的运转是通过Cyclin/Cdks复合物的调节来实现的。流式细胞仪检测细胞周期发现，基质细胞共培养使处于G₀/G₁期的K562细胞比例明显升高，G₂-M期比例明显降低，而S期细胞比例无明显变化，提示骨髓基质细胞共培养使K562细胞阻滞在G₀/G₁期。Konopleva等^[17]将急性髓细胞白血病细胞HL-60细胞系和NB-4细胞系与鼠MS25基质细胞系共培养时，抑制了阿糖胞苷诱导的凋亡，也抑制了HL-60、NB-4分裂增殖，细胞周期分析提示G₀/G₁期细胞数量明显高于对照组。有研究者将骨髓基质细胞与多发性骨髓瘤细胞分别进行直接接触共培养和非直接接触共培养^[18]，发现直接接触共培养和非直接接触共培养通过不同的机制抑制凋亡，非直接接触共培养促进了骨髓瘤细胞增殖，使细胞进入G₂、S期，部分抵消了凋亡诱导效应；而只有直接接触骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞共培养方能抑制了DNA合成，阻滞骨髓瘤细胞于G₁期，结果部分抑制拓扑逆构酶Ⅱ抑制剂诱导的凋亡。鉴于不同的阶段起作用的Cyclin/Cdks不同，具有时相特异性^[19-20]。实验进一步以流式细胞仪检测与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E的表达，结果发现共培养组Cyclin A及Cyclin D1的表达明显下调，而Cyclin E的表达无显著差异。上述研究结果从细胞周期调节蛋白的角度进一步证实了骨髓基质细胞共培养使K562细胞发生G₀/G₁期细胞阻滞，但G₀/G₁期细胞阻滞在慢性髓细胞白血病骨髓微环境介导伊马替尼耐药中的具体作用机制尚待于进一步研究。

原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响

Influences of co-culture with primary bone marrow stromal cells on imatinib sensitivity and cell cycles of K562 cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.