人脐血单个核细胞移植治疗急性一氧化碳中毒后迟发脑病1年随访

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2179-2184.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.008

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人脐血单个核细胞移植治疗急性一氧化碳中毒后迟发脑病1年随访

姚星宇¹，杨丽敏²，侯吉峰³，李伟伟³，李宁⁴，李光南⁵，张国华⁵

1满洲里南区医院内科，内蒙古自治区满洲里市 021400；2内蒙古医科大学基础医学院病原微生物与免疫实验中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；3内蒙古医学院研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；内蒙古医科大学附属医院，4影像科，5神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050

收稿日期:2014-02-09 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 张国华，主任医师，内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050
作者简介:姚星宇，女，1973年生，辽宁省沈阳市人，汉族，硕士，主任医师，主要从事脑血管病的研究及神经系统疾病的干细胞治疗。

Therapeutic efficacy of umbilical cord blood mononuclear cells on delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning: a 1-year follow-up

Yao Xing-yu¹, Yang Li-min², Hou Ji-feng³, Li Wei-wei³, Li Ning⁴, Li Guang-nan⁵, Zhang Guo-hua⁵

1Department of Internal Medicine, Southern District Hospital of Manzhouli, Manzhouli 021400, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Pathogenic Microbiology and Immunology Test Center, School of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3School of Graduate, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 4Department of Imaging, 5Department of Neurology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2014-02-09 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Zhang Guo-hua, Chief physician, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Yao Xing-yu, Master, Chief physician, Department of Internal Medicine, Southern District Hospital of Manzhouli, Manzhouli 021400, Inner Mongolia Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究报道在特定的体内外环境下，脐血间充质干细胞能够诱导分化成为包括神经干细胞在内的多种组织细胞。
目的：评价人脐血单个核细胞经腰穿途径移植后治疗急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的疗效及安全性。
方法：一氧化碳中毒后迟发性脑病患者60例随机分为2组。对照组给予高压氧及药物治疗；治疗组采用鞘内注射法将经密度梯度离心法分离出的人脐血单个核细胞移植到一氧化碳中毒性脑病患者的蛛网膜下腔，余治疗方法同对照组。分别于人脐血单个核细胞移植前、移植后3，9，12个月对患者进行简易精神状态检查法、改良Asworth肌肉痉挛程度分级及日常生活量表评分检查；比较两组患者MRI变化；同时对随诊患者行胸片、心电图及血生化检查，客观评价人脐血单个核细胞移植的安全性。
结果与结论：人脐血单个核细胞移植3，9，12个月，治疗组Asworth肌肉痉挛程度分级评分均显著低于对照组(P=0.032)；移植后9，12个月简易智力状况检查法及日常生活量表评分均显著高于对照组(P < 0.05)；两组患者神经功能在各时间点的变化趋势相似。人脐血单个核细胞移植后12个月MRI检查结果显示，治疗组患者MRI改善程度较对照组明显。提示鞘内注射移植人脐血单个核细胞治疗一氧化碳中毒后迟发脑病疗效优于高压氧治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 人脐血单个核细胞, 鞘内注射, 急性一氧化碳中毒后迟发脑病, 高压氧, 神经功能

Abstract:

BACKGROUND: Under a specific environment in vivo and in vitro, umbilical cord blood mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into various tissues and cells, including neural stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the safety and efficacy of human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation via lumbar puncture in the treatment of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning.
METHODS: Sixty patients with delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning were randomly divided into two groups: treatment group undergoing intrathecal injection of human umbilical cord blood mononuclear cells that were isolated using density gradient centrifugation method into the subarachnoid space of patients with delayed encephalopathy induced by acute carbon monoxide poisoning; control group undergoing hyperbaric oxygen and drug treatments. Mini-mental state examination (MMSE), improved Asworth muscle spasm degree and activity of daily living scale (ADL) were assessed in patients prior to and 3, 9, 12 months after
cell transplantation. The MRI changes of the two groups were compared. Meanwhile, lung X-ray, electrocardiogram and blood biochemical test were also measured to evaluate the safety of human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3, 9, 12 month after cell transplantation, the Asworth muscle spasm degree was significantly lower in the treatment group than the control group (P=0.032). At 9 and 12 months after cell transplantation, scores on MMSE and ADL were also higher in the treatment group than the control group (P < 0.05). Change of neurological functions in patients from two groups showed a similar tendency. At 12 months after cell transplantation, MRI examination showed better outcomes in the treatment group than the control group. These findings indicate that intrathecal injection of human umbilical cord blood mononuclear cells is superior to hyperbaric oxygen in the treatment of delayed encephalopathy induced by acute carbon monoxide poisoning

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Key words: stem cells, fetal blood, transplantation, carbon monoxide poisoning

中图分类号:

R394.2

姚星宇，杨丽敏，侯吉峰，李伟伟，李宁，李光南，张国华. 人脐血单个核细胞移植治疗急性一氧化碳中毒后迟发脑病1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2179-2184.

Yao Xing-yu, Yang Li-min, Hou Ji-feng, Li Wei-wei, Li Ning, Li Guang-nan, Zhang Guo-hua. Therapeutic efficacy of umbilical cord blood mononuclear cells on delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning: a 1-year follow-up[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2179-2184.

图/表（结果） 3

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引言

一氧化碳中毒又称煤气中毒，是当今发生率和死亡率最高的中毒之一^[1]，该病多发生于密闭或通风不良的高浓度一氧化碳空间内，每次发生常波及多人，甚至整个家庭。一氧化碳中毒对全身组织细胞均有毒性作用，对大脑皮质和海马区的损伤尤为严重。部分急性一氧化碳中毒患者在症状恢复后，经历两三周的假愈期，再次出现精神及意识障碍以及神经系统损害，称为一氧化碳中毒后迟发性脑病^[2]。一氧化碳中毒后迟发性脑病的发生极大地降低了患者的生活质量，给患者家庭社会带来巨大负担。

目前急性一氧化碳中毒所致脑损伤的治疗主要采用高压氧治疗为主及其他药物为辅的综合治疗^[3]，但治疗效果不甚理想。由脐血中分离出的脐血单个核细胞是一个异质性的细胞群，其内含有造血干细胞(非黏附细胞)、脐血间充质干细胞等多种细胞成分^[4]。国内外大量研究均报道了从脐血单个核细胞中可以分离出具有自我更新、多向分化和归巢特性的脐血间充质干细胞^[5]。在特定的体内外环境下，脐血间充质干细胞能够诱导分化成为包括神经干细胞在内的多种组织细胞^[6]。

近年来有研究表明新鲜分离的人脐血单个核细胞培养前即能表达nestin及MAP2等一些神经元特有分子^[7]，故临床上已有研究将人脐血单个核细胞作为良好的干细胞来源应用于神经系统疾病的治疗^[8]。作者尝试将人脐血单个核细胞通过鞘内注射途径移植入一氧化碳中毒后迟发性脑病患者体内，通过患者治疗前后神经功能评分、及MRI影像学变化，客观评价其对一氧化碳中毒性脑病的治疗效果，旨在为临床一氧化碳中毒后迟发性脑病的治疗提供新的的思路和更为有效的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：分组对比观察。

时间及地点：2009年1月至2013年1月在内蒙古医科大学附属医院完成。

对象：选择同期内蒙古医科大学附属医院神经内科及高压氧病房收治的一氧化碳中毒性脑病患者60例，随机分为治疗组(n=30)和对照组(n=30)，两组在性别、年龄、各项神经功能评分方面经统计学分析后差异无显著性意义 (P > 0.05)。

诊断标准：患者均符合一氧化碳中毒性脑病诊断标准^[9]，并经头颅CT或MRI证实。

纳入标准：①明确一氧化碳接触史，符合一氧化碳中毒性脑病诊断标准^[9]，头MRI或CT确诊。②患者及家属同意，并经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准。

排除标准：有心、肝、肾和其他脏器严重的器质性疾病者、凝血功能障碍、过敏体质及癫痫者。

材料：

脐血：依据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[10]，经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，在脐血采集前将采集方法和可能风险告知对方，产妇家属签署自愿捐献脐血志愿书；产妇无重大疾病及传染病，由妇产科医师采集在内蒙古医科大学附属医院出生的健康足月儿脐血80-120 mL。

主要试剂：宁夏中联达公司生产的脐血、骨髓脐血细胞处理试剂盒(Wealth lin Science Technology Inc. Canada)，脐血(内蒙古医科大学妇产科采集)。

方法：

人脐血单个核细胞的分离：按照Wealthlin Science TechnologyInc.Canada脐血干细胞处理试剂盒(由A、B、C液组成)步骤采用密度梯度离心法进行人脐血单个核细胞的分离，具体方法概括如下：将采集的脐血倒入A、B液后混匀，室温下静置30 min后可见红细胞沉降至最底层；吸取上清液，2 500 r/min离心5 min；弃上清液，收集细胞，至总体积50 mL，合并到一支离心管内；依照鸡尾酒添加法，将上一步所得到的细胞悬浮液利用鸡尾酒添加法加到装有25 mL C液的离心管中，即保证两液间分界清楚； 1 800 r/min 30 min离心后吸取中间云雾状薄层，加注生理盐水50 mL充分混匀，2 500 r/min 5 min；同样方法离心、洗涤4次，收集细胞悬液2 mL备用。

人脐血单个核细胞活性检测：将新鲜分离的人脐血单个核细胞用锥虫蓝检测细胞活性后调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹后备用。步骤如下：将10 μL新鲜人脐血单个核细胞及CM-DiI/DAPI成功标记后的人脐血单个核细胞稀释至 1 mL，加入体积分数0.5%锥虫蓝3 μL摇匀，将10 μL上述稀释液滴加到细胞计数板上，细胞蓝染为失活细胞。

治疗方法：

对照组：以YC 3200/0.3-18IV型号的多人空气加压舱治疗为主，患者意识清楚，进仓后升压时配合动作：捏住鼻子，使劲鼓气；浅昏迷患者只要可以做吞咽动作，就可以进仓。常用2个大气压，一氧化碳中毒患者根据病情需要治疗一至两个疗程，1个疗程12 d，1次/d，2 h/次。治疗流程如下：升压25 min，吸氧30 min，休息10 min，吸氧30 min，降压25 min。治疗期间同时根据病情应用激素、脱水降颅压、抗癫痫、脑细胞代谢促进剂、抗感染、抗震颤麻痹药物、维持水、电解质和酸碱平衡、营养支持等对症治疗及康复训练。

治疗组：在高压氧、药物及康复治疗基础上，于患者脑水肿消退及生命体征平稳后，经腰穿途径将新鲜分离人脐血单个核细胞移植到一氧化碳中毒性脑病患者体内，细胞浓度为(6.0-7.0)×10⁹L^-¹，余治疗同对照组。

评估指标：①神经功能缺损评分：采用简易精神状态检查表(MMSE)^[11]、改良Asworth肌肉痉挛程度分级、日常生活量表ADL评分^[12]。②Ashworth分级：0级：无肌张力增高；1级：轻度增高，被动活动时有一过性停顿；2级：较明显增高，活动未受限；3级：明显增高，被动活动困难；4级：肢体僵硬，被动活动不能。

主要观察指标：①分别于人脐血单个核细胞治疗前及治疗后12个月行MRI检查，观察影像学变化。②分别在移植前及移植后3，9，12个月通过简易智力状况检查法MMSE、改良Asworth肌肉痉挛程度分级，日常生活量表ADL评分对患者神经功能损伤程度进行评定。③治疗组患者心电图、血液生化及肺部X射线片检查。

统计学分析：使用SPSS 16.0软件包统计分析，检验水准a =0.05(双侧检验)；计数资料采百分率描述统计数据，并采用χ²检验进行统计分析；计量资料采用x(_)±s描述统计数据，治疗组与对照组相同时间点多个样本均数之间的比较经正态分布检验且方差齐则采用单因素方差分析；组内比较采用重复测量设计分析。

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讨论

一氧化碳与血红蛋白的结合力是氧的300倍，且二者一旦结合就难以分解，因此造成机体严重的低氧血症，使脑组织缺氧，发生脑细胞及神经组织的变性，继发脑血管病变，其中以大脑白质、苍白球、基底节区损害严重，海马区及小脑则相对轻，重者常出现脑水肿。国内外学者对一氧化碳中毒后迟发性脑病的发病机制的研究结果表明一氧化碳中毒后迟发性脑病的发生是细胞毒性^[13]、自由基和脂质过氧化神经递质代谢异常^[14-15]、脑变态反应^[16]、脑循环障碍^[17]、兴奋性氨基酸等缺氧及一氧化碳直接毒性的综合作用^[18]，诱发了神经细胞凋亡^[19]、白质脱髓鞘的病理改变^[20]。对于一氧化碳中毒的治疗，目前最常用的方法是高压氧治疗，它能迅速纠正机体缺氧状态、有效改善循环、加速细胞的再生和修复等积极作用，在一定程度上可以缓解一氧化碳中毒患者的临床症状，因此，对于急性期一氧化碳中毒患者，应积极进行高压氧治疗。但是，已有研究表明自由基所引发的脂质过氧化作用参与了迟发脑病的脑组织损伤，反复使用高压氧可使体内的氧自由基生成增加，从而加重脑损伤。有研究者通过观察高压氧和常压氧治疗急性一氧化碳中毒的对比分析，指出在治疗一氧化碳中毒迟发脑病的疗效上，两者差异不大^[²⁰^]。故高压氧治疗及对症支持治疗不能从根本上治疗已发生一氧化碳中毒后迟发性脑病患者的病情。

脐血来源广泛，采集方便，对供者不会造成任何损伤^[21]。人脐血中富含造血干/祖细胞、内皮干/祖细胞以及间充质干细胞等不同种类的前体细胞，且有很强的增殖分化能力^[22-23]，且脐血干细胞更易于分离^[24]。人脐血单个核细胞是一个异质性的细胞群，除了含有造血干细胞(非黏附细胞)外，还存在间充质干细胞^[25]。脐血间充质干细胞的形态与骨髓间充质干细胞相似，也是一类具有多向分化潜能的组织干细胞^[26]。

本课题组前期试验通过免疫荧光技术已经证实新鲜分离的人脐血单个核细胞中存在可以表达nestin及神经元特异性烯醇化酶的细胞，人脐血单个核细胞在未加任何诱导剂的情况下经培养后可见形态各异的具有类似轴突及树突状粗长突起的神经样细胞^[27]，上述实验结果为脐血单个核细胞的直接移植提供了一定的依据。且已有动物实验证实人脐血单个核细胞移植到裸鼠体内不具有成瘤性^[28]，这些都提示脐血单个核细胞具有可以直接治疗神经系统疾病的可能。

国内外大量研究已经证实血脑屏障对脐血单个核细胞有选择通透性，并受多因素的调节。血脑屏障所固有的簿弱环节可能是脐血单个核细胞能够迁移入脑的因素之一^[29]；脑损伤后血脑屏障固有结构破坏，大量炎性递质及调节因子释放，可以通过酶系统及内皮细胞的转运系统改变血脑屏障的通透性^[30]；脐血单个核细胞可以表达多种细胞间黏附分子和抗原性黏附分子的，这些黏附分子间的相互作用可以促使脐血单个核细胞与基膜、血管内皮细胞发生特异性结合；另外血脑屏障内皮细胞所表达的E-选择素还能和内皮细胞表面的路易斯寡糖发生特异性的黏附，这种蛋白分子间的特异性作用可以使脐血单个核细胞稳固地黏附于脑毛细血管内皮细胞及基膜，从而启动其穿过血脑屏障向脑损伤部位迁移^[31]；受损的脑组织所释放的化学物质及损伤激活细胞分泌的一系列具有生物活性的趋化因子和多种细胞因子等相互作用，也可以促进脐血单个核细胞向病灶区迁移^[32]。

国内外学者研究发现细胞移植后其促进神经功能恢复的可能机制主要有以下几个可能因素：受损的神经组织由于受到局部微环境及移植细胞自身分泌的细胞因子^[33]、递质、激素、代谢产物等影响，能使移植细胞迁移到受损部位^[34-35]，从而起到替代损伤的神经组织。同时移植细胞还能释放某些蛋白因子，改善宿主损伤区域微环境，促进受损宿主神经元的修复或者减少宿主神经元的凋亡^[36]；移植细胞可能为轴突再生提供良好的微环境，促使轴突再生，建立轴突间的联系，恢复信号传导^[37]；移植细胞有可能分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，替代部分受损的宿主细胞的功能，至于如何减少宿主细胞的凋亡、坏死并恢复受损细胞的功能，机制目前有待进一步研究^[38-39]。

本实验将体外分离得到的脐血单个核细胞经腰椎穿刺部位注入患者蛛网膜下腔，结果显示人脐血单个核细胞移植3个月与对照组MMSE、ADL评分差异无显著性意义(P > 0.05)，但二者Asworth肌肉痉挛程度分级差异有显著性意义(P < 0.05)；治疗组人脐血单个核细胞移植9、12个月3种评分与对照组比较均有显著性意义(P < 0.05)；不同时间点组内比较患者的神经功能评分差异均有显著性意义；两组患者各组神经功能在各时间点的变化趋势相似；人脐血单个核细胞移植后12个月MRI检查结果显示，治疗组患者MRI改善程度较对照组明显。随诊患者均行头颅CT、心电图、肺部X射线片及血液生化检查，至今未见异常，在未来的一两年内将继续监测予以充分证实其安全可行。

上述对比研究结果显示急性一氧化碳中毒后迟发性脑病经细胞移植治疗后，肌肉痉挛程度、认知功能障碍及行为执行能力改善都较单用高压氧治疗发生早、治疗效果更加明显。其中肌肉痉挛程度改善最为显著。人脐血单个核细胞治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病机制可能与骨髓间充质干细胞治疗该病相似，已有动物实验结果显示骨髓间充质干细胞治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病动物模型后上调了星形胶质细胞的反应性，同时通过细胞本身以及它与其他细胞的协同作用分泌了多种神经营养因子改变了局部微环境，改善了神经髓鞘的营养状态，抑制了自由基及各种兴奋性氨基酸的损伤，促进了脱髓鞘的再生；另外这些神经营养因子还增强了星形胶质细胞的Na⁺依赖性转运体经过“谷氨酸-谷氨酰胺”循环清除兴奋性神经递质的功能，减轻了氧化应激反应而起到保护作用^[40]。

综上，人脐血单个核细胞的的低免疫原性^[41]、免疫逃逸、免疫调节功能及脑组织做为免疫豁免器官的特性^[42]，是异基因人脐血单个核细胞移植治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病基础，其治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病机制还需要在今后的研究中进一步探讨，人脐血单个核细胞移植的安全性也有待于进一步观察。

人脐血单个核细胞移植治疗急性一氧化碳中毒后迟发脑病1年随访

Therapeutic efficacy of umbilical cord blood mononuclear cells on delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning: a 1-year follow-up

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