骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.020

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 3075-3081.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化

林禹丞¹，王宸¹，芮云峰¹，成心锟²，马良彧²

1东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009
2东南大学医学院，江苏省南京市 210009

修回日期:2014-03-12 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 王宸，教授，硕士生导师，东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009 并列通讯作者：芮云峰，副研究员，硕士生导师，东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市210009
作者简介:林禹丞，男，1988年生，汉族，江苏省东台市人，东南大学医学院在读硕士，主要从事骨与关节损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81201422)；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012334)；东南大学基本科研业务费“创新基金”项目(3290002401)；国家大学生创新训练计划(1210286090)；中国博士后科学基金项目和江苏省博士后科学基金特别资助项目(2012M520983)

Bone morphogenetic protein 2 stimulated osteo-chondrogenic differentiation of patellar tendon-derived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy

Lin Yu-cheng¹, Wang Chen¹, Rui Yun-feng¹, Cheng Xin-kun², Ma Liang-yu²

1Department of Orthopedics, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
2Medical School of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Revised:2014-03-12 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Wang Chen, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China Corresponding author: Rui Yun-feng, Associate investigator, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
About author:Lin Yu-cheng, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81201422; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2012334; the Innovative Fund for the Basic Scientific Research of Southeast University, No. 3290002401; Student Innovation Training Program of China, No. 1210286090; China Postdoctoral Science Foundation & Postdoctoral Science Foundation of Jiangsu Province, No. 2012M520983

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床对于慢性腱病缺乏有效的治疗手段，原因在于其发病机制至今尚未阐明。
目的：研究体外骨形态发生蛋白2对胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型髌腱来源肌腱干细胞的成骨、成软骨分化的作用。
方法：从大鼠慢性腱病模型的髌腱中分离培养出原代肌腱干细胞，传代培养至第3代细胞，行成骨、成脂、成软骨诱导分化鉴定其干细胞的特性。将肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，用重组人骨形态发生蛋白2干预。7 d后分别行茜素红染色，并行茜素红染色定量分析。将肌腱干细胞体外三维微球培养后分为2组，诱导组用重组人骨形态发生蛋白2干预，对照组不进行干预。21 d后三维微球行苏木精-伊红染色，阿利辛蓝染色以及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。
结果与结论：慢性腱病大鼠来源原代肌腱干细胞体外培养呈克隆样集落生长，传代后细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞，具有成纤维细胞样的特征。肌腱干细胞(P3)成脂诱导10 d，油红O染色阳性；成骨诱导7 d，茜素红染色阳性；成软骨诱导14 d，苏木精-伊红染色阳性可见软骨样细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。单层培养的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2诱导7 d茜素红染色阳性，对照组为阴性，茜素红染色定量检测显示差异有显著性意义。重组人骨形态发生蛋白2诱导肌腱干细胞21 d，苏木精-伊红染色可见软骨样细胞形成、阿利辛蓝染色可见细胞内糖胺多糖沉积、Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。可见体外重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病来源的肌腱干细胞成骨、成软骨分化。这为进一步研究慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 诱导, 慢性腱病, 肌腱干细胞, 成骨分化, 成软骨分化, 骨形态发生蛋白2, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The pathogenesis of tendinopathy remains unclear and hence treatment of tendinopathy is usually palliative.
OBJECTIVE: To investigate the effects of bone morphogenetic protein 2 on the osteogenic and chondrogenic differentiation of patellar tendon-derived stem cells isolated from collagenase-induced tendinopathy rats in vitro.
METHODS: Patellar tendon-derived stem cells were isolated from patellar tendons of collagenase-induced tendinopathy rats. The multi-differentiation potential of patellar tendon-derived stem cells at passage 3 was identified by osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation assays. The patellar tendon-derived stem cells were cultured to the 3rd passage in complete culture medium, and then the cells were divided into two groups with (experimental group) or without recombinant human bone morphogenetic protein 2 (control group) until the cells reached confluence for 7 days. Their osteogenic response to bone morphogenetic protein 2 in vitro was examined by alizarin red S staining of calciumnodule formation and quantification assay. The patellar tendon-derived stem cell pellets were cultured in complete culture medium with (experimental group) or without bone morphogenetic protein 2 (control grup) for 21 days. Chondrogenic differentiation of the cell pellets was evaluated by hematoxylin-eosin staining, alcian blue staining, immunohistochemical staining for Sox9 and collagen type II.
RESULTS AND CONCLUSION: Primary patellar tendon-derived stem cells from the tendinopathy rats cultured in vitro showed clonal growth; after passage, spindle fibroblast-like and flat-like cells were detectable. The cells were positive for oil red O staining at 10 days after adipogenic induction, positive for alizarin red staining at 7 days after osteogenic induction, and positive for hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining of collagen type II at 14 days after chondrogenic induction. After patellar tendon-derived stem cells were induced with recombinant human bone morphogenetic protein 2 for 7 days, the result of alizarin red staining was positive in the experimental group, but negative in the control group without recombinant human bone morphogenetic protein 2. The difference in the result of alizarin red staining between the two groups was statistically significant. After patellar tendon-derived stem cells were induced with recombinant human bone morphogenetic protein 2 for 21 days, the results of hematoxylin-eosin staining, alcian blue staining, immunohistochemical staining for Sox9 and collagen type II were all positive. In conclusion, bone morphogenetic protein 2 could stimulate the osteogenic and chondrogenic differentiation of patellar tendon-derived stem cells isolated from collagenase-induced tendinopathy rats in vitro, which can help to better understand the pathogenesis of tendinopathy.

全文链接：

Key words: stem cells, tendinopathy, bone morphogenetic proteins, osteoblasts, chondrocytes, cell differentiation

中图分类号:

R394.2

林禹丞，王宸，芮云峰，成心锟，马良彧. 骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3075-3081.

Lin Yu-cheng, Wang Chen, Rui Yun-feng, Cheng Xin-kun, Ma Liang-yu. Bone morphogenetic protein 2 stimulated osteo-chondrogenic differentiation of patellar tendon-derived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3075-3081.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 共纳入SD大鼠6只，慢性腱病大鼠动物模型的构建方法参照Lui等^[14]的实验方法，大鼠均造模成功，大鼠处死后取其髌腱用以肌腱干细胞的提取。
2.2 慢性腱病大鼠髌腱来源肌腱干细胞的形态学观察 从慢性腱病大鼠髌腱消化获得的有核细胞以50个/cm²接种后，细胞呈克隆样生长(图1A)。原代培养7-10 d可见多个散在分布的细胞集落，每个集落呈由中心向外辐射样贴壁生长，细胞核聚集于中心，细胞质形成的突起向外呈放射状(图1B)。原代细胞经传代后，可见有多角形和长梭形两种细胞形态(图1C)，到第3代时，细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞，细胞核较大，具有成纤维细胞样的特征(图1D)。

2.3 慢性腱病大鼠肌腱干细胞的多向分化潜能诱导实验

成骨诱导：肌腱干细胞经更换成骨诱导培养液7 d后，成骨诱导组的细胞形态逐渐变为多角形，细胞内及其外周可见被茜素红染液染成红色的钙质沉积(图2A)。对照组也有成骨的趋势，但未见明显染色阳性的茜素红结节(图2B)。

成脂诱导：肌腱干细胞经更换成脂诱导培养液10 d后，成脂诱导组的细胞形态逐渐变肥大，在细胞质内可见油红O染液染成红色的脂滴形成(图2C)。对照组为阴性(图2D)。

成软骨诱导：肌腱干细胞经更换成软骨诱导培养液 14 d后，成软骨诱导组形成了光滑的细胞微球(图3A)，苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性(图3B、C)。对照组形成的细胞微球太小，且过于松散，无法行切片染色。

2.4 重组人骨形态发生蛋白2体外对髌腱来源肌腱干细胞的成骨诱导作用：和对照组相比，用重组人骨形态发生蛋白2干预的细胞体外培养7 d后，细胞质内形成了大量的茜素红染色阳性的钙结节(图4A、B)。茜素红定量结果显示成骨诱导组和对照组之间的差异有显著性意义(图4C)。

2.5 重组人骨形态发生蛋白2体外对髌腱来源肌腱干细胞的成软骨诱导作用 大体观察显示成骨诱导组肌腱干细胞体外培养21 d后形成的微球体积明显大于对照组，且更光滑、更具有弹性(图5A)。由于对照组细胞形成的微球体积较小且过于松散，无法做石蜡切片，故未行切片染色检测。成骨诱导组苏木精-伊红染色示微球中可见肥大的软骨样细胞形成(图5B)；阿利辛蓝染色示微球中可见细胞基质中糖胺多糖沉积(图5C)；Sox9免疫组织化学染色示部分软骨样细胞内Sox9呈阳性表达(图5D)；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示微球中细胞外基质可见Ⅱ型胶原表达(图5E)。

参考文献

[1] Rolf C, Movin T. Etiology, histopathology, and outcome of surgery in achillodynia. Foot Ankle Int. 1997;18(9):565-569.
[2] De Mos M, Koevoet W, Van Schie HT, et al. In vitro model to study chondrogenic differentiation in tendinopathy. Am J Sports Med. 2009;37(6):1214-1222.
[3] Kannus P, Jozsa L. Histopathological changes preceding spontaneous rupture of a tendon. A controlled study of 891 patients. J Bone Joint Surg Am. 1991;73(10):1507-1525.
[4] Xu Y, Murrell GA. The basic science of tendinopathy. Clin Orthop Relat Res. 2008;466(7):1528-1538.
[5] Skjong CC, Meininger AK, Ho SS. Tendinopathy treatment: where is the evidence? Clin Sports Med. 2012;31(2):329-350.
[6] Bi Y, Ehirchiou D, Kilts TM, et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nat Med. 2007, 13(10):1219-1227.
[7] Rui YF, Lui PP, Li G, et al. Isolation and characterization of multipotent rat tendon-derived stem cells. Tissue Eng Part A. 2010;16(5):1549-1558.
[8] Rui YF, Lui PP, Chan LS, et al. Does erroneous differentiation of tendon-derived stem cells contribute to the pathogenesis of calcifying tendinopathy? Chin Med J (Engl). 2011;124(4): 606-610.
[9] Rui YF, Lui PP, Wong YM, et al. Altered fate of tendon-derived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy. Stem Cells Dev. 2013;22(7):1076-1085.
[10] Rui YF, Lui PP, Rolf CG, et al. Expression of chondro-osteogenic BMPs in clinical samples of patellar tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2012; 20(7):1409-1417.
[11] Yee Lui PP, Wong YM, Rui YF, et al. Expression of chondro-osteogenic BMPs in ossified failed tendon healing model of tendinopathy. J Orthop Res. 2011;29(6):816-821.
[12] Rui YF, Lui PP, Lee YW, et al. Higher BMP receptor expression and BMP-2-induced osteogenic differentiation in tendon-derived stem cells compared with bone-marrow- derived mesenchymal stem cells. Int Orthop. 2012;36(5): 1099-1107.
[13] Rui YF, Lui PP, Wong YM, et al. BMP-2 stimulated non-tenogenic differentiation and promoted proteoglycan deposition of tendon-derived stem cells (TDSCs) in vitro. J Orthop Res. 2013;31(5):746-753.
[14] Lui PP, Fu SC, Chan LS, et al. Chondrocyte phenotype and ectopic ossification in collagenase-induced tendon degeneration. J Histochem Cytochem. 2009;57(2):91-100.
[15] Huang TF, Perry SM, Soslowsky LJ. The effect of overuse activity on Achilles tendon in an animal model: a biomechanical study. Ann Biomed Eng. 2004;32(3):336- 341.
[16] Backman C, Boquist L, Friden J, et al. Chronic achilles paratenonitis with tendinosis: an experimental model in the rabbit. J Orthop Res. 1990;8(4):541-547.
[17] Khan MH, Li Z, Wang JH. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 2005;15(1):27-33.
[18] Warden SJ. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 2007;41(4):232-240.
[19] Moraska A, Deak T, Spencer RL, et al. Treadmill running produces both positive and negative physiological adaptations in Sprague-Dawley rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2000;279(4):R1321-1329.
[20] 赵林,申延清,荣春,等. 间充质干细胞培养与分化诱导的特点及机制[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(040):7551-7554.
[21] Hashimoto Y, Yoshida G, Toyoda H, et al. Generation of tendon-to-bone interface "enthesis" with use of recombinant BMP-2 in a rabbit model. J Orthop Res. 2007;25(11):1415-1424.
[22] Tang Y, Tang W, Lin Y, et al. Combination of bone tissue engineering and BMP-2 gene transfection promotes bone healing in osteoporotic rats. Cell Biol Int. 2008;32(9): 1150-1157.
[23] Chen CH, Liu HW, Tsai CL, et al. Photoencapsulation of bone morphogenetic protein-2 and periosteal progenitor cells improve tendon graft healing in a bone tunnel. Am J Sports Med. 2008;36(3):461-473.
[24] Lui PP, Chan LS, Cheuk YC, et al. Expression of bone morphogenetic protein-2 in the chondrogenic and ossifying sites of calcific tendinopathy and traumatic tendon injury rat models. J Orthop Surg Res. 2009;4:27.
[25] Lui PP, Wong YM. Higher BMP/Smad sensitivity of tendon-derived stem cells (TDSCs) isolated from the collagenase-induced tendon injury model: possible mechanism for their altered fate in vitro. BMC Musculoskelet Disord. 2013;14(1):248.
[26] Rui YF, Lui PP, Ni M, et al. Mechanical loading increased BMP-2 expression which promoted osteogenic differentiation of tendon-derived stem cells. J Orthop Res. 2011; 29(3):390-396.

引言

慢性腱病患者肌腱的组织病理学研究发现，受损肌腱的主要特征是细胞数的增加、新生血管的长入、蛋白聚糖的沉积^[1]，细胞基质的紊乱，胶原的降解，甚至可以观察到组织的化生，比如软骨细胞表型的出现、脂肪浸润以及骨样沉积物^[2-3]，晚期病变严重时可见肌腱内的软骨化和骨化^[4]，这些变化呈现出一个肌腱自我愈合失败的过程。然而，目前对于慢性腱病的治疗只是基于有限的临床经验之上，大多疗效甚微^[5]，主要原因在于慢性腱病的细胞生物学发病机制尚未阐明。

2007年Bi等^[6]首先从人和小鼠的肌腱组织中分离提取出一种细胞群，体外培养时该细胞群具有克隆形成能力、自我更新及多向分化潜能等干细胞的普遍特性，故将这种细胞群定义为肌腱干/祖细胞。前期课题组也成功的从大鼠的肌腱中分离培养出了具有多向分化潜能的肌腱干细胞^[7]，由此证实了肌腱组织中存在着一种有自我更新能力以及多向分化潜能的干细胞。Rui等^[8-9]人通过一系列研究提出，病变肌腱中肌腱干细胞的错误分化可能是慢性腱病潜在的细胞生物学发病机制。

骨形态发生蛋白2属于转化生长因子β超家族，是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。在肌腱等软组织中一般较少表达，而在慢性腱病患者的临床标本以及胶原酶诱导的慢性腱病动物模型中，则观察到有异位的骨形态发生蛋白2/4/7的表达^[10-11]。在体外，骨形态发生蛋白2可以诱导正常的肌腱干细胞向非肌腱谱系分化^[12]，并促进细胞基质中蛋白聚糖的沉积^[13]。Bi等^[6]用骨形态发生蛋白2对小鼠源性的肌腱干细胞进行干预，然后将干预后的产物注射到免疫缺陷小鼠的皮下，观察到了与软骨骨化类似的结构。种种上述研究都说明了在慢性腱病的发病机制中，骨形态发生蛋白可能发挥着重要的作用。骨形态发生蛋白2能否诱导慢性腱病大鼠髌腱来源肌腱干细胞(rPTDSCs-CI)的错误分化，还尚不清楚。本实验通过分离培养慢性腱病大鼠髌腱来源的肌腱干细胞，并采用骨形态发生蛋白2体外诱导，观察其对慢性腱病大鼠髌腱来源肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化作用，旨在为进一步揭示慢性腱病的发病机制提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2013年5至12月在东南大学医学院外科学实验中心完成。

材料：

实验动物：6只8周龄SD大鼠用于注射胶原酶构造髌腱损伤模型并分离培养髌腱来源间充质干细胞，雌雄不限，体质量为250-300 g，由江苏省农科院提供，许可证号：SCXK(苏)2007-0004。实验中对动物的处置符合科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。

方法：

胶原酶诱导慢性腱病大鼠髌腱损伤模型的构建和鉴定：参照Lui等^[14]实验方法，将大鼠以2.5%戊巴比妥(4.5 mg/kg)麻醉后，去除下肢的毛发。再将大鼠膝关节屈曲90°以更好的显露髌腱。选用30G针头向大鼠双侧髌腱内注射20 μL溶组织梭菌来源的Ⅰ型胶原酶(15 g/L)。注射完成后将大鼠放回笼中自由活动，2周后将所有注射过Ⅰ型胶原酶的大鼠处死，取大鼠的髌腱用于分离培养肌腱干细胞。
慢性腱病大鼠髌腱来源肌腱干细胞的分离培养：参照Rui等^[7]实验方法，去除髌腱的腱骨移行部分和肌腱与肌肉交界部分，取髌腱中段用于细胞的分离与培养。小心的移除肌腱表面的腱膜之后将样本放入无菌PBS中，用眼科剪将肌腱剪成1 mm×1 mm×1 mm块状，放入培养皿中，Ⅰ型胶原酶(3 g/L)消化约2.5 h之后用70 μm滤器滤过形成单细胞悬液。以300×g，5 min离心后去除上清，用PBS洗涤2次，所得细胞沉淀用基础培养基重悬(含LG-DMEM，体积分数10%FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/L 链霉素)。将细胞悬液以有核细胞50个/cm²的细胞密度接种到面积为20 cm²的培养皿中^[7]，3 d后用无菌PBS洗涤细胞2次以去除未贴壁的细胞。培养7-10 d后用0.25%胰蛋白酶消化细胞并混合，标记为原代细胞。细胞铺满培养瓶底达90%后传代，弃培养液，无菌PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化3-5 min，加入基础培养基终止消化；细胞悬液以181×g离心5 min，弃上清，加入2 mL基础培养基重悬细胞，细胞计数按5×10^{3 个/cm²细胞密度接种至细胞培养瓶。取第3代细胞用于后续实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。}

肌腱干细胞的克隆集落生成：将有核细胞以50个/cm²细胞密度接种于面积为20 cm²培养皿中，培养7-10 d后采用0.5%龙胆紫染色15 min，观察细胞集落形成形态。

髌腱来源肌腱干细胞的多向分化诱导实验：

成骨分化：取第3代细胞，以5×10³个/cm²密度接种于6孔板，基础培养基培养，将细胞分为成骨诱导组和对照组。待贴壁细胞生长融合后成骨诱导组更换成骨诱导培养基(含体积分数10%FBS、100 nmol/L地塞米松、20 mmnol/L β-甘油磷酸钠、10 mg/L维生素C的LG-DMEM)，对照组继续使用基础培养基培养。每3 d更换培养基，至7 d时行茜素红染色鉴定。

成脂分化：取第3代细胞，以5×10³个/cm²密度接种于6孔板，基础培养基培养。将细胞分为成脂诱导组和对照组。成脂诱导组直至贴壁细胞生长融合后更换成脂诱导培养基(含体积分数10%FBS、500 nmol/L地塞米松、500 μmol/L异丁基甲基黄嘌呤、50 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素的LG-DMEM)，对照组继续使用基础培养基培养。每3 d更换培养基，至10 d时行油红O染色鉴定。

成软骨分化：取第3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化、重悬并计数，将含有5×10⁵个细胞的细胞悬液置于15 mL离心管中，450×g离心10 min制成三维微球培养体系。将微球分为成软骨诱导组和对照组。成软骨诱导组加入成软骨诱导培养基[含体积分数10%FBS、100 nmol/L地塞米松、100 mg/L丙酮酸盐、40 mg/L脯氨酸、50 g/L ITS+Premix(混合物含6.25 g/L胰岛素，6.25 g/L转铁蛋白，6.25 g/L亚硒酸，1.25 g/L牛血清白蛋白，5.35 g/L亚油酸)、10 μg/L转化生长因子β3、500 μg/L骨形态发生蛋白2、50 mg/L维生素C的LG-DMEM]，对照组继续使用基础培养基培养。每3 d更换培养液，培养至14 d时取两组微球行苏木精伊红染色以及Ⅱ型胶原免疫组化染色。

骨形态发生蛋白2体外对髌腱来源肌腱干细胞的成骨诱导作用：取第3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，重悬并计数，以4×10³个/cm²密度接种于24孔板，基础培养基培养，将细胞分为成骨诱导组和对照组。当贴壁细胞的生长开始融合时，成骨诱导组更换为含有100 μg/L重组人骨形态发生蛋白2的基础培养基培养，对照组继续基础培养基培养。诱导至7 d时，将成骨诱导组和对照组分别行茜素红染色，倒置相差显微镜下观察。

骨形态发生蛋白2体外对髌腱来源肌腱干细胞的成软骨诱导作用：取第3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化、重悬并计数，将含5×10⁵个细胞的细胞悬液置于15 mL离心管中，450×g离心10 min形成三维微球培养体系。将微球分为成软骨诱导组和对照组，两组均于2 mL基础培养基中培养，成软骨诱导组按100 μg/L 加入重组人骨形态发生蛋白2进行干预，对照组不作处理。每3 d更换培养液，至21 d时对两组微球行大体观察，并行苏木精-伊红染色，阿利辛蓝染色及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。

茜素红染色及其定量检测：吸去所有细胞表面培养液，无菌PBS冲洗2遍；用体积分数70%乙醇室温固定10 min；双蒸水轻柔冲洗2遍；加入1 mL/孔的0.5%茜素红染色液，室温孵育30 min；吸去未结合的染料，用双蒸水漂洗并轻微振荡5 min，重复3次；吸取多余的去离子水，倒置显微镜观察并拍照。倒置显微镜观察拍照后，细胞用蒸馏水冲洗1遍，每孔加入1 mL氯化十六烷基吡啶(100 g/L，pH 7.0)，室温放置15 min，将溶液移入96孔板，150 μL/孔，紫外分光光度计于405 nm检测吸光值。

油红O染色：吸去所有细胞表面培养液，无菌PBS冲洗2遍；用体积分数70%乙醇室温固定10 min；双蒸水轻柔冲洗两遍；随后用0.3%油红O溶液1 mL/孔室温染色2 h，吸去未结合的染料，用双蒸水漂洗并轻微振荡5 min，重复3次；吸取多余的去离子水，倒置显微镜观察并拍照。

苏木精-伊红染色：取细胞微球，用PBS洗涤2次后，以40 g/L多聚甲醛固定3 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，作5 μm厚石蜡切片。将切片脱蜡至水，行常规苏木精-伊红染色。

阿利辛蓝染色：同上法制作石蜡切片，切片脱蜡至水。将切片置于体积分数3%乙酸溶液中3 min，室温下用1%的阿利辛蓝染液染色30 min，0.05 mol/L HCl稍洗，核固红染液复染5 min，烤干，二甲苯透明，中性树胶封固。

Ⅱ型胶原以及Sox9免疫组织化学染色：取细胞微球，同上法制作切片，烤片、脱蜡至水。PBS漂洗3 次，体积分数3%H₂O₂室温下作用20 min以阻断内源性过氧化物酶；0.4%胃蛋白酶37 ℃下消化30 min以完成抗原修复；PBS 漂洗3次，羊血清封闭液37 ℃孵育30 min；弃去血清，加小鼠抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(1∶50)孵育或兔抗大鼠Sox9多克隆抗体(1∶30)，4 ℃过夜；PBS漂洗3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶100)或羊抗兔IgG(1∶100)，室温下孵育1 h；PBS漂洗3次，DAB显色10 min，染色满意后浸入水中终止显色；苏木精-伊红染液衬染细胞核1 min，盐酸乙醇分化，流水冲洗；常规脱水封固。将一抗替换为羊血清封闭液设为阴性对照，取大鼠股骨髁中的关节软骨设为Ⅱ型胶原和Sox9的阳性对照。

主要观察指标：①慢性腱病大鼠来源的髌腱来源肌腱干细胞原代及传代后细胞形态学观察。②对髌腱来源肌腱干细胞进行三系诱导分化鉴定结果。③重组人骨形态发生蛋白2体外对单层培养髌腱来源肌腱干细胞诱导成骨分化结果。④重组人骨形态发生蛋白2体外对3D培养髌腱来源肌腱干细胞诱导成软骨分化的结果。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，两独立样本间比较采用Mann-Whitney U检验；数据的统计分析采用SPSS分析软件17.0(美国SPSS公司)，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

目前，研究慢性腱病发病机制的动物模型主要有机械刺激模型及化学药物诱导模型。机械刺激的主要方法有持续性跑台运动及生物电刺激等^[15-16]，化学药物诱导主要有体内注射胶原酶及前列腺素等^[17]。采用持续性跑台机械刺激法建模符合慢性腱病的病因，但该方法受到的制约因素较多^[18]，因大鼠在自然界中善于跑步运动，所以很难模拟肌腱的过度使用；如果人为提高跑步速率或频率，会使大鼠产生抵抗，甚至会产生适应变化^[19]。电刺激会使实验的过程更可控，但操作也更复杂，对电刺激强度的把握要求较高，而且并不能模拟慢性腱病内在的持续性慢性损伤。Lui等^[14]将用腱内注射胶原酶造模成功的肌腱行组织病理学检查，发现在胶原酶诱导的腱病大鼠肌腱中观察到了和临床慢性腱病患者的肌腱相类似的特征，都表现为细胞数增多，新生血管长入，胶原基质降解，炎性细胞的缺失以及软骨样细胞的出现和钙化灶的沉积。而在其他的动物模型中，暂时均没有发现有钙化灶的沉积这一特征。所以，用肌腱内注射I型胶原酶诱导的慢性腱病模型，可能是目前最符合人体慢性腱病改变的，也是最合适的动物模型。

实验中选择在胶原酶注射后第2周处死大鼠，是因为在第2周时，胶原酶对肌腱的直接作用已经开始消退，细胞数开始增多，血管开始长入，Ⅱ型胶原也开始阳性表达，而此时还暂未观察到软骨样细胞的出现^[14]。这说明造模后第2周，慢性腱病模型已经被成功诱导，且处于病变的早期。

间充质干细胞来源于中胚层，而干细胞主要具有两项普遍的特性：即具有多向分化的潜能和体外培养时增殖速度快，具有自我更新能力^[20]。由于间充质干细胞缺乏特异性表面标志物，且不同来源的间充质干细胞的表面标志物也不尽相同，因而，目前对于鉴定间充质干细胞主要是靠它的形态学特征以及功能等。虽然有研究报道髌腱来源肌腱干细胞原代培养时仅有大概1%-2%的有核细胞是干细胞^[6]，但通过本实验发现有核细胞以低密度接种到培养皿后，呈集落状克隆样生长，增殖速度较快，随着细胞的换液以及传代，至第3代时，细胞群已基本是具有间充质干细胞特征的长梭形。故从髌腱中获得的原代肌腱干细胞体外培养至第3代时，细胞已逐渐纯化，可用于干细胞相关的体外实验。实验的结果提示，慢性腱病大鼠源的髌腱肌腱干细胞可在合适的诱导条件下向脂肪细胞，成骨细胞及软骨细胞分化，本实验中使用的细胞具有多向分化潜能的特性。

Rui等^[9]研究发现慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的命运发生了改变，和正常的肌腱干细胞相比，慢性腱病来源的肌腱干细胞细胞衰老快，细胞增殖能力低，并且其向肌腱细胞分化的能力明显减弱，而向成骨细胞，软骨细胞分化的潜能显著升高。因此，Rui等^[8]认为在慢性腱病的发病过程中，肌腱干细胞的错误分化可能导致了最终肌腱自我修复的失败，从而产生了相应的组织学变化及临床表现。然而，肌腱干细胞受到哪些调控因素的作用，肌腱干细胞发生错误分化的机制还不清楚。

骨形态发生蛋白2具有成骨、软骨的特性，目前已经广泛的用于软骨、骨和肌腱骨连接处的修复^[21-23]。骨形态发生蛋白2在正常肌腱组织中很少表达，而在慢性腱病患者的临床标本以及动物模型中，均观察到了异位表达的骨形态发生蛋白2^{[10-11, 24]}。在本实验中，将慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞在体外用重组人骨形态发生蛋白2干预，观察到干预后细胞中有茜素红染色阳性的钙质的沉积；体外三维培养形成了光滑的pellet微球；细胞微球的苏木精-伊红染色中可观察到软骨样细胞的形成；阿利辛蓝染色阳性证实基质中糖胺多糖的沉积；软骨源性Sox9以及Ⅱ型胶原免疫组化的阳性表达。这说明将慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2干预后能向成骨细胞及软骨样细胞分化。近期已有研究提出，慢性腱病大鼠肌腱干细胞内骨形态发生蛋白2及表面骨形态发生蛋白受体的表达也显著性的高于正常大鼠^[25]。慢性腱病大鼠肌腱干细胞对骨形态发生蛋白2的反应性是否高于正常肌腱干细胞还有待进一步的研究证实。目前的研究结果提示，慢性腱病大鼠体内肌腱干细胞可能是受到骨形态发生蛋白2作用的影响，发生了错误分化，从而导致了肌腱愈合的失败。

然而，重组人骨形态发生蛋白2通过何种途径作用于肌腱干细胞，临床标本和动物模型中骨形态发生蛋白2的来源还不清楚。虽然Rui等^[26]通过实验证实，将正常组织来源肌腱干细胞置于重复的机械张力下，肌腱干细胞会产生骨形态发生蛋白2的表达，但是具体的作用机制以及骨形态发生蛋白2是否来源于其他的细胞类型，如肌腱细胞、血管内皮细胞等还需要进一步的研究。

综上所述，从胶原酶诱导的慢性腱病大鼠的髌腱中可以分离培养出一种具有自我更新能力以及多向分化潜能的间充质干细胞。在体外，重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化。这提示具有更高成骨、成软骨分化潜能的肌腱干细胞可能受到慢性腱病肌腱内异位表达骨形态发生蛋白2的调控，使其在自我修复的过程中发生进一步错误的分化，导致肌腱出现异位钙化以及软骨骨化，最终导致肌腱愈合的失败。这为进一步揭示慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。

骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化

Bone morphogenetic protein 2 stimulated osteo-chondrogenic differentiation of patellar tendon-derived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.