骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2185-2190.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.009

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骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损

王鲲^1，2，伏小平¹，杨志华²，郑英²，高瞻²，高彩艳²，买超平²，哈小琴²

1甘肃农业大学动物医学院，甘肃省兰州市　730070； 2解放军兰州军区兰州总医院检验科，甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃省兰州市　730050

收稿日期:2014-02-11 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 哈小琴，女，博士，主任医师，解放军兰州军区兰州总医院检验科，甘肃省兰州市 730050
作者简介:王鲲，男，1987年生，安徽省合肥市人，汉族，2010年安徽农业大学毕业，甘肃农业大学在读硕士，主要从事预防兽医学专业、疾病的基因治疗方向。
基金资助:
全军十二五面上项目(CWS11C229)：西北高寒战区创伤再生修复及功能重建的实用技术研究

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of rat femoral defects at high altitude

Wang Kun^1,2, Fu Xiao-ping¹, Yang Zhi-hua², Zheng Ying², Gao Zhan², Gao Cai-yan², Mai Chao-ping², Ha Xiao-qin²

1College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China; 2Department of Clinical Laboratory, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2014-02-11 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Ha Xia-qin, M.D., Chief physician, Department of Clinical Laboratory, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Wang Kun, Studying for master’s degree, College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China; Department of Clinical Laboratory, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Military Twelfth Five-Year Plan of Chinese PLA, No. CWS11C229

摘要/Abstract

摘要：

背景：对于高原地区受到环境负面影响的组织创伤，例如高原骨缺损，干细胞的特点可以提供一个良好的加速创伤修复的方法。
目的：研究骨髓间充质干细胞治疗大鼠高原股骨缺损的创伤恢复效果。
方法：分离提取雄性Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞，取第3代细胞进行细胞表型鉴定。雌性Wistar大鼠80只，制备实验性股骨圆形缺损后随机均分为平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组、高原对照组、高原骨髓间充质干细胞移植组(n=20)。治疗后第30天拍X射线片观察股骨缺损区的修复情况，并于第10，20，30天分别采集股骨缺损区组织，检测其中碱性磷酸酶的含量。
结果与结论：高原骨髓间充质干细胞移植组大鼠股骨缺损区愈合速度较高原对照组快，且碱性磷酸酶的含量较高原对照组高(P < 0.05)；平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度也比平原对照组快，且碱性磷酸酶的含量也较平原对照组高(P < 0.05)。平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度较高原骨髓间充质干细胞移植组快，且碱性磷酸酶的含量较高原骨髓间充质干细胞移植组高(P < 0.05)。说明骨髓间充质干细胞的局部移植可提高高原股骨缺损区局部的碱性磷酸酶含量，加速缺损区的创伤修复速度，但高原股骨缺损区的愈合修复较平原组慢。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 间充质干细胞, 高原, 股骨缺损, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation can provide a good way to accelerate wound healing for tissue defects under negative environmental impacts at high altitude, such as plateau bone defects.
OBJECTIVE: To research the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cell treatment on rat femoral defects in high altitude.
METHODS: The bone marrow mesenchymal stem cells were separated from the femur and tibia of male Wistar rats, and the passage 3 cells were identified by detecting their surface antigen. Eighty female Wistar rats were operated for experimental femoral defects and randomly allocated into fours equal groups, namely, plain control group, plain transplantation group, plateau control group, and plateau transplantation group. Thirty days after treatment, rats were under X-ray to observe the repairment of femoral defects, and tissues from femoral defect
area were sampled to detect the levels of alkaline phosphatase at 10, 20, 30 days, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The rats in the plateau transplantation group B showed significantly faster repair of femoral defect and higher level of alkaline phosphatase than those in the plateau control group (P < 0.05). The rats in the plain control group also had better healing of femoral defect and higher level of alkaline phosphatase than those in the plain control group (P < 0.05). Furthermore, the healing of femoral defect and level of alkaline phosphatase were better in the plain transplantation group than the plateau transplantation group. These findings indicate that intramuscular transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells can significantly increase the regional content of alkaline phosphatase, promote the healing of femoral defects on the plateau, but the repairing speed of femoral defects in plateau is slower than that on the plain.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, bone marrow, femoral fractures, alkaline phosphatase

中图分类号:

R394.2

王鲲，伏小平，杨志华，郑英，高瞻，高彩艳，买超平，哈小琴. 骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2185-2190.

Wang Kun1,2, Fu Xiao-ping, Yang Zhi-hua, Zheng Ying, Gao Zhan, Gao Cai-yan, Mai Chao-ping, Ha Xiao-qin. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of rat femoral defects at high altitude[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2185-2190.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验总共纳入雄性Wistar大鼠2只，用于间充质干细胞的分离提取；雌性Wistar大鼠80只均分3 500 m高原对照组、3 500 m高原骨髓间充质干细胞移植组、平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组用于动物实验观察，于SPF级实验室中严格操作，无脱失现象，均进入结果分析。2.2 取第3代大鼠骨髓间充质干细胞显微镜下观察其细胞形态 400倍显微镜下观察第3代骨髓间充质干细胞，生长速度较快，细胞轮廓明显，体积较大，呈长梭形和多边形，呈平铺生长(图1)。

2.3 取第3代大鼠骨髓间充质干细胞进行流式细胞表型鉴定骨髓间充质干细胞表型抗体FITC-CD44检测结果为86.73%，间充质干细胞表型抗体FITC-CD90检测结果为92.10%，间充质干细胞表型抗体FITC-CD34检测结果为9.82%，间充质干细胞表型抗体FITC-CD45检测结果为7.91%(图2)。

2.4 雌性Wistar大鼠动物模型雌性Wistar大鼠动物股骨缺损模型制作成功，骨缺损形态为股骨中段1/3处直径约2 mm的圆形缺损区(图3)。

2.5 大体观察大鼠腿部活动情况各组大鼠造模后2 h 麻醉苏醒，右下肢均出现瘫痪症状，拖拽爬行，2 d后右侧腿部瘫痪症状减轻，4 d后可正常行走。进食进水均正常，体质量增长正常，伤口愈合良好，无红肿及渗出，无感染迹象，皮肤缝线自行脱落。

2.6 X射线检测大鼠股骨缺损愈合情况根据第 30天对照组与治疗组股骨缺损区愈合情况(图4)，3 500 m高原对照组缺损区周围骨组织界限较为明显，骨痂形成较为缓慢； 3 500 m高原骨髓间充质干细胞移植组缺损区骨组织边缘向内收拢，界限较为模糊，新生骨痂生长良好；平原对照组缺损区边缘向内收拢，界限较为模糊，新生骨痂愈合速度良好；平原骨髓间充质干细胞移植组缺损区界限模糊，骨痂生长情况相对于其他组都较为良好，缺损区中间部分也可看到有薄层新生骨出现；由此观察得出骨髓间充质干细胞移植治疗组的股骨愈合速度和效果明显优于对照组，且平原组好于高原组。

2.7 骨组织中碱性磷酸酶活性的检测根据3个时间点的统计数据表明：每个时间点的高原骨髓间充质干细胞移植组的碱性磷酸酶含量，都比高原对照组的高，差异有显著性意义(P < 0.05)；而平原骨髓间充质干细胞移植组的碱性磷酸酶含量也都比平原对照组高，且差异有显著性意义 (P < 0.05)；高原骨髓间充质干细胞组移植组与平原骨髓间充质干细胞组移植组的碱性磷酸酶含量比差异有显著性意义(P < 0.05)；平原对照组与高原对照组的碱性磷酸酶含量差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

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引言

骨缺损是临床最为常见的问题之一，目前常用的方法是在缺损处充填自体骨、异体骨、人工合成骨替代品等材料进行修复，临床效果均不十分理想，因此如何能够更好地修复缺损的骨组织，成为修复重建外科领域关注的热点^[1-2]。而因创伤、感染、肿瘤破坏等造成的骨缺损一直是临床上困扰骨科医生的难题，尤其是承重部位的较大缺损，如股骨缺损。

位于高海拔地区的居住人群长期处于一种寒冷缺氧的恶劣环境，使得机体血液中的含氧量始终处于较为低下的水平，心肺代偿功能降低^[3]，这种负面因素影响着的机体的正常生理功能，而机体内各种创伤修复也会因为环境的不利影响而延迟缓慢，不利于创伤的快速修复。长期处于高原低氧状态下，会使机体骨组织代谢异常，骨密度减小，降低成骨细胞增殖能力，造成骨缺损创伤修复延迟或治愈周期延滞，这又是骨缺损创伤修复的一个较大难题^[4]。目前骨组织工程学种子细胞的来源主要有皮质骨、松质骨、骨膜、骨髓、骨外组织及胚胎干细胞。皮质骨、松质骨、骨膜来源的成骨细胞能表达成骨细胞表型^[5]，且骨膜中含有较多的骨原细胞，而骨原细胞有分化潜能，可增殖分化为成骨细胞。

随着干细胞被研究的越来越深入，它在细胞创伤修复方面的研究得到了广大学者的一致肯定，成为干细胞研究的一个重要方向^[6]。间充质干细胞因为其良好的组织分化能力和弱免疫原性^[7-8]，目前在创伤修复方面的研究成为干细胞领域的热点。种子细胞是骨组织工程研究的基础与首要环节，理想的种子细胞应具备以下特点：①适应临床的需要，来源广泛，取材简便。②具有明确形成骨组织的能力。③在体外扩增达到所要求的细胞数量时保持成骨表型^[9]。虽然骨髓中间充质干细胞的数量较少，并且其生长能力和数量与年龄呈显著的负相关^[10]，但经体外培养间充质干细胞的数量能数亿倍扩增而不丢失成骨活性，经过短期(两三代)的培养就可以得到足量的成骨细胞来进行骨缺损的修复。

对于高原地区受到环境负面影响的组织创伤，干细胞可以被动员到暴露于短期缺氧的大鼠的外周血里^[11]，也可以通过归巢作用到达局部损伤组织中，参与机体创伤修复和再生^[12]。例如高原骨缺损，高原环境可引起骨密度、生物力学改变，而干细胞的特点可以提供一个良好的加速创伤修复的方法。本实验就是利用间充质干细胞的特点，移植高原大鼠股骨缺损的模型中，以观察其对骨缺损的修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：实验动物观察。

时间及地点：于2013年4至10月在解放军兰州军区兰州总医院医学实验科、动物实验科以及青海省玉树县高原实地实验基地完成。

材料：

实验动物：健康三四周龄体质量100 g以下的Wistar雄性大鼠2只，4月龄体质量200 g以上的雌性Wistar大鼠80只，均为SPF级，由甘肃省中医学院提供，许可证号SCXK(甘)-2011-0001，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

人鼠骨髓间充质干细胞获取实验主要仪器与试剂：
试剂及仪器	来源
αMEM培养基	美国GIBCO公司
胎牛血清	美国Hyclone公司
CD34、CD44、CD45、CD90抗体	BioLegend公司
培养瓶、培养皿	Corning公司
细胞培养箱	德国memmert公司
倒置显微镜	Olympus
流式细胞仪	美国BD公司
碱性磷酸酶测试盒	南京建成生物工程研究所

方法：

大鼠骨髓间充质干细胞原代提取与培养：取三四周龄体质量100 g以下雄性Wistar大鼠，颈部脱臼处死，用体积分数75%乙醇浸泡5-10 min消毒；无菌条件下取出股骨和胫骨，清除表面附着肌肉组织，剪去两端骨骺，露出骨髓腔，用含有FBS的αMEM完全培养基，将其中骨髓冲出；将冲出的骨髓反复吹打10 min，使其中细胞充分分散，200目筛网过滤；采用密度梯度离心法，将细胞悬液按照1∶1轻轻加至淋巴细胞分离液上层，1 800 r/min离心20 min，吸取中间层云雾状细胞层，离心洗涤，加入完全培养基，体积分数5%CO₂条件下培养；72 h后，首次给细胞换液，除去悬浮的杂质细胞，以后每72 h换液1次，当细胞贴壁融合度为80%时，用0.25胰酶+0.02EDTA消化液消化，按 1∶3传代^[13]。

大鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定：取第3代骨髓间充质干细胞消化离心，制成1.0×10⁹ L^-¹的细胞悬液，分别与FITC标记的CD34、CD44、CD45、CD90^[14-15]抗体室温下避光孵育30 min^[16]，流式细胞仪检测，BD CellQuest Pro 6.0软件分析。

大鼠股骨缺损模型制备与骨髓间充质干细胞移植：取体质量大于200 g的4月龄雌性Wistar大鼠，称其体质量，按照3 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉并维持；右侧大腿外侧剪毛、消毒，切开皮肤和皮下组织，切开深筋膜，从股外侧肌与股二头肌之间的外侧肌间隙钝性分离进入，露出股骨干；于股骨远侧端1/3处取点，钻出直径大约2 mm的圆形缺孔，制造实验性骨缺损；冲洗伤口分层缝合^[17-21]。

将80只Wistar大鼠按照不同的干预方式随机数字表法均分成4组，即3 500 m高原对照组、3 500 m高原骨髓间充质干细胞移植组(3 500 m为位于青海省玉树县高原实地的实验基地)、平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组。细胞移植组动物建模12 h后在股骨缺损区周围采取分点肌肉注射移植骨髓间充质干细胞，细胞移植浓度为8.0×10⁶ L^-^1[22]，100 μL细胞悬液，分5个点进行注射，第10，20天再各移植1次细胞。对照组移植同等体积的PBS作为对照。

X射线片检测大鼠股骨愈合情况：分别于骨髓间充质干细胞移植后第30天各取5只大鼠用X射线投射大鼠股骨处，拍片，观察股骨创伤区域的愈合情况，对比4组之间的愈合速度。

组织中碱性磷酸酶活性的检测：骨髓间充质干细胞移植体内后，分别于10，20，30 d处死大鼠(每个时间点各5只)，取出股骨分离出创伤区；研磨组织提取匀浆液，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，然后提取上层蛋白；按照说明书设置空白孔、标准孔和待测孔；酶标仪于520 nm处检测各孔的A值；按照公式计算组织中碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AKP)的浓度。

主要观察指标：①局部股骨缺损区的愈合情况。②局部股骨组织中的碱性磷酸酶活性。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示。采用方差分析，组内两两比较检验及方差分析。使用SPSS 10.0统计软件包进行统计学处理。

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讨论

高原地带的高寒、低氧等恶劣环境对骨组织的创伤修复造成的负面影响逐渐引起人们的关注。越来越多的研究表明，低氧引起骨组织创伤修复延迟或不愈合骨密度减低，使骨缺损，骨折等疾病的治愈周期延滞、难以愈合^[23]。有研究表明，高原缺氧将降低成骨细胞增殖能力，降低增殖细胞核抗体的表达^[24]。而且发现，在缺损修复时，高海拔地区局部再血管化现象不明显，从而表明缺氧对骨缺损修复时再生血管的植入有明显的影响^[25]。

而间充质干细胞具有的良好的组织分化潜能，在一定条件下间充质干细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞，骨骼肌、软骨细胞、肌腱细胞和胰岛素分泌细胞等^[26-27]。Jendelova等^[28]研究发现，骨髓间充质干细胞的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养骨髓间充质干细胞，就倾向于向这类环境中的细胞分化。根据这一原理，国内外诸多学者设想可以采用模拟成骨微环境的方法诱导骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化^[29]，这些都说明体外培养细胞时，在特定微环境作用下，种子细胞向特定方向诱导分化和增殖。而体内骨缺损的周围也存在类似的“成骨微环境”^[30-31]，可以促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。近年研究发现，缺损处周围的成骨细胞可分泌各类生长因子，这些生长因子可与骨髓间充质干细胞表面的受体结合^[32]，并且促进骨髓间充质干细胞在局部范围内聚集增殖、骨向分化及加速周围细胞组织再生，最终形成新生骨组织^[33-35]。

实验就是利用间充质干细胞的这些特点，应用到高原大鼠的股骨缺损模型中，从而加速其缺损区的创伤修复。从治疗组对比对照组的股骨缺损区修复情况来看，正常环境中，干细胞对股骨缺损就有良好的加速修复效果，而高原环境中干细胞移植治疗的股骨缺损的创伤愈合速度也同样优于对照组；对比两种海拔下，对照组与干细胞移植组的骨组织碱性磷酸酶的含量，也同样表明干细胞不论在低海拔地区，还是高海拔地区，干细胞都能发挥良好的促进治疗效果^[36-40]。

综上所述，可以基本说明了骨髓间充质干细胞在高原地区高寒低氧的恶劣条件下，对骨组织的创伤修复依然能够发挥了一定的功能，但是有多少骨髓间充质干细胞成功存活下来并分化成组织细胞，目前还都不得而知。若能在将来解决这一问题，将更加有力、清晰地阐明干细胞治疗股骨缺损的机制。此外，有文献指出，应用低氧诱导因子联合间充质干细胞治疗股骨缺损也能够取得良好的效果，这又可以为高原骨缺损的创伤修复提供一个可能的深入研究^[30]。

骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of rat femoral defects at high altitude

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