胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2173-2178.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.007

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胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

李秀英¹，白金萍²，仲苓芝²，李雪³，杨麒巍¹，刘颖男¹，王轶敏^1，4

1吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林省长春市 130033； 2吉林大学基础医学院病理学教研室，吉林省长春市 130021；3延边大学药理教研室，吉林省延吉市 133002；4吉林省中科生物工程有限公司，吉林省长春市 130012

收稿日期:2014-01-20 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 王轶敏，博士，唐敖庆特聘教授，吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林省长春市 130033；吉林省中科生物工程有限公司，吉林省长春市 130012
作者简介:李秀英，女，1986年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，吉林大学在读博士，主要从事干细胞等方面的研究。
基金资助:
吉林省自然科学基金(20130101167JC)，课题名称：几种组织间充质干细胞免疫原性比较及临床自身免疫性疾病的应用

Comparison of proliferative and adipogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from fetal tissue and bone marrow

Li Xiu-ying¹, Bai Jin-ping², Zhong Ling-zhi², Li Xue³, Yang Qi-wei¹, Liu Ying-nan¹, Wang Yi-min^{1, 4}

1Central Laboratory, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China; 2Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; 3Department of Pharmacology, Yanbian University, Yanji 133002, Jilin Province, China; 4Jilin Zhong Ke Bio-engineering Co., Ltd., Changchun 130012, Jilin Province, China

Received:2014-01-20 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Wang Yi-min, M.D., Professor, Central Laboratory, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China; Jilin Zhong Ke Bio-engineering Co., Ltd., Changchun 130012, Jilin Province, China
About author:Li Xiu-ying, Studying for doctorate, Central Laboratory, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jilin Province, No. 20130101167JC

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞最先在骨髓中发现，且骨髓间充质干细胞的相关研究也最多，但是骨髓间充质干细胞来源有限且含量极低。近年来，已经从人胚胎组织分离出间充质干细胞，其与骨髓间充质干细胞在生物学特性上有很多相似之处，但是二者的成脂诱导能力比较尚无明确报道。
目的：比较人胚胎组织与骨髓来源间充质干细胞体外增殖能力及成脂诱导能力。
方法：采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞，胶原酶消化法获得胚胎组织间充质干细胞。流式细胞术鉴定两种间充质干细胞表面分子标记。用细胞计数方法检测两种间充质干细胞增殖能力。分别向两种细胞培养体系中加入成脂诱导剂诱导14 d，经油红O染色后观察并计数，计算不同来源间充质干细胞的成脂诱导分化率。
结果与结论：从两种不同组织中均可获取梭形贴壁的间充质干细胞，表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105均呈阳性表达，CD14、CD34和CD45均为阴性表达；胚胎组织间充质干细胞的增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞(P < 0.01)。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经过成脂诱导液诱导14 d后，油红O染色结果均为阳性，但是骨髓间充质干细胞体外成脂能力明显强于胚胎组织间充质干细胞(P < 0.01)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 胚胎组织, 骨髓, 间充质干细胞, 增殖能力, 成脂分化能力, 吉林省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells were first discovered in the bone marrow, and the number of studies concerning bone marrow mesenchymal stem cells is also the most. But the bone marrow mesenchymal stem cells with limited sources have the very low content. In recent years, mesenchymal stem cells have been isolated from human fetal tissue, which are similar to bone marrow mesenchymal stem cells in term of biological properties, but both of them have not been reported clearly in comparison of their adipogenic abilities.
OBJECTIVE: To compare the proliferative and adipogenic differentiation capacity of human bone marrow and fetal tissue-derive mesenchymal stem cells.
METHODS: Mesenchymal stem cells were obtained from the bone marrow by adherence culture and from fetal tissue by collagenase digestion. Cells were identified by flow cytometric assay. Proliferative potential of mesenchymal stem cells were detected by cell counting method. After adipogenic induction for 14 days, oil red O staining was used for cell counting, and adipogenic differentiation capacities of mesenchymal stem cell from two sources were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells in spindle shape were successfully harvested from both of human bone marrow and fetal tissue, which were positive for CD73, CD90 and CD105, and negative for CD14, CD34 and CD45. The proliferative capacity of fetal tissue-derived mesenchymal stem cells was stronger than that of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.01). After adipogenic induction for 14 days, mesenchymal stem cells from two sources were both positive for oil red O, but the in vitro adipogenic capacity of the bone marrow mesenchymal stem cells was stronger than that of fetal tissue-mesenchymal stem cells (P < 0.01).

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Key words: mbryonic stem cells, bone marrow, mesenchymal stem cells, cell proliferation, adipogenesis

中图分类号:

R394.2

李秀英，白金萍，仲苓芝，李雪，杨麒巍，刘颖男，王轶敏. 胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2173-2178.

Li Xiu-ying, Bai Jin-ping, Zhong Ling-zhi, Li Xue, Yang Qi-wei, Liu Ying-nan, Wang Yi-min. Comparison of proliferative and adipogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from fetal tissue and bone marrow[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2173-2178.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态学观察分离获得的胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞体外培养48 h后，呈梭形及短梭形贴壁生长，多次换液继续培养，梭形细胞分裂速度明显较快，7-10 d融合度达到80%-90%。传代培养至第3代时，间充质干细胞形态基本一致，均为长梭形(图1A，B)。

2.2 流式细胞术检测结果流式细胞仪检测第3代胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞低表达或不表达造血干细胞表面分子标记物，胚胎组织间充质干细胞表达CD14、CD34和CD45的阳性细胞比率分别为1.0%，2.1%和1.6%，骨髓间充质干细胞表达CD14、CD34和CD45的阳性细胞比率分别1.2%，1.1%和1.1%。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞中表达CD44，CD73，CD90和CD105的阳性细胞比率均达99%以上(图2)。

2.3 间充质干细胞的增殖能力根据胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞计数结果绘制成细胞生长曲线，显示间充质干细胞从第2代开始，增殖能力就出现明显差异(图3)。胚胎组织间充质干细胞增殖速度明显高于骨髓间充质干细胞，胚胎组织间充质干细胞倍增时间约为34 h，而骨髓间充质干细胞的倍增时间为70 h。两种间充质干细胞继续传代培养，胚胎组织间充质干细胞传到30多代未出现衰老现象，并且增殖能力较好；而骨髓间充质干细胞只能传20代左右，增殖速度减慢，出现衰老现象，部分细胞胞浆内出现空泡(图1C，D)。

2.4 间充质干细胞成脂诱导的形态观察成脂诱导第6天，骨髓间充质干细胞由梭形变成圆形或多角形，体积增大，小部分细胞质内开始出现很小的折光性很强的脂滴，位于核周。在第8天胚胎组织间充质干细胞胞浆周围也出现小脂滴，细胞形态也发生改变，变为椭圆形或多角形。随着诱导天数的增加，脂滴逐渐变大且诱导成脂的细胞数也在增加。油红O染色鉴定间充质干细胞含有大小不等的脂滴，脂滴被染成红色(图4)。诱导后骨髓间充质干细胞油红O染色阳性率与胚胎组织间充质干细胞差异有显著性意义(P < 0.01，图5)。

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引言

材料方法

设计：细胞生物学对比观察。

时间及地点：实验于2013年1至7月在中日联谊医院中心实验室完成。

材料：

胚胎组织与骨髓间充质干细胞增殖能力及成脂诱导能力检测试剂和器材：
试剂和器材	来源
α-MEM培养基、胎牛血清、成脂诱导液	Gibco
磷酸缓冲盐溶液、胰蛋白酶、油红O、二甲基亚砜	Sigma
碱性纤维细胞生长因子	Peprotech
流式检测抗体CD14、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90 和CD105	BD
青霉素/链霉素(双抗)混合液	HyClone
培养皿、6孔板、12孔板及冻存管	Invitrogen

原代胚胎组织间充质干细胞由吉林省中科生物技术公司惠赠。骨髓血取自5例健康志愿者(20-45岁)，均签署知情同意书。

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离、培养和冻存：无菌条件下获得5-10 mL骨髓血标本后，采用全骨髓法对其进行分离。向内加入2倍体积含2%双抗的磷酸缓冲盐溶液， 1 000 r/min离心10 min，弃掉上层液体。再加入含2%双抗的磷酸缓冲盐溶液，1 000 r/min离心10 min，弃掉上层液体。然后用含体积分数为10%胎牛血清10 μg/L碱性纤维细胞生长因子及1%双抗的α-MEM培养液重悬细胞，将细胞悬液移入培养皿中。48 h后换液并尽可能的弃掉红细胞，以后每隔1 d换液。将红细胞全部换洗掉后，换液频率改为每周2次。待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃掉上层液体，加入1 mL细胞冻存液体(培养基原液∶胎牛血清∶二甲基亚砜=5∶4∶1)悬浮，移入冻存管内，密封后4 ℃放置30 min，20 ℃放置2-4 h，-80 ℃过夜，然后移入液氮保存。

胚胎组织间充质干细胞分离、培养和冻存方法：无菌条件下获得胚胎标本后，含2%双抗的磷酸缓冲盐溶液冲洗2遍，加入0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃消化2 h，用100目的细胞筛网过滤掉未消化的组织碎片，细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入含体积分数为10%胎牛血清 10 μg/L碱性纤维细胞生长因子和1%双抗的α-MEM培养液重悬细胞，将细胞悬液移入培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度细胞培养箱内。每周换液2次，待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃掉上层液体，加入1 mL细胞冻存液体(培养基原液∶胎牛血清∶二甲基亚砜=5∶4∶1)悬浮，移入冻存管内，密封后4 ℃放置30 min，20 ℃放置2-4 h，-80 ℃过夜，然后移入液氮保存。

骨髓间充质干细胞和胚胎组织间充质干细胞的传代培养方法：待骨髓间充质干细胞和胚胎组织间充质干细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min后，加入α-MEM培养液悬浮平均分配至3个培养皿中。

间充质干细胞鉴定：将进入指数生长期的第3代胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，以0.25%胰酶消化，细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃掉上清。磷酸缓冲盐溶液清洗2遍后细胞计数，分装至1.5 mL EP管中，每管的细胞数为10⁶，1 000 r/min离心5 min，弃上清，拍散细胞，分别向每管加入CD14，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90及CD105单克隆抗体。4 ℃避光孵育30 min后，向各管加入1 mL PBS离心，重复洗细胞2次后，用流式细胞仪检测^[8-9]。

间充质干细胞增殖能力的检测：将处于指数生长期的第1代胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，以每孔10⁵细胞密度接种于6孔板，每种细胞3个复孔，放置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度细胞培养箱内，培养4 d后消化离心计数，再以每孔10⁵细胞密度接种于6孔板中，4 d后再消化计数，如此计数直到第8代。以Lg(累计细胞计数)为纵坐标，细胞代次为横坐标绘制生长曲线。每种间充质干细胞选择5个样本^[10]。

间充质干细胞成脂诱导及鉴定：将两种不同来源的第4代胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞接种到12孔板中，待其融合度达到70%-80%加入成脂诱导液，每种细胞3个复孔，并有对照孔。每周换液2次，诱导14 d后，油红O染色，显微镜下观察，照相。细胞中含有被染成红色的脂肪颗粒记为成脂肪诱导阳性细胞。高倍镜下任选10个视野，计算镜下阳性细胞所占比率。每种间充质干细胞选择3个样本进行诱导。

主要观察指标：①胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞形态。②流式细胞仪检测胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表面标记物表达。③胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力。④胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。

统计学分析：实验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

间充质干细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一细胞且效率低而较少采用。消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ或Ⅱ以及透明质酸

酶。胶原酶具有消化作用缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小等优点，故采用胶原酶消化分离胚胎组织间充质干细胞。同时采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞，即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁的细胞，如造血系细胞、内皮细胞等，达到分离纯化骨髓间充质干细胞的目的。两种间充质干细胞在传代培养3代后基本上可以获得成分单一的间充质干细胞，即在细胞形态上基本一致，均呈典型的成纤维样细胞形态，排列成旋涡状、网状或辐射状^[11-13]。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞继续传代培养后，胚胎组织间充质干细胞可达30代，细胞形态、生长速度等生物学特性均无明显变化，没有出现衰老或分化迹象。但是骨髓间充质干细胞传代培养至20代时增殖速度缓慢，部分细胞呈多角形，出现衰老现象。故胚胎组织间充质干细胞在体外培养过程中保持干细胞特性的能力更持久。且细胞计数结果显示胚胎组织间充质干细胞增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞。

流式细胞术鉴定分离的细胞，结果显示99%以上的骨髓间充质干细胞和胚胎组织间充质干细胞表达CD44、CD73、CD90和CD105等抗原标记，1%的骨髓间充质干细胞和胚胎组织间充质干细胞表达CD14、CD34和CD45等造血系细胞表面特异性抗原，这说明从胚胎组织和骨髓中分离出的细胞符合间充质干细胞的表达特征，且不具有造血细胞特性^[14]。

近年来，胚胎组织间充质干细胞也越来越受到研究者的关注。据报道，胚胎组织间充质干细胞可以分化为上皮细胞、平滑肌细胞、类肝细胞等^[15-19]。但是胚胎组织间充质干细胞与骨髓间充质干细胞在成脂分化潜能上，哪一种间充质干细胞更有优势，目前尚没有明确报道。成脂诱导分化过程中观察，骨髓间充质干细胞中脂滴出现较早，诱导第6天即可见细胞体积变大，胞浆丰富，且部分细胞胞浆内可见少量脂滴，随着诱导时间延长，成脂细胞数量及胞浆内脂滴数逐渐增多，脂滴也逐渐变大；而胚胎组织间充质干细胞在诱导第8天才出现少量体积非常小的脂滴，且细胞体积变化不大，并且随着诱导时间的延长细胞体积变化不明显。诱导第14天，油红O染色结果显示骨髓间充质干细胞成脂细胞阳性率明显高于胚胎组织间充质干细胞。本实验结果显示胚胎组织间充质干细胞的成脂率很低，小于20%。但是有研究报道胚胎组织间充质干细胞具有很强的成脂能力，其脂肪诱导的阳性率平均为80%，各代细胞的成脂能力无明显差异^[20]。这种结果可能由实验条件和实验试剂不同造成的。

近年来研究表明，间充质干细胞易于外源基因的导入，成为基因治疗的理想靶细胞，因此也可用于多种疾病的基因治疗，如心血管疾病，神经系统疾病和肝脏疾病等^[21-26]。目前为止研究最早最多的是骨髓间充质干细胞，但是骨髓间充质干细胞发育分化更接近终末状态，在体外培养更容易衰老分化，而胚胎组织间充质干细胞在体外增殖能力较强且可以培养到30多代，增殖能力、体内归巢能力均强于骨髓间充质干细胞，且免疫原性较小^[27-35]。有研究报道胚胎组织来源的间充质干细胞不会引起成体来源干细胞所导致的T淋巴细胞增殖反应，并且在丝裂原诱导下能够抑制T淋巴细胞增殖，具有调节T淋巴细胞免疫功能等特点^[36-43]。所以应用胚胎组织来源的间充质干细胞有其独特的优越性。这些优势显示了这种来源于人胚胎组织间充质干细胞，可能会成为组织工程和细胞治疗领域的一种非常好的选择。

本实验通过对胚胎组织间充质干细胞及骨髓间充质干细胞的增殖及成脂能力的观察比较，为更好的选择间充质干细胞进一步应用于临床提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

Comparison of proliferative and adipogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from fetal tissue and bone marrow

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