人脂肪间充质干细胞与再生障碍性贫血患者T淋巴细胞的体外共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前已有临床应用造血干细胞联合间充质干细胞输注治疗再生障碍性贫血的报道。
目的：观察人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血T淋巴细胞分泌功能的调节作用。
方法：从健康人脂肪中提取并培养人脂肪间充质干细胞，从再生障碍性贫血患者外周血中分离T淋巴细胞，将两者共培养后，以健康志愿者的T淋巴细胞单独培养及与人脂肪间充质干细胞共培养做对照。ELISA法检测上清白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10和γ-干扰素的水平，Realtime RCR和Western blot测定T-bet和GATA-3的表达。
结果与结论：共培养7 d后，间充质干细胞+再生障碍性贫血T淋巴细胞组Th1类细胞因子γ-干扰素、白细胞介素2水平明显低于再生障碍性贫血T淋巴细胞组(P < 0.05)，Th2类细胞因子白细胞介素4、白细胞介素10水平明显高于再生障碍性贫血T淋巴细胞组(P < 0.05)；间充质干细胞+再生障碍性贫血 T淋巴细胞组T-bet mRNA及蛋白表达水平均低于再生障碍性贫血T淋巴细胞组，GATA-3 mRNA及蛋白水平均高于再生障碍性贫血 T淋巴细胞组。提示人脂肪间充质干细胞在体外对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞具有免疫调节作用，其机制可能是通过调节转录因子T-bet和GATA-3的表达从而抑制Th细胞向Th1细胞方向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 间充质干细胞, 人脂肪间充质干细胞, 再生障碍性贫血, 免疫调节, T淋巴细胞, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Clinical infusion of hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells for treatment of aplastic anemia has been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human adipose-derived mesenchymal stems cells on the secretion function of T lymphocytes of aplastic anemia patients.
METHODS: Human adipose-derived mesenchymal stems cells were extracted from healthy human adipose tissues. T-lymphocytes were harvested from peripheral blood of patients with aplastic anemia by density gradient centrifugation. Human adipose-derived mesenchymal stems cells were co-cultured with T-lymphocytes. The levels of interleukin-2, interleukin-4, interleukin-10 and interferon-γ were detected by enzyme linked immunosorbent assay. T-bet and GATA-3 levels were examined by real-time PCR and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of Th1 type cytokines interferon-γ and interleukin-2 in the co-culture group were significantly lower than those in the T-lymphocyte group (P < 0.05). But the levels of Th2 type cytokines interleukin-4 and interleukin-10 in the co-culture group were significantly higher than those in the T-lymphocyte group (P < 0.05). The T-bet mRNA and protein levels in the co-culture group were significantly lower than those in the T-lymphocyte group, while the GATA-3 mRNA and protein levels were significantly higher in the co-culture group. Human adipose-derived mesenchymal stems cells can mediate an immunoregulation effect on T-lymphocytes of aplastic anemia patients in vitro, which is possibly related with the inhibition of Th1-dominant response due to the disorder of T-bet and GATA-3 gene expression.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, anemia, aplastic, T-lymphocytes

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

再生障碍性贫血是以外周血全血细胞减少和骨髓增生不良为主要特征的一组疾病。近年来有人提出再生障碍性贫血是一种以造血系统为靶器官的、T淋巴细胞介导的自身免疫疾病^[1] ，细胞免疫功能异常可能起主要作用，表现在T淋巴细胞亚群比例的改变，如外周血CD4⁺T细胞比例明显降低，CD4⁺/CD8⁺比值倒置，CD8⁺T细胞比例明显升高。
再生障碍性贫血患者血清中的白细胞介素2、γ-干扰素、肿瘤坏死因子α异常增高，这些主要由活化T细胞分泌的负调控因子上调CD34⁺细胞Fas抗原的表达，而成为细胞毒性T细胞，或成为表达大量FasL的活化淋巴细胞的靶细胞，Fas与FasL的相互作用，使骨髓中CD34⁺细胞大量凋亡，是导致造血功能衰竭的重要原因 ^[2-6] 。因此，再生障碍性贫血的治疗关键是抑制T淋巴细胞的活化与增殖，减少造血负调控因子的分泌。
间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞^[7] 。在成体组织中，间充质干细胞主要存在于骨髓和脂肪中，且有研究发现在牙髓、胎盘、胰腺、肌肉、胎儿肝脏、脐血等组织中广泛存在^[8-15] 。
间充质干细胞除了具备干细胞的多系分化潜能之外，还具有特殊的低免疫原性和免疫调节能力^[16] 。间充质干细胞与胸腺上皮有部分相同的表面分子，如：血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子2、淋巴细胞功能相关性抗原3，能介导其与T细胞间的相互作用，这可能是间充质干细胞免疫调控作用的分子学基础。
间充质干细胞可分泌多种细胞因子支持造血干细胞的增殖和分化，此外，还可通过分泌转化生长因子、肝细胞生长因子等细胞因子对T淋巴细胞增殖起到抑制作用^[17-23] 。人间充质干细胞也可抑制由抗免疫球蛋白抗体、可溶性CD40补体和细胞因子激活的B淋巴细胞的增殖^[23] 。
Aggarwal等^[24]研究发现，将间充质干细胞分别与1型树突细胞、2型树突细胞、原态T细胞体外培养时发现可以减少1型树突细胞分泌肿瘤坏死因子α，而增加2型树突细胞分泌白细胞介素10；减少T辅助细胞1分泌γ-干扰素，增加T辅助细胞2分泌白细胞介素4。间充质干细胞所特有的免疫调节作用，在临床应用方面有广阔的前景。
再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的绝对数量、增殖能力、在体外对活化T细胞的抑制作用均明显减弱^[25-29] 。目前已有临床应用造血干细胞联合间充质干细胞输注治疗再生障碍性贫血的报道^[30-31] ，但具体的机制还不明确。人脂肪来源的间充质干细胞具有多向分化能力，且脂肪取材安全，来源广泛，因此具有用于细胞替代治疗的可能。实验通过研究人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞分泌功能的影响，阐明人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血的免疫调控机制，旨在为间充质干细胞在免疫治疗方面的开发利用提供理论依据，为再生障碍性贫血免疫治疗方法开创新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：病例来源于2012年1月至2013年1月在胜利油田中心医院收治的再生障碍性贫血患者。

对象：选取同期胜利油田中心医院收治的再生障碍性贫血患者10例。健康志愿者经本院体检，均无肿瘤、外伤、感染、传染病及自身免疫性疾病史。

再生障碍性贫血诊断：统一参照张之南^[32]主编的《血液病诊断及疗效标准》进行诊断。

患者纳入标准： ①符合张之南^[5]主编的《血液病诊断及疗效标准》中再生障碍性贫血的诊断标准。②在采集外周血前3个月均未接受免疫抑制剂或激素类药物治疗。③经医院伦理委员会同意，并签署了知情同意书。

患者排除标准：采血前3个月内接受过免疫抑制剂或激素类药物治疗者。

材料：

方法：

人脂肪来源间充质干细胞的分离、培养和鉴定：

建立培养基培养人脂肪间充质干细胞：脂肪组织来源于临床脂肪抽取术(供者对脂肪抽取及实验均知情同意)，经Ⅰ型胶原酶消化获取原代人脂肪间充质干细胞，培养方法见参考文献[33]。取第2代和第4代间充质干细胞培养人脂肪间充质干细胞实验备用。

流式细胞仪检测人脂肪间充质干细胞的表型：用间接免疫荧光法检测细胞的表型，间充质干细胞经胰蛋白酶消化后，洗涤2次，再用体积分数0.5%牛血清白蛋白的PBS洗涤1次，加入一抗4 ℃孵育30 min(一抗为小鼠抗人的单克隆抗体CD105、CD106、CD34、CD31、CD29、CD44和HLA-DR)，洗液洗涤2次，用洗液洗涤后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗4 ℃孵育30 min。孵育结束后，细胞洗涤3次，并悬浮在500 μL的PBS中，置于冰上待流式细胞仪检测。

T淋巴细胞的分离：取经肝素抗凝的再生障碍性贫血患者和正常人外周血5-10 mL(红细胞Coombs试验阴性)，PBS倍比稀释后，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，RPMIl640重悬并经尼龙棉柱纯化后得到T淋巴细胞。

在无血清培养基条件下分别收集单独培养的健康志愿者的T淋巴细胞、再生障碍性贫血-T淋巴细胞的培养上清，以及人脂肪间充质干细胞与健康志愿者的T淋巴细胞、再生障碍性贫血- T淋巴细胞共培养的上清，根据试剂盒说明书提供的操作步骤检测白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10和γ-干扰素分泌水平值。

实时荧光定量PCR检测T-bet与GATA-3 mRNA的表达：按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒说明，在IQ5实时定量PCR仪上运行real-time PCR。每份样品设置3个复孔，独立实验重复3次。具体方法见参考文献[34]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

Western blot检测T-bet与GATA-3蛋白的表达：采用放射免疫沉淀试验提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，每泳道以50 μg蛋白质样品进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压100 mV电泳2 h，恒流250 mA转膜4 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，用兔抗人T-bet与GATA-3单克隆抗体于 4 ℃培育过夜(1∶500)，吐温-Tris盐缓冲液(TBST)漂洗3遍后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 500)，37 ℃摇床温育2 h，最后经ECL系统曝光显影，β-actin为对照。

主要观察指标： ①人脂肪间充质干细胞的形态和免疫表型。②ELISA法检测上清白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10、γ-干扰素的水平。③T-bet和GATA-3表达水平的比较。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件学软件进行分析，结果均以x(_)±s表示，样本均数先采用单因素方差分析，然后采用LSD t 检验进行两样本均数比较。

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讨论

免疫介导的造血抑制是再生障碍性贫血最常见的、目前研究最多的发病机制。T辅助淋巴细胞根据分泌的细胞因子类型及其功能效应的不同可分为Th1和Th2两种亚型。γ-干扰素、白细胞介素2是Th1类细胞因子的典型代表，白细胞介素4、白细胞介素10是Th2类细胞因子的典型代表，常被用来验证Th细胞的分化方向^[35] 。而再生障碍性贫血免疫功能紊乱的主要表现之一是Th1淋巴细胞数目增多和功能亢进。
T-bet是Th1细胞特异性转录因子，能够促进Th0向Th1细胞分化，抑制Th2细胞的分化^[36] 。GATA-3是Th2细胞特异性转录因子，可减少γ-干扰素的生成，使Th1前体细胞向Th2方向分化^[36] 。Th0细胞分化为Th1和Th2过程中，分别受到转录因子T-bet和GATA-3的调控。正常情况下T-bet与GATA-3两者相互抑制，并维持动态平衡，因此T-bet/GATA-3比值常用来评价机体免疫功能有无失衡。
近年来，间充质干细胞的免疫调节作用受到越来越多的关注，在控制骨髓移植引起的移植物抗宿主病以及再生障碍性贫血等疾病方面，已经取得了初步疗效^[30-31] ，有报道指出，将不同来源的间充质干细胞加入混合的淋巴细胞反应中，或加入PHA刺激的淋巴细胞中，淋巴细胞的增殖活性均下降[37]，此外，间充质干细胞还可以调节体内Th1/Th2细胞的平衡。
实验通过建立人脂肪间充质干细胞与再生障碍性贫血-T淋巴细胞共培养模型，研究人脂肪间充质干细胞是否能够抑制再生障碍性贫血-T淋巴细胞分泌负性细胞因子，改变其Th1/Th2分化状态，并通过检测T-bet及GATA-3的表达，初步探讨人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血的影响机制，为临床应用提供理论依据。
结果证实人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血有一定免疫调节作用，间充质干细胞可能通过调控免疫细胞促进再生障碍性贫血小鼠骨髓的造血功能^[38-45] 。经细胞因子的水平变化证实出现Th1/Th2平衡向Th2方向分化的结果，这表明间充质干细胞可能是通过分泌可溶性因子调节Th1/Th2反应平衡而发挥免疫调节作用的。此外，T-bet mRNA和蛋白表达水平明显减少，而GATA-3 mRNA和蛋白表达明显升高，提示间充质干细胞影响Th1/Th2分化状态可能与影响转录因子T-bet和GATA-3的表达有关。
实验提示人脂肪间充质干细胞有可能成为治疗再生障碍性贫血一种有效可行的方法。但实验仅限于在体外，临床应用时人脂肪间充质干细胞所需剂量以及在患者体内是否仍能达到预期的效果需进一步研究。