乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1585-1590.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证

张军红^1，2，杨晶³，豆晓伟¹，王春华⁴，李青⁵，赵春华¹

¹中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院组织工程中心，细胞生物学系，北京市 1000051；河北省邢台市眼科医院，河北省眼病治疗中心，河北省眼科研究所，²病理科，⁴耳鼻喉科，河北省邢台市 054000；³河北医科大学生理学教研室，河北省石家庄市 050017；⁵贵阳医学院附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 赵春华，博士，教授，博士生导师，中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院组织工程中心，细胞生物学系，北京市 100005
作者简介:张军红，女，1974年生，河北省邢台市人，汉族，2008年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事干细胞组织工程、癌症干细胞及其在临床应用的研究。
基金资助:
国家重大科学研究计划(973)资助项目(2011CB964900)；国家863项目(2011AA020100)；河北省教育厅青年基金项目(2011154)；邢台市科技支撑计划资助项目(2013ZC062)

Creation and effectiveness of mammary stem cell medium

Zhang Jun-hong ^{1, 2}, Yang Jing³, Dou Xiao-wei¹, Wang Chun-hua⁴, Li Qing⁵, Zhao Chun-hua¹

¹Center of Tissue Engineering, Department of Cell Biology, Basic Medical College of Peking Union Medical College & Basic Institute of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China; ²Department of Pathology, ⁴Department of Otorhinolaryngology, Xingtai Eye Hospital, Xingtai 054000, Hebei Province, China; ³Department of Physiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; ⁵Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Zhao Chun-hua, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Center of Tissue Engineering, Department of Cell Biology, Basic Medical College of Peking Union Medical College & Basic Institute of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China
About author:Zhang Jun-hong, Attending physician, Center of Tissue Engineering, Department of Cell Biology, Basic Medical College of Peking Union Medical College & Basic Institute of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China; Department of Pathology, Xingtai Eye Hospital, Xingtai 054000, Hebei Province, China
Supported by:
the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program), No. 2011CB964900; the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program), No. 2011AA020100; the Youth Foundation of Hebei Provincial Education Bureau, No. 2011154; the Scientific Supporting Plan of Xingtai City, No. 2013ZC062

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞培养基，尤其是乳腺干细胞培养基现阶段尚无有效的制备方法。
目的：利用Sca-1⁺乳腺细胞验证自制乳腺干细胞培养基的有效性。
方法：用BM培养基培养乳腺器官样小体，6 d后以免疫荧光方法监测成纤维细胞Sca-1和vimentin的表达。筛选出MaECM培养基，培养乳腺细胞6 d后，免疫磁珠筛选Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群，流式细胞术分析Sca-1阳性细胞的纯度，1×10⁴Sca-1⁺或Sca-1^-细胞种植在4只鼠双侧乳腺脂肪垫上，6-8周后取出乳腺脂肪垫，以卡红整体染色和苏木精-伊红染色分析长出乳腺的结构数量。
结果与结论：乳腺器官样小体用BM培养基培养6 d后，检测到大量Sca-1和vimentin阳性的成纤维细胞，说明BM培养基不适合分离Sca-1⁺乳腺干细胞。筛选出的MaECM培养基能够抑制成纤维的生长。磁珠筛选后，流式细胞术检测Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群的纯度分别是92%和5%。移植实验显示在8个种植Sca-1⁺细胞的脂肪垫生长出6个乳腺结构；而在8个种植Sca-1^-细胞的脂肪垫中除1只鼠死亡，其余脂肪垫中均未长出乳腺结构。提示MaECM培养基适用于培养鼠乳腺干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 乳腺干细胞, 成纤维细胞, Sca-1, 乳腺干细胞培养基, 国家重大科学研究计划(973)资助项目, 863项目

Abstract:

BACKGROUND: Now in mammary stem cell research, no proper mammary stem cell medium is provided to culture mammary stem cells.
OBJECTIVE: To create a mammary stem cell medium and validate its application by isolating Sca-1+ mammary stem cells.
METHODS: We first used BM medium to culture mammary organoids, and after 6 days, the expression of Sca-1 and vimentin was detected in fibroblasts by immunofluoresence method. Then, we established MaECM medium which arrested fibroblasts growth. After 6 days culture of mammary organoids by MaECM medium, Sca-1⁺ and Sca-1^- cell populations were sorted out by magnetic sorting and the purity was analyzed by flow cytometry. Sorted 1×10⁴ Sca-1⁺ or Sca-1^-cells were transplanted into the bilateral mammary fat pads of four mice, and after 6-8 weeks, the fat pads were harvested for whole-mount immunohistochemical analysis and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: After 6 days culture of mammary organoids under BM medium, small-sized colonies were generated around lots of fibroblasts. Immunofluoresence staining detected strong expression of vimentin and Sca-1 in fibroblasts, indicating that the BM medium is not suitable to isolate Sca-1⁺mammary stem cell. The MaECM medium promoted the proliferation of mammary epithelial cells whereas arrested fibroblasts growth. After 6 days culture of mammary organoids under MaECM medium and magnetic sorting, the flow cytometry showed that the purity of Sca-1⁺cell reached 92% and 5% in the Sca-1⁺ and Sca-1^- population, respectively. The results from transplantation test showed that six mammary outgrowths were regenerated out of eight injected fat pads in the Sca-1⁺ cells transplantation, but in the Sca-1^- transplantation population, one mouse died and the other transplants failed to produce outgrowths. We developed the MaECM medium which promoted the proliferation of mammary epithelial cells whereas arrested Sca-1⁺fibroblasts growth. Using the medium, we confirmed that Sca-1⁺ mammary cells have capacity of isolating mammary stem cells.

全文链接：

Key words: stem cells, breast neoplasms, fibroblasts, culture media, fluoroimmunoassay

中图分类号:

R394.2

张军红，杨晶，豆晓伟，王春华，李青，赵春华. 乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1585-1590.

Zhang Jun-hong, Yang Jing, Dou Xiao-wei, Wang Chun-hua, Li Qing, Zhao Chun-hua. Creation and effectiveness of mammary stem cell medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1585-1590.

图/表（结果） 3

2.1 不同培养基对乳腺器官样小体培养后形态的影响 乳腺器官样小体在BM培养基培养6 d后，观察到乳腺器官样小体形成的集落结构周围布满大量的成纤维细胞。乳腺器官样小体形成的集落结构很小，乳腺细胞也很少(图1A)。在BM培养基中加入雌激素后，发现随着雌激素质量浓度的增加，成纤维细胞逐渐减少，集落结构逐渐变大，在1.5 μg/L的雌激素应用后基本没有观察到成纤维细胞，但是3 μg/L的雌激素导致集落结构丧失，细胞变性。在BM培养基中加入生长激素后，发现随着生长激素质量浓度的增加，没有改变成纤维细胞的生长，细胞生长速度增加。因此在含有BM培养基和1.5 μg/L雌激素培养基中加入生长激素，发现随着生长激素质量浓度的增加，可以明显促进集落的生长，但在应用100 μg/L的生长激素后出现类似3 μg/L雌激素的结果，包括集落结构丧失，细胞变性。因此，选择在BM培养基加入10 μg/L雌激素和50 μg/L生长激素做后续的实验，命名为MaECM (mammary epithelial cell medium)培养基。乳腺器官样小体在MaECM培养基培养条件下，培养6 d后观察到形成集落结构体积很大，集落之间几乎没有成纤维细胞(图1B)。

2.2 成纤维细胞的鉴定和表达 乳腺器官样小体在BM培养基培养6 d后，免疫荧光分析显示，多数成纤维细胞表达vimentin，证明这些细胞是间质来源的细胞^[10]；多数成纤维细胞表达Sca-1，说明BM培养基不适合作为分离Sca-1⁺乳腺干细胞的培养基(图2)。

2.3 磁珠筛选Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群的纯度 乳腺器官样小体在MaECM培养基培养6 d后，经磁珠筛选和流式细胞术分析显示，Sca-1⁺细胞在Sca-1^-和Sca-1⁺细胞群的比例分别是5%和92%。以前报道的Sca-1富集乳腺前体细胞的实验中，Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺群细胞的比例分别是86%和7%。因此磁珠筛选Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺细胞群的纯度可以满足后述的实验^[24]。

2.4 Sca-1⁺细胞发育成乳腺结构的潜能 1×10⁴ Sca-1⁺细胞种植在4只鼠双侧乳腺脂肪垫中，经过8-10周后，在种植的8个脂肪垫中，其中6个生长出乳腺结构。这些种植生成的乳腺结构和正常的乳腺结构相比,管泡状结构伸向不同的方向(图3A，B)。而在1×10⁴Sca-1^-细胞种植组，其中一只鼠死亡，而在其余的6个脂肪垫中没有生长出乳腺结构(图3C)。脂肪垫清除实验是1959年以来证明乳腺干细胞最可靠的实验，以往文献说明在证实乳腺干细胞存在的实验中种植的乳腺细胞应少于2×10⁴细胞^[27-28]。因此，认为Sca-1⁺细胞具有富集乳腺干细胞的能力。

参考文献

[1]Guo P, Huang Z, Yu P, et al. Trends in cancer mortality in China: an update. Ann Oncol. 2012; 23(10):2755-2762.
[2]Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013. CA: a cancer journal for clinicians. 2013; 63(1):11-30.
[3]Nguyen LV, Vanner R, Dirks P, et al. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 2012; 12(2):133-143.
[4]Tomasetti C, Vogelstein B, Parmigiani G. Half or more of the somatic mutations in cancers of self-renewing tissues originate prior to tumor initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(6):1999-2004.
[5]Brenton JD, Stingl J, Stem cells: Anatomy of an ovarian cancer. Nature. 2013; 495(7440):183-184.
[6]Hammoud SS, Cairns BR, Jones DA. Epigenetic regulation of colon cancer and intestinal stem cells. Curr Opin Cell Biol. 2013;25(2):177-183.
[7]Holland JD, Klaus A, Garratt AN, et al. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Curr Opin Cell Biol. 2013;25(2):254- 264.
[8]Günes C, Rudolph KL. The Role of Telomeres in Stem Cells and Cancer. Cell. 2013; 152(3):390-393.
[9]Charafe-Jauffret E, Ginestier C, Bertucci F, et al. ALDH1-positive cancer stem cells predict engraftment of primary breast tumors and are governed by a common stem cell program. Cancer Res. 2013;73(24):7290-7300.
[10]Kakarala M, Brenner DE, Korkaya H, et al. Targeting breast stem cells with the cancer preventive compounds curcumin and piperine. Breast Cancer Res Treat. 2010; 122(3): 777-785.
[11]Han DW, Tapia N, Hermann A, et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 2012; 10(4):465-472.
[12]Chen J, McKay RM, Parada LF. Malignant glioma: lessons from genomics, mouse models, and stem cells. Cell. 2012; 149(1):36-47.
[13]Amsterdam A, Raanan C, Schreiber L, et al. Differential localization of LGR5 and Nanog in clusters of colon cancer stem cells. Acta Histochemica. 2012.
[14]Vizio B, Mauri FA, Prati A, et al. Comparative evaluation of cancer stem cell markers in normal pancreas and pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncol Rep. 2012; 27(1):69-76.
[15]Liang D, Shi Y. Aldehyde dehydrogenase-1 is a specific marker for stem cells in human lung adenocarcinoma. Med Oncol. 2012; 29(2):633-639.
[16]Huch M, Dorrell C, Boj SF, et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 2013; 494(7436):247-250.
[17]Rountree CB, Mishra L, Willenbring H. Stem cells in liver diseases and cancer: recent advances on the path to new therapies. Hepatology. 2012; 55(1):298-306.
[18]Schwartz T, Stark A, Pang J, et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 as a marker of mammary stem cells in benign and malignant breast lesions of Ghanaian women. Cancer. 2013; 119(3):488-494.
[19]Smalley MJ, Kendrick H, Sheridan JM, et al. Isolation of mouse mammary epithelial subpopulations: a comparison of leading methods. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2012; 17(2):91-97.
[20]Guler G, Balci S, Costinean S, et al. Stem cell-related markers in primary breast cancers and associated metastatic lesions. Mod Pathol. 2012; 25(7):949-955.
[21]Sleeman KE, Kendrick H, Ashworth A, et al. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Res. 2005; 8(1):R7.
[22]Shackleton M, Vaillant F, Simpson KJ, et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 2006; 439(7072):84-88.
[23]Liao MJ, Zhang CC, Zhou B, et al. Enrichment of a population of mammary gland cells that form mammospheres and have in vivo repopulating activity. Cancer Res. 2007; 67(17):8131- 8138.
[24]Welm BE, Tepera SB, Venezia T, et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 2002; 245(1):42-56.
[25]Stingl J, Eirew P, Ricketson I, et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 2006; 439(7079):993-997.
[26]McQualter JL, Brouard N, Williams B, et al. Endogenous Fibroblastic Progenitor Cells in the Adult Mouse Lung Are Highly Enriched in the Sca‐1 Positive Cell Fraction. Stem Cells. 2009; 27(3):623-633.
[27]DeOme K, Faulkin L, Bern HA, et al. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 1959; 19(5):515.
[28]Regan J, Smalley M. Prospective isolation and functional analysis of stem and differentiated cells from the mouse mammary gland. Stem Cell Rev. 2007; 3(2):124-136.
[29]Staszkiewicz J, Gimble JM, Manuel JA, et al. IFATS Collection: Stem Cell Antigen-1-Positive Ear Mesenchymal Stem Cells Display Enhanced Adipogenic Potential. Stem Cells. 2008; 26(10):2666-2673.
[30]Kang SG, Shinojima N, Hossain A, et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 2010; 67(3):711.
[31]Naftali‐Shani N, Itzhaki‐Alfia A, Landa‐Rouben N, et al. The Origin of Human Mesenchymal Stromal Cells Dictates Their Reparative Properties. J Am Heart Assoc. 2013; 2(5): e000253.
[32]Tan KY, Eminli S, Hettmer S, et al. Efficient generation of iPS cells from skeletal muscle stem cells. PloS one. 2011; 6(10): e26406.
[33]Suzuki K, Sun R, Origuchi M, et al. Mesenchymal stromal cells promote tumor growth through the enhancement of neovascularization. Molecular Med. 2011; 17(7-8):579.
[34]Siegel G, Krause P, Wöhrle S, et al. Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells express cardiomyogenic proteins but do not exhibit functional cardiomyogenic differentiation potential. Stem Cells Dev. 2012; 21(13): 2457-2470.
[35]Sakakura T, Suzuki Y, Shiurba R. Mammary stroma in development and carcinogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2013:1-9.
[36]dos Santos CO, Rebbeck C, Rozhkova E, et al. Molecular hierarchy of mammary differentiation yields refined markers of mammary stem cells. Proc Natl Acad Sci. 2013; 110(18): 7123-7130.
[37]Roy S, Gascard P, Dumont N, et al. Rare somatic cells from human breast tissue exhibit extensive lineage plasticity. Proc Natl Acad Sci. 2013; 110(12):4598-4603.
[38]Fan Y, Menon RK, Cohen P, et al. Liver-specific deletion of the growth hormone receptor reveals essential role of growth hormone signaling in hepatic lipid metabolism. J Biol Chem. 2009; 284(30):19937-19944.
[39]Horigan K, Trott J, Barndollar A, et al. Hormone interactions confer specific proliferative and histomorphogenic responses in the porcine mammary gland. Domest Anim Endocrinol. 2009; 37(2):124-138.
[40]Cheng G, Weihua Z, Warner M, et al. Estrogen receptors ER alpha and ER beta in proliferation in the rodent mammary gland. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(11):3739-3746.
[41]Morani A, Warner M, Gustafsson JA. Biological functions and clinical implications of oestrogen receptors alfa and beta in epithelial tissues. J Intern Med. 2008; 264(2):128-142.
[42]Clarke RB, Spence K, Anderson E, et al. A putative human breast stem cell population is enriched for steroid receptor-positive cells. Dev Biol. 2005; 277(2):443-456.
[43]Booth BW, Smith GH. Estrogen receptor-alpha and progesterone receptor are expressed in label-retaining mammary epithelial cells that divide asymmetrically and retain their template DNA strands. Breast Cancer Res. 2006; 8(4): R49.
[44]Booth BW, Boulanger CA, Smith GH. Selective segregation of DNA strands persists in long-label-retaining mammary cells during pregnancy. Breast Cancer Res. 2008; 10(5):R90.
[45]Wang S, Qu X, Zhao RC. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 2012; 5(1):19.

引言

乳腺癌是癌症中导致女性死亡最多的疾病。统计结果显示，中国在2007至2009年农村女性的死亡率是4.9人/万人，城市女性乳腺癌的死亡率是6.1人/万人；美国每年新诊断的乳腺癌是23万人，乳腺癌导致的死亡人数是4万人^[1-2] 。因此，探讨乳腺癌的发病机制，寻找有效的治疗乳腺癌的药物靶标，对治疗乳腺癌有重要意义。
现阶段癌症发生理论认为癌症起源于癌症干细胞，是干细胞发生基因表达改变或者染色体变异形成的^[3-8] 。在乳腺、神经、结肠、胰腺、肺和肝脏等组织均发现干细胞和癌症干细胞^[9-17] 。比较干细胞和癌症干细胞之间的差异，对于探索癌症的起源和机制有重要的意思。因此，如何培养干细胞和癌症干细胞，获取满足实验要求的干细胞和癌症干细胞的数量，对于探索癌症的发生机制有现实的意义。
乳腺干细胞的培养对研究乳腺发育和乳腺癌的发病机制有重要意义。目前乳腺干细胞的细胞表面标记有Sca-1 (stem cell antigen 1)、乙醛脱氢酶1、CD24等^[18-20] 。乳腺干细胞的细胞表面标志仍存在争议，例如CD24，Sleeman等^[21]发现低表达CD24细胞群能够富集乳腺干细胞，而Shackleton等^[22]未观察到低表达CD24细胞群具有乳腺干细胞的潜能，Liao等^[23]发现从新鲜组织分离的乳腺干细胞高表达CD24，而培养后乳腺干细胞低表达CD24。对乳腺干细胞表面标志的争议可能和细胞来源，分离程序和培养基等有关。
Sca-1能否作为乳腺干细胞的表面标志仍有争议。Welm等^[24]发现Sca-1具有富集乳腺干细胞的能力，不过，Stingl等^[25]报道高表达的Sca-1细胞群没有乳腺干细胞的潜能，而且在培养后所有的细胞都表达Sca-1。作者认为这种争议可能和成纤维细胞有关，在以前报道分离乳腺干细胞的实验中很少去除成纤维细胞。成纤维细胞是乳腺组织的基本成分之一，而且在肺中发现Sca-1⁺成纤维细胞^[26] 。
本实验室筛选的MaECM培养基，能够促进乳腺上皮细胞生长和阻止成纤维细胞的增殖，是适合筛选乳腺干细胞的培养基。在MaECM培养基的基础上，证明了Sca-1⁺乳腺细胞具有干细胞的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学水平，体内外观察实验。

时间及地点：于2008年7月至2009年5月在北京协和医学院基础学院组织工程中心完成。

材料：

实验动物：清洁级8-10周龄和21 d的C57BL/6母鼠，购于中国医学科学院动物所，动物质量合格证号：SCXK(京)-2004-0001。实验过程中对动物的处置均按照中国医学科学院动物管理条例执行，符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

实验方法：

乳腺细胞的制备和培养：取4只8-10周龄的C57BL/6未孕母鼠，手术取出乳腺脂肪垫，其他程序如文献所述，获取乳腺组织细胞，接种在100 mm²的组织培养皿中^[23]。将细胞培养在BM培养基(DF12、MCDB-201、胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸、亚油酸-牛血清白蛋白、抗坏血酸、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、氢化可的松、100 mg/L青霉素和100 U/mL 硫酸链霉素)或者不同质量浓度的雌激素(筛选4种质量浓度的雌激素：0.3，0.75，1.5和3 μg/L)和不同质量浓度的生长激素(筛选4种质量浓度的生长激素：10，25，50和100 μg/L)。在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，2，4和6 d各换液1次。培养6 d后，使用0.05%胰酶消化10-15 min，40 µm筛网过滤，离心(1 200 r/min×10 min)收集细胞，用于磁珠筛选Sca-1⁺乳腺干细胞^[24]。

细胞免疫荧光检测：制备的乳腺器官样小体置于6孔板中放置的盖玻片上，在BM培养基中培养6 d，用PBS洗3次，-20 ℃条件下用体积分数90%乙醇固定10 min，0.1% Triton-X100破膜10 min，体积分数10%正常阻断血清的PBS孵育20 min，使用FITC直标的一抗 Sca-1(1 mg/L)或羊抗鼠vimentin(1∶200)孵育20 min，PBS洗涤后，FITC标记的兔抗羊抗体(1∶100)孵育30 min，Hoechst3342 (1 mg/L)染色 2 min，在荧光显微镜下观察。

磁珠筛选：制备的乳腺器官样小体在MaECM培养基中培养6 d，使用Stemcell Technologies公司的磁珠筛选试剂盒分离Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群。过程如下：使用0.05%的胰蛋白酶消化10-15 min，离心(1 200 r/min×10 min)，弃上清，用含1 mmol/L EDTA和体积分数2%胎牛血清的PBS重悬细胞。然后按照磁珠筛选试剂盒的实验流程，吸在磁石的为Sca-1⁺细胞群，流出的液体再在磁石上过柱4次，流出液体收集的细胞即为Sca-1^-细胞群。

移植实验：取21 d的C57BL/6母鼠8只，麻醉后手术清除双侧4^#乳腺的脂肪垫，磁珠筛选的的Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群悬浮在含0.04%锥虫蓝和50%血清的PBS中，各取1×10⁴细胞种植在4只鼠双侧脂肪垫上。种植4周后，让鼠交配，在种植后6-8周，取出双侧乳腺脂肪垫，卡红整体染色。照相后，对代表性的乳腺脂肪垫进行苏木精-伊红染色。

由于供体鼠和受体鼠是同一种鼠，因此判断是否移植成功主要依据文献[21]，判断的标准主要是：在脂肪垫上生成的乳腺结构有中心，且向不同的方向生长，就认为是移植成功生成的乳腺结构。

主要观察指标：①不同培养基对乳腺器官样小体培养后形态的影响。②成纤维细胞的鉴定和表达。③磁珠筛选Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群的纯度。④Sca-1⁺细胞发育成乳腺结构的潜能。

全文链接：

讨论

综上所述，本实验通过优化组合雌激素和生长激素，筛选出适合乳腺干细胞生长的MaECM培养基。MaECM培养基可以有效抑制成纤维细胞的生长，快速地促进乳腺上皮细胞的增殖。应用MaECM培养基，作者证实培养的乳腺器官样小体中分离的Sca-1⁺细胞具有乳腺干细胞的潜能。在BM培养基培养的乳腺器官样小体中，发现大量的Sca-1⁺成纤维细胞，可能是Sca-1作为乳腺干细胞标志争议的原因。因此，本实验筛选的MaECM培养基可能成为适用培养乳腺干细胞的培养基，具有开发的潜能。
本实验在BM培养基培养乳腺器官样小体6 d后，观察到器官样小体形成的集落结构很小，在集落周围充满大量的成纤维细胞。这些成纤维细胞和乳腺干细胞存在一些相同的表面标记，可能是通过细胞表面标志分离乳腺干细胞引起争议的原因，例如Sca-1。Welm等^[24]在乳腺干细胞脂肪垫移植实验中，将1×10⁴或者5×10⁴ Sca-1阳性或者 Sca-1阴性细胞种植到乳腺脂肪垫中，发现Sca-1阳性细胞可以发育成乳腺结构，而 Sca-1阴性细胞不能发育成乳腺结构，因此认为Sca-1具有富集乳腺干细胞的作用。Shackleton等^[22]在乳腺干细胞实验中，没有发现Sca-1具有富集乳腺干细胞的潜能。因此，Sca-1是否能够分离乳腺干细胞，是一个有争议的问题。在鼠耳朵、脑组织中均发现成纤维细胞表达Sca-1；体外培养的鼠成纤维细胞91%表达Sca-1；在骨髓来源的成纤维细胞中均检测到Sca-1的表达^[29-34] 。从本实验结果和上述多个文献看，部分成纤维细胞可能表达Sca-1。在乳腺组织和培养的乳腺细胞中，含有大量的成纤维细胞，这些Sca-1阳性的成纤维细胞可能是造成不同的实验室分离Sca-1阳性乳腺干细胞争议的原因^[35] 。
现在不同的实验室分离成纤维细胞的方法不同。Sleenman等^[21]在分离乳腺干细胞的实验中，通过培养细胞的黏附时间不同去除成纤维细胞。成纤维细胞在培养1 h后黏附在培养皿中，而上皮细胞这个时候没有黏附，通过这种方法去除成纤维细胞。在一些分离乳腺干细胞的实验中，没有提到分离成纤维细胞^{[22，25，36-37]} 。在这些方法中，无论是分离成纤维细胞的方法还是没有分离长纤维细胞，作者认为成纤维细胞可能影响乳腺干细胞的分离。本实验筛选的MaECM培养基可以有效的抑制成纤维细胞的生长，可以在分离乳腺干细胞的实验中有效的去除成纤维细胞。
本实验筛选的MaECM培养基可以促进乳腺上皮细胞增殖和抑制成纤维细胞生长，机制可能与雌激素有关。BM培养基和MaECM培养基不同的是雌激素和生长激素。考虑到乳腺发育在青春期伴随着雌激素的分泌，而生长激素在出生后对细胞生长发挥作用，推断雌激素在调控乳腺上皮细胞和成纤维细胞生长中扮演关键的角色^[38-39] 。在其他的实验研究中也发现相似的结果。在乳腺组织中，雌激素α受体只是在乳腺上皮细胞中表达，在成纤维细胞中不表达；雌激素β受体在乳腺上皮细胞和成纤维细胞中均表达。实验显示雌激素α受体和β受体有互相拮抗的作用：雌激素α受体促进细胞增殖，而雌激素β受体有促进细胞凋亡的作用^[40-41] 。上述研究在分子机制上支持雌激素可以促进乳腺上皮细胞的增殖和抑制成纤维细胞的生长。
雌激素可能具有促进乳腺干细胞增殖的作用。Clarke等^[42]报道ERa阳性的乳腺具有干细胞的潜能，能够通过非对称分裂生成干细胞和分化的乳腺细胞。Booth等^[43-44]发现一部分ERa阳性的乳腺细胞是乳腺干细胞，能够通过非对称分裂，雌激素能够促进乳腺干细胞增殖。上述实验支持本实验筛选的培养基可以促进乳腺干细胞的增殖。应用MaECM培养基，可以解决在乳腺干细胞实验中耗费大量鼠的难题，如文献报道需要消耗20只鼠^[21] 。
尽管本实验发现雌激素能够促进乳腺上皮细胞的增殖以及抑制成纤维细胞的生长，但是并没有提供这些现象的机制，进一步的实验需要解释雌激素导致乳腺上皮细胞和成纤维细胞生长不同的原因。同时，本实验室提出，成纤维细胞具有亚全能干细胞的潜能，可以发育成各种组织^[45] 。探索成纤维细胞是否能够发育成乳腺细胞，分析成纤维细胞和乳腺干细胞之间的关系，也是本实验室下一步科研工作的重点。

乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证

Creation and effectiveness of mammary stem cell medium

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.