C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1737-.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.016

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C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备

李颖，龚亚飞，陈欣洁

广州医科大学附属第三医院妇产科研究所，广东省广州市 510150

修回日期:2014-01-05 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 陈欣洁，博士，主任技师，广州医科大学附属第三医院妇产科研究所，广东省广州市 510150
作者简介:李颖，女，1983年生，广西壮族自治区桂平市人，汉族，广州医科大学在读硕士，主要从事生殖医学与干细胞研究。
基金资助:
广东省高等学校科技创新项目(2012KJCX0087)，人多精受精合子作为体细胞核移植受体的发育潜能研究

Biological properties of C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers

Li Ying, Gong Ya-fei, Chen Xin-jie

Institute of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Revised:2014-01-05 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Chen Xin-jie, M.D., Chief technician, Institute of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Li Ying, Studying for master’s degree, Institute of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
Scientific and Technology Innovation Project of Universities in Guangdong, No. 2012KJCX0087

摘要/Abstract

摘要：

背景：昆明小鼠胚胎成纤维细胞是目前最常用的饲养层细胞，C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层的研究鲜有报道。

目的：体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞，制备饲养层，力求扩大小鼠胚胎成纤维细胞的来源。

方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞，观察其生物学特性，研究其生长规律，并制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，检测干细胞在所制备饲养层上的生长状态。

结果与结论：不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生长状态好，获得的成纤维细胞数量多，增殖活跃。在细胞冻存后1，2周、1，3，6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞在第2-5代增殖旺盛，第6代以后细胞增殖出现明显下降。种植到培养皿上的C57BL/6小鼠饲养层细胞在种植后3 d内活力高，种植4 d以后细胞活力急剧下降。所以C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞来源的饲养层的最佳使用时间为灭活后3 d内，C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层一样，能很好地支持胚胎干细胞及诱导多能干细胞生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 成纤维细胞, 小鼠胚胎, C57BL/6小鼠, 细胞增殖, 细胞活力, 饲养层

Abstract:

BACKGROUND: Kunming mouse embryonic fibroblasts are the most common feeder layers at present, and there are rare reports addressing C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts as feeder layers.

OBJECTIVE: To separate and culture C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts in vitro, and produce feeder layers to enlarge the resources of mouse embryonic fibroblasts.

METHODS: C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts were isolated and cultured by trypsin digestion method in vitro. The biological characteristics and growth rule of the fibroblasts were investigated, then the feeder layers for the cell culture were produced. The growth of cell colonies on the prepared feeder layer was tested.

RESULTS AND CONCLUSION: C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts grew well with a large amount, by trypsin digestion method at different concentrations. There was no significance in the survival rate after cryopreservation for 1 week, 2 weeks, 1 month, 3 months and 6 months. The cells were proliferative from the second to fifth passage and declined sharply after the sixth passage. The planted mouse embryonic fibroblasts feeder layers had a high activity within 3 days, but got a sharp decline after 4 days. So it is best to use C57BL/6 mouse embryonic fibroblast feeder layers within 3 days after they’re inactivated. C57BL/6 mouse embryonic fibroblast feeder layer can support embryonic stem cells and induce pluripotent stem cells to grow as Kunming mouse embryonic fibroblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: mice, embryonic development, fibroblasts, cell proliferation, trophoblasts, stem cells

中图分类号:

R318

李颖，龚亚飞，陈欣洁. C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1737-.

Li Ying, Gong Ya-fei, Chen Xin-jie. Biological properties of C57BL/6 mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1737-.

图/表（结果） 5

2.1 原代和传代后的成纤维细胞形态学观察 C57BL/6小鼠原代成纤维细胞种植在培养皿上培养6-10 h细胞已完全贴壁，细胞向外伸出伪足形成多角形、梭形或不规则形等多种形状，中间有圆形或卵圆形核，大小不一，胞浆含有少量粗大颗粒，细胞群呈旋涡状或流线状生长(图1A)。姬姆萨染色显微镜下见，胞浆染色偏碱，内有大量嗜天青颗粒，染色质呈粗颗粒状，核膜清晰，核仁较大，数量从1到数个不等；杂细胞较多，如上皮样细胞、脊椎细胞(图1B，C)。随着传代次数增加，细胞越来越纯，至第3代可得到较纯的成纤维细胞，细胞形态逐渐趋于一致，大部分细胞的胞质形成两三个突起，呈梭形，少数为圆形或不规则形(图1D)。第5代以后，细胞伪足增多，且有分叉，细胞内颗粒增多，细胞立体感减弱，呈老化状态(图1E)。2.2 复苏后的成纤维细胞存活率 对冻存后1，2周、1，3，6个月的原代成纤维细胞进行复苏，用锥虫蓝染色法测定细胞存活率。结果显示，原代成纤维细胞在冻存后半年内复苏的细胞存活率稳定在一个恒定的水平，不同时间复苏的细胞存活率差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 EdU检测成纤维细胞增殖变化 EdU标记的细胞荧光染色显示，P2-P5代的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力较强，在种植后5 d细胞数量与时间成正相关。种植后2 d细胞增殖较慢，从第3天开始细胞快速增殖，至第5天细胞数量达高峰，从第6天开始细胞数量有所下降，但仍维持在一个较稳定的平台期。第7天开始进入衰退期，细胞数量下降较大(图2)。而第6代的成纤维细胞已无明显的细胞增殖期和对数生长期，生长几近停滞(图3)。

2.4 培养天数对成纤维细胞饲养层质量的影响 用MTT法测培养1-7 d的feeder活力(图4)。可见饲养层细胞在种植后3 d内活力较高，三者比较差异无显著性意义(P > 0.05)；而种植超过3 d的feeder活力显著下降，与前3 d比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞在不同品系成纤维细胞饲养层上生长状况 人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞在种植后三四天形成典型的干细胞克隆，细胞排列紧密，核质比高，呈典型“鸟巢”状或椭圆形集落，每培养5-7 d传代1次，可传30代以上保持未分化状态(图5)。

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引言

材料方法

设计：细胞体外学观察实验。

时间及地点：于2013年1至7月在广州医科大学附属第三医院妇产科研究所完成。

材料：

实验动物：健康C57BL/6小鼠、昆明小鼠6-8周，雄性3月龄，SPF级，购自广东省实验动物中心，许可证号： SCXK(粤)2008-0002。小鼠雄、雌鼠1∶2合笼，次日早晨检查有阴栓者记为孕0.5 d，以此推算雌鼠怀孕日龄。

人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源：前期实验制备，来源于广州医科大学附属第三医院妇产科研究所。

实验方法：

原代成纤维细胞分离与培养：①颈椎脱臼法处死怀孕13.5 d的C57BL/6小鼠，泡于体积分数75%的乙醇里两三分钟。②在无菌状态下剖腹剥出胚胎，将其转移到含1%双抗的PBS的培养皿中清洗三四次至溶液清澈。③去除胎鼠的头、尾、四肢、内脏，仅保留躯干，PBS洗涤躯干3次。④用眼科剪将剩余躯干组织剪成泥状(剪5-10 min)，将组织转移至离心管中，加入0.05%胰蛋白酶(EDTA)，用巴氏吸管轻轻吹打数次后置于37 ℃水浴箱消化5 min。期间取出离心管轻轻摇晃30 s-1 min。⑤将单细胞悬液收集于另一离心管中，加入等量培养基终止消化。⑥剩余组织块再加入0.1%胰蛋白酶(EDTA)消化5 min，收集细胞悬液于上离心管中并以等量培养基终止消化。⑦最后剩余组织块加入0.15%胰蛋白酶(EDTA)消化5 min，收集细胞悬液于同一离心管中，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，成纤维细胞培养液重悬细胞沉淀。⑧细胞接种至10 cm培养皿中，约每个培养皿接种一个胚胎，在37 ℃，体积分数5%CO₂，95%湿度培养箱内培养。24 h后更换新鲜培养基，并对原代成纤维细胞进行Giemsa染色。成纤维细胞的传代：当原代成纤维细胞达到90%汇合时需进行消化传代。按1∶2-1∶4比例接种至新的培养皿，视细胞密度两三天传1代。三四代后便可得到纯化的成纤维细胞。

成纤维细胞冻存：用0.25%胰酶消化细胞后，加入等体积的成纤维细胞培养基终止消化；用巴氏吸管把贴壁细胞吹落，1 000 r/min转速离心5 min，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞沉淀，分装入冻存管。

成纤维细胞复苏及存活率测定：在细胞冻存后1，2周、冻存后1，3，6个月每次取3管冻存的原代成纤维细胞进行复苏，锥虫蓝染色测定细胞存活率。将冻存管迅速从液氮罐中取出，迅速置入37 ℃水浴箱中，使之快速溶解，将细胞悬液移入15 mL离心管中，缓慢滴入培养基至5 mL，混匀，取少量细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以1∶1混匀，在 3 min内用血细胞计数板在相差显微镜下分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求复苏后的活细胞率：细胞存活率(%)=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)×100%。

EdU标记法检测细胞增殖情况：将P1-P5代达90%汇合度的成纤维细胞用胰酶消化后，重悬，接种至24孔板(P2-P6代)，接种密度为1×10⁴/孔，培养1，2，3，4，5，6，7，8 d后加入终浓度为50 µmol/L的EdU培养基，在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育8 h，用体积分数3.7%甲醛固定，0.5%Triton X-100通透，加入染色反应液Click-iT™避光、室温孵育30 min；除去染色反应液后，加入背景核染料Hoechst33342，避光、室温孵育30 min；PBS清洗3次，激光共聚焦扫描显微镜下观察、拍照。图像定量分析使用Image J软件。

成纤维细胞饲养层的制备：当P3代成纤维细胞汇合生长至90%左右时，将培养基换成含10 mg/L丝裂霉素C培养液，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中作用2.5 h；用PBS洗3-5次去除残留的丝裂霉素C；加入0.25%胰酶消化后加成纤维细胞培养基终止，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为5.0×10⁷L^-1，每孔加200 µL细胞悬液接种到96孔板，在37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。分别在种植后1-7 d间隔24 h用MTT法测定feeder活力。

MTT法检测成纤维细胞饲养层活力：feeder终止培养前4 h每孔加入5 g/L MTT溶液20 µL，继续培养4 h后，小心吸弃孔内培养上清液，再加入150 µL/孔DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值(A值)，每天测6个复孔，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞活力曲线。饲养层进行胚胎干细胞和诱导性多能干细胞培养：将C57BL/6小鼠和昆明小鼠胚胎成纤维细胞来源的饲养层(制备过程同C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞饲养层)以3×10⁴/cm²密度种植在0.1%明胶包被的培养皿中，用成纤维细胞培养基培养24 h后，更换为干细胞培养基，将人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞接种至饲养层中培养，显微镜下观察人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞在不同品系成纤维细胞饲养层上生长状况。

主要观察指标：①原代和传代的成纤维细胞生长形态。②复苏后的成纤维细胞存活率。③EdU标记成纤维细胞增殖图。④培养天数对丝裂霉素C处理后的成纤维细胞活力的影响。⑤生长于饲养层上的胚胎干细胞和诱导多能干细胞形态。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件分析实验数据，采用Dunnett-t 检验，对数据做差异的显著性分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

为满足胚胎干细胞和诱导多能干细胞培养需要，研究者们尝试使用各种饲养层细胞并对其生物学特性以及对干细胞生长的支持作用进行深入探索。各种饲养层中以成纤维细胞最经典，应用最成熟^[10-16]。目前国内制备成纤维细胞饲养层最常用的是昆明白小鼠，它具有适应性强，繁殖能力高，容易获取等优点^[18-21]。国内使用C57BL/6小鼠制备成纤维细胞饲养层报道甚少。干细胞培养需要大量的饲养层细胞，由于小鼠之间的品系差异，不同品系小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性可能有所不同，从而造成饲养层性质的差异，影响干细胞的培养。为了进一步扩大饲养层的来源，实验从C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的生物学特性和饲养层制备方面进行研究，探索该品系小鼠的成纤维细胞饲养层是否适用于人胚胎干细胞及诱导性多能干细胞的培养。

制作原代成纤维细胞的关键环节是胰酶消化。原代细胞比较娇嫩，0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)消化力较强，容易出现消化过度造成细胞损伤^[22]，从而导致细胞贴壁率、存活率及增殖水平下降。0.05%胰蛋白酶较温和，但最终得到的细胞量少。实验采用不同胰蛋白酶浓度由低到高、短时多次消化法获取细胞，得到的细胞数量多，状态好，是一种较理想的分离成纤维细胞方法^[23]。对冻存后半年内不同月份复苏的原代成纤维细胞进行存活率测定，发现其稳定维持在一个正常较高的水平，表明C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞对低温环境耐受力好，生命力强，适合一次大批量制备冻存后长期使用，以满足增殖迅速的人胚胎干细胞及诱导性多能干细胞培养需要。

EdU标记检测技术是通过加入人工合成的 DNA 成分(EdU)和结合荧光染色定量分析细胞的增殖^[24-25]。作为一种新型的非放射性同位素细胞增殖检测方法，可以快速、有效地检测处于S期细胞的数量和比例，优于传统的检测细胞增殖方法^[26-28]。实验用EdU标记法测定成纤维细胞增殖结果表明，C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力以5代以前增殖旺盛，从第6代开始增殖能力显著减弱。因此一般选择5代之前的成纤维细胞做饲养层细胞。饲养层质量的优劣是影响干细胞生长的重要因素^[22,29-31]。饲养层种植时间过长，随着营养成分消耗、细胞因子生成水平下降，不仅减少干细胞克隆的贴壁率及形成率，而且容易造成克隆的分化。张万里等^[32]报道用浓度为10 mg/L的丝裂霉素C处理KM-成纤维细胞 2.5 h后继续培养，从灭活后第10天开始，成纤维细胞数目急剧下降。实验发现来源于C57BL/6小鼠的成纤维细胞在种植后3 d内活力较高，超过3 d的饲养层细胞活力显著下降，证明C57BL/6小鼠饲养层活力维持时间异于昆明小鼠饲养层。因此，为维持干细胞的良好状态，C57BL/6小鼠饲养层最好在灭活后3 d内使用。人胚胎干细胞及诱导性多能干细胞接种到饲养层上，形成典型的克隆细胞集落，增殖迅速并保持未分化状态，能正常传代，证明C57BL/6小鼠饲养层细胞适合用于人胚胎干细胞及诱导性多能干细胞传代培养。

综上，实验结果表明C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的生物学特性与昆明小鼠基本相似，可作为胚胎干细胞及诱导多能干细胞饲养层的很好来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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