肢体缺血后处理促进缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1597-1602.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.019

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肢体缺血后处理促进缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖

杜郭佳^1，2，党木仁²，谭泽明¹，苏日青²，沈潜³，方加胜¹

¹中南大学湘雅医院神经外科，湖南省长沙市 410008；²新疆医科大学第一附属医院神经外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；³新疆医科大学第四附属医院神经外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 834000

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 方加胜，博士，主任医师，博士生导师，中南大学湘雅医院神经外科，湖南省长沙市 410008
作者简介:杜郭佳，男，1979年生，新疆维吾尔自治区伊犁地区昭苏县人，蒙古族，中南大学湘雅医院神经外科在读博士(原新疆医科大学第一附属医院神经外科主治医师)，主要从事颅底外科，神经内镜及干细胞方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区青年科学基金项目(2011211B31)

Limb ischemic postconditioning promotes the proliferation of endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury

Du Guo-jia ^1,2, Dang Mu-ren², Tan Ze-ming¹, Su Ri-qing², Shen Qian³, Fang Jia-sheng¹

¹Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; ²Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Department of Neurosurgery, the Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 834000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Fang Jia-sheng, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Du Guo-jia, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Youth Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211B31

摘要/Abstract

摘要：

背景：远程肢体缺血预处理应用到脑缺血-再灌注损伤领域的研究已有一些报道，但肢体缺血后处理应用于该领域报道很少。
目的：观察肢体缺血后处理对缺血性脑损伤大鼠侧脑室旁神经干细胞增殖的影响。
方法：利用改良线栓法制作局灶性脑缺血大鼠模型，将30只造模成功的SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组15只。实验组行远程肢体缺血后处理，对照组不做处理。2组大鼠分别于造模后5，10，15 d处死取脑，处死前1 d每隔8 h腹腔注射50 mg/kg 5-嗅脱氧尿嘧啶核苷1次，共3次。应用免疫组织化学方法检测梗死灶区大鼠脑组织5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞数。
结果与结论：与对照组比较，实验组脑再灌注损伤程度呈现不同程度减轻，行为学评分降低(P < 0.05)。实验组各时间点梗死灶周边皮质的5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞数明显多于对照组(P < 0.05)。提示局灶性脑缺血造模后的肢体缺血后处理可以改善大鼠行为学表现，促进了内源性干细胞的激活增殖，对缺血性脑损伤有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 神经干细胞, 肢体缺血后处理, 缺血性脑损伤, 细胞增殖, 5-嗅脱氧尿嘧啶核苷

Abstract:

BACKGROUND: There are a few reports addressing application of limb ischemic preconditioning in cerebral ischemia-reperfusion injury, but few reports have addressed limb ischemic postconditioning applied in this field.
OBJECTIVE: To explore the effects of limb ischemic postconditioning on the proliferation of neural stem cells of rats after cerebral ischemia.
METHODS: Focal stroke models were established in rats, and then 30 rat models were randomly divided into experimental group (n=15) and control group (n=15). Remote limb ischemic postconditioning was applied in the experimental group, but not in the control group. 5-Bromo-2-deoxyuridine (BrdU; 50 mg/kg) was injected intraperitoneally into rat models three times a day, and then the rat brains were respectively obtained at days 5, 10 and 15 days in two groups. The amount of BrdU-positive cells was measured by immunohistochemistry method in two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the experimental group was significantly decreased in the severity of injury and behavior scores (P < 0.05). At various time points, the number of BrdU-positive cells was obviously greater in the experimental group than the control group (P < 0.05). Results have indicated that limb ischemic postconditioning can improve behavior of rats and promote the proliferation of neural stem cells, thereby showing neuroprotective effects against cerebral ischemia injury.

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Key words: stem cells, neural stem cells, ischemic postconditioning, brain injuries, cell proliferation, bromodeoxyuridine

中图分类号:

R394.2

杜郭佳，党木仁，谭泽明，苏日青，沈潜，方加胜. 肢体缺血后处理促进缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1597-1602.

Du Guo-jia, Dang Mu-ren, Tan Ze-ming, Su Ri-qing, Shen Qian, Fang Jia-sheng. Limb ischemic postconditioning promotes the proliferation of endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1597-1602.

图/表（结果） 3

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引言

机体脑缺血可以调动内源性保护机制从而有效治疗缺血性脑损伤，对缺血防治的认识开辟了新的领域，如何启动、激活这种内源性保护的研究具有积极的现实和理论意义^[1-2] 。
缺血前处理于20世纪80年代开始运用于减轻缺血再灌注所引起的器官损害。缺血前处理是于缺血再灌注发生前给予间断的短暂性缺血，让器官对随之而来的缺血产生一定程度的适应，从而达到器官保护作用。研究脑缺血耐受进一步阐明其机制将有助于阐明脑缺血时机体的内源性保护机制，有利于新的脑保护药物的发现，并可能通过提高脑组织对缺血缺氧的耐受性，延长缺血性脑血管疾病的治疗时间窗，减少急性脑卒中的发生率、死亡率与致残率。由于缺血前处理的实施必须在器官缺血发生之前才能发挥其作用，所以在临床上存在一定的局限性，于是为了减少缺血再灌注所带来的损伤就出现了另外一个新的概念：缺血后处理。
后处理概念第一次是由Vinten johansen的研究团队在2002年英国第3届世界心血管工作会议上提出的，他们在该次会议上指出后处理是一种现象，与前处理的不同在于它的实施是在重要器官缺血再灌注发生开始时或者再灌注发生后给予的反复多次间断的缺血再灌注^[3] 。到目前为止，后处理的实施已经成熟运用于心肌缺血再灌注模型中的细胞实验及动物体内实验^[4-6] 。近年来，研究者在大鼠、兔子等脑缺血再灌注损伤模型中使用后处理，观察其对脑组织起到的神经保护作用，证实了后处理有其临床意义及其临床可行性，后处理在对大脑等重要脏器的缺血再灌注损伤过程中具有保护作用^[7-9] 。神经干细胞是具有自我更新、多向分化和再生能力的细胞。肢体缺血后处理对缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖是否有促进作用研究非常少。
文章旨在采用大鼠缺血性脑损伤模型，观察肢体缺血后处理对缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖是否有影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年6至12月在北京宣武医院外科实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级健康成年雄性SD大鼠30只，体质量260-280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2012-0001。按随机数字表法分为2组，实验组和对照组各15只。

实验过程中对动物的处置方法符合中国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关要求^[10]。

方法：

动物模型制作及肢体缺血后处理：实验前动物禁食 12 h，不禁饮水。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (3.5 mL/kg)，仰卧固定于专用固定板上，颈前区毛发备皮，消毒皮肤，置于手术显微镜下进行操作。按照既往改良Longa等^[11]的线栓法阻断大鼠右侧大脑中动脉制成局灶性脑缺血模型。造模后1.5 h时拔线栓再灌注。实验组于拔线栓前1 h用在大鼠双侧大腿中、上1/3部位采用弹性止血带结扎，以结扎部位远端下肢表面皮肤颜色呈绛紫、并伴有皮肤温度降低为下肢缺血成功的标志。开放下肢结扎恢复血流再灌注后，结扎部位远端的肢体颜色随即恢复红润。止血带捆绑大鼠双侧股动脉10 min再复灌10 min共3个循环，对照组不做处理。

神经功能评定：大鼠苏醒后参照Longa等^[11]5分制评定标准筛选出1-3分的脑缺血模型进入实验。0分：无神经功能缺损症状，活动正常；1分：不能伸展对侧前爪；2分：爬行时出现向左转圈；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。

5-嗅脱氧尿嘧啶核苷标记：大鼠分别在脑缺血模型制作后5，10，15 d处死，2组每个时间点各5只。处死前1 d，每隔8 h腹腔注射5-嗅脱氧尿嘧啶核苷(50 mg/kg)1次，共3次。

脑组织切片的制备：5-嗅脱氧尿嘧啶核苷标记后每组大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，40 g/L多聚甲醛进行心脏灌注，取脑后放于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋和切片，片厚约5 μm。

免疫组织化学染色：组织石蜡切片经常规脱蜡水化后，采用免疫组织化学染色法进行染色。操作按说明书严格进行，显微镜下细胞内有棕褐色颗粒者为5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。每张免疫组化染色的切片随机选取梗死灶周边区域的5个不重叠视野，在高倍镜下分别计数5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞数并计算其均数。

主要观察指标：2组大鼠神经行为功能评分和免疫组织化学5-嗅脱氧尿嘧啶核苷染色结果。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示。组间比较采用t 检验和秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

急性缺血性脑血管病严重危害人类健康，尤其以局灶性脑缺血再灌注损伤较为多见。缺血再灌注发生时，氧供的持续不足直接导致组织器官发生严重损伤，甚至在缺血的器官组织内出现梗死灶。在缺血再灌注损伤发生后尽快恢复缺血器官的血流灌注是能够有效减少器官功能损害，减少梗死面积的惟一方式。遭受缺血的器官再灌注后往往会诱发氧自由基大量释放，将导致更为严重的损害。因此，为了减少组织器官缺血再灌注损伤，研究者们发现缺血前处理和缺血后处理两种方式能够有效地减少缺血再灌注引起的损伤^[12-13] 。
肢体缺血前处理可以降低迟发性的海马CA1区神经元损伤，肢体缺血后处理具有抗大鼠海马CA1区缺血性神经元损伤的作用^[14-15] 。肢体缺血后处理能减少兔心肌缺血后心肌梗死面积^[16] 。有关肢体缺血后处理应用到脑缺血再灌注损伤领域的研究均提示肢体缺血后处理有脑保护作用^[17-18] 。肢体缺血后处理对脑缺血再灌注损伤保护作用机制尚不清楚。
本实验造模后对大鼠神经行为评分的结果提示，实验组脑再灌注损伤程度呈现不同程度减轻，实验组神经行为评分值集中于1至2分，而对照组2至3分占多数，表明肢体缺血后处理操作使大鼠神经行为功能有改善，具有一定程度的脑保护作用。采用肢体缺血后处理对机体相对非重要的器官肢体进行缺血后处理，从而能保护心、脑等重要器官在遭遇严重的缺血再灌注时所受到的损伤，可能更有意义深远的临床价值。Kerendi等^[19]的临床试验表明肢体缺血后处理可在组织缺血事件发生后实施，有望成为缺血再灌注损伤防治的新方法。
近年来对肢体缺血后处理对组织器官缺血再灌注损伤保护作用的机制研究主要集中在启动因子和细胞通路上^[20-21] 。相关的启动因子包括腺苷、阿片肽、缓激肽、内源性一氧化氮、乙酰胆碱、组织因子、炎症因子、氧自由基等。相关的信号通路包括PI3K通路、ERK1/2通路、PKG通路、PKC通路等。腺苷是由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过P糖苷键连接而成的化合物，它可以通过其受体A1、A2a、A2b、A3发挥作用，腺苷的这几种受体广泛存在于心肌细胞和血管内皮细胞中。Yang等^[22]研究指出后处理对缺血器官的保护作用可能与腺苷密切相关。有研究表明腺苷能够通过激活PI3K、PKC、MAPK等信号转导通路从而影响线粒体ATP敏感性钾离子通道和线粒体膜通道孔的开闭，而后处理则可以通过减少腺苷的释放，从而减少缺血再灌注过程中过氧化物生成以及细胞炎症因子的释放，从而减少器官缺血再灌注损伤发挥其器官保护作用^[23-25] 。
人体神经系统内广泛存在着一氧化氮，并且以其为神经递质。一氧化氮在后处理的器官保护作用中也起着至关重要的作用，一氧化氮是后处理发挥其缺血器官再灌注损伤保护作用的介质，由它介导了后处理器官保护作用的下游信号转导通路。一氧化氮可能位于PI3K/Akt信号通路的下游或者其他相关信号通路的下游，从而介导了后处理对缺血器官再灌注损伤的保护作用^[26] 。Rehni等^[27]研究发现缺血后处理能够减少全脑缺血再灌注损伤所导致的记忆和感觉运动功能的减退，这种保护作用可以被PI3K的信号阻断剂阻断，该研究表明PI3K/Akt信号转导通路介导了全脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。肢体缺血后处理的机制复杂，其研究的信号通路之间相互作用相互影响，其具体的作用机制仍需要更多的实验证实。
神经干细胞是具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞群。干细胞疗法近年来己成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代、修复或加强受损组织或器官的生物学功能。目前利用神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤的方法主要有两种：一是外源性神经干细胞移植，另外一个是内源性神经干细胞移植，即内源性神经干细胞激活。外源性神经干细胞移植手术不仅有创伤性，还存在诸多移植相关问题，如定向转化、致瘤性等。内源性神经干细胞激活主要通过外在因素刺激来达到，如果能提高内源性神经干细胞的数量到一定水平，则既可以满足自体修复受损神经功能的需要，同时又可以避免移植免疫反应。
有研究证实成年人脑存在神经干细胞^[28] 。成年哺乳动物大脑中神经干细胞分布广泛，主要区域包括大脑室下带、海马、纹状体、室下核、海马颗粒下层和其他脑区^[29-34] 。正常情况下成年脑内的神经干细胞处于静息状态数量稀少，在脑缺血或者某些因素的刺激下，静息状态神经干细胞被激活(或抑制因子失活)，在损伤原位出现或异位增殖后，在其他趋化因子的作用下向损伤部位迁移并分化成神经元和胶质细胞，这些新生成的神经元与神经胶质细胞可以替代受损的神经组织, 并且发挥一定程度的代偿功能^[35-44] 。这就为诱导存在于上述部位的干细胞修复受损的中枢神经系统提供了广阔的前景。
已有研究证实肢体缺血预处理后12-48 h可以激活脑梗死大鼠海马神经干细胞的增殖并且对脑梗死后机体自我修复具有潜在的治疗作用^[45] ，其保护机制可能是远隔部位短暂的缺血预处理刺激机体释放出大量内源性物质，这些大量的代谢产物、递质及新合成或分泌的一些产物(如细胞因子)在不同时间不同程度地介导损伤，同时提高机体重要器官的应激能力抵抗损伤及直接激活静止期神经干细胞的增殖，这些增殖的干细胞可能参与修复缺损的神经组织, 从而部分恢复丧失的神经功能。肢体缺血后处理能否促进缺血性脑损伤大鼠梗死灶周围脑组织的神经干细胞增殖成为本文的研究方向。5-嗅脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷酸的类似物，在细胞周期S期它可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入DNA中，并随标记细胞增殖传代，因此5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞可被视为处于增殖状态的神经干细胞。Jin等^[46]利用大脑中动脉梗死模型观察到脑损伤后神经干细胞增殖表现出一定的时间波动，即损伤后神经干细胞增殖的高峰位于缺血后第7-11天之间，缺血两至三周后神经元再生开始下降，约3周后下降至正常水平。Iwai等^[47]利用沙鼠全脑缺血/再灌注模型于5，10，20 d时处死动物，结果显示实验组动物5 d后海马齿状回的5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞数显著增加，10 d左右达到高峰，到20 d时降至对照组水平。
本实验结果显示，大鼠脑梗死灶周边脑组织中可见5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞并显著增多，第10天左右5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞达到高峰，随后开始下降。实验组各时间点梗死灶周边皮质的5-嗅脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞数明显多于对照组，提示肢体缺血后处理可促进内源性神经干细胞增殖、迁移。
肢体缺血后处理促进大鼠缺血性脑损伤后神经干细胞的增殖可能与降低神经干细胞的氧耗和新陈代谢，改善神经干细胞微环境，促进增殖相关细胞因子的活性等因素有关^[48-49] 。目前关于肢体缺血后处理促进缺血性脑损伤大鼠脑组织神经干细胞内源性增殖的具体机制还不清楚，有待于今后进一步研究。

肢体缺血后处理促进缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖

Limb ischemic postconditioning promotes the proliferation of endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury

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