复合胰岛素样生长因子1壳聚糖胶原支架与人牙周膜细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰岛素样生长因子1具有促进成纤维细胞有丝分裂的作用，同时具有促进牙周细胞生长、分化及合成细胞外基质的作用。
目的：观察负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架对于人牙周膜细胞增殖的作用。
方法：将人牙周膜细胞分别接种于负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架与普通胶原支架上，于接种的1 h、24 h及1周检测重组人转化生长因子β1的释放，于第1，7，28天检测两组细胞的黏附和增殖情况。
结果与结论：负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组第1，24小时和第1周的重组人转化生长因子β1释放率明显低于普通胶原支架组(P < 0.01)。两组接种第1天的细胞黏附和增殖检测比较差异无显著性意义 (P > 0.05)，负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组接种第7，28天的细胞黏附和增殖情况优于普通胶原支架组(P < 0.01)。表明负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架可显著促进人牙周膜细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 胰岛素样生长因子1, 壳聚糖胶原支架, 牙周膜细胞, 增殖

Abstract:

BACKGROUND: Insulin-like growth factor-1 can promote mitosis of fibroblasts as well as periodontal cell growth, differentiation and synthesis of extracellular matrix.
OBJECTIVE: To observe the effects of chitosan/collagen composite scaffold carrying insulin-like growth factor-1 on proliferation of human periodontal ligament cells.
METHODS: The human periodontal ligament cells were seeded on chitosan/collagen composite scaffold carrying insulin-like growth factor-1 and ordinary collagen scaffold. The release of recombinant human transforming growth factor-β1 was detected at 1, 24 hours and 1 week after culture; cell adhesion and proliferation were detected at days 1, 7 and 28.
RESULTS AND CONCLUSION: The release rate of recombinant human transforming growth factor-β1 in the composite scaffold was significantly lower than that in the ordinary collagen scaffold at 1, 24 hours and 1 week after cell seeding (P < 0.01). The cell adhesion and proliferation showed no difference between two groups at day 1 after cell seeding, but became significantly higher in the composite scaffold than that in the ordinary collagen scaffold at days 7 and 28 (P < 0.01). These findings indicate that chitosan/collagen composite scaffold carrying insulin-like growth factor-1 can significantly promote the proliferation of the human periodontal ligament cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, insulin-like growth factor I, chitosan, collagen

中图分类号:

R318

赵博，王永兰. 复合胰岛素样生长因子1壳聚糖胶原支架与人牙周膜细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1231-1236.

Zhao Bo, Wang Yong-lan. Insulin-like growth factor-1/chitosan/collagen composite scaffold and the proliferation of human periodontal ligament cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1231-1236.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

牙周病治疗的最终目的是使被病变破坏的牙周组织恢复其原有的结构和功能^[1]。牙周韧带、牙骨质和牙槽骨为牙周组织修复中的主要针对部位。人牙周膜细胞作为具有多种分化潜能的异质性多能干细胞，具有着形成牙骨质、牙槽骨和牙周韧带细胞的能力，其在对于牙周组织结构及功能的恢复有着重要的作用^[2-4]。而胰岛素样生长因子1作为重要的有丝分裂原之一，有着促进成纤维细胞进行有丝分裂的作用，同时也有着促进细胞生长、分化及细胞外基质合成的作用^[5-6]。研究显示，胰岛素样生长因子1可以通过增加人牙周膜细胞骨钙素分泌来促进人牙周膜细胞的成骨活性，同时促进其纤维结合蛋白合成增加^[7-10]。

姚春宇等^[4]探讨成骨生长肽和胰岛素样生长因子1对体外培养的人牙周膜细胞增殖及其总蛋白含量的影响，结果发现成骨生长肽明显促进人牙周膜细胞增殖，第3天最大显效浓度为10^-9 mol/L，最小显效浓度为10^-¹¹ mol/L；胰岛素样生长因子1也促进人牙周膜细胞增殖，第3天最大显效浓度为100 µg/L，最小显效浓度为1 µg/L；在第1，3，6天，成骨生长肽与胰岛素样生长因子1最大显效浓度联合和最小显效浓度联合，对人牙周膜细胞增殖活性和细胞内总蛋白合成的促进作用均较对照组增加，表明成骨生长肽和胰岛素样生长因子1均可促进人牙周膜细胞增殖和细胞内总蛋白含量的提高，在一定范围内呈浓度时间依赖关系，二者联合具有协同效应。

郑巍等^[6]探讨胰岛素样生长因子1是否影响人牙周膜干细胞的成骨能力。实验分离、培养牙周膜干细胞后分为两组，对照组和实验组(经胰岛素样生长因子1诱导)，进行矿化能力检测、实时定量RT-PCR检测、碱性磷酸酶活性检测。结果显示实验组人牙周膜干细胞体外矿化能力、Runx2，Collagen type I，Osteocalcin的表达以及碱性磷酸酶活性明显强于对照组，表明胰岛素样生长因子1影响人牙周膜干细胞在体外的成骨能力。

作为细胞合成、广泛存在于骨、软骨、皮肤及其他结缔组织的重要细胞外基质，胶原在人体细胞黏附、生长中至关重要，I型胶原占生物体胶原总量的90%，是牙周膜的主要成分^[11]。壳聚糖具有极好的可降解性及可塑性，在生物医学领域为得以广泛应用的生物材料^[12]。实验观察负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架对人牙周膜细胞增殖的作用。

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材料方法

设计：体外细胞-支架材料共同培养实验。

时间及地点：于2011年5月至2012年12月在天津医科大学口腔医院中心实验室完成。

材料：

支架：壳聚糖-胶原支架由天津医科大学口腔医院中心实验室提供。常规I型鼠尾肌腱来源的胶原支架(德国merk公司)。

主要试剂、仪器：
试剂及仪器	来源
胰岛素样生长因子1	Calbiochem，USA
DMSO	MP
胰蛋白酶、MTT	Sigma
抗细胞角蛋白单克隆抗体、抗波形丝蛋白单克隆抗体	博士德
胎牛血清、DMEM高糖培养基	HYCLONE
扫描电镜	Quanta 400
细胞培养箱	Thermo
酶联免疫检测仪	BIO RAD
倒置相差显微镜	Nikon
碱性磷酸酶试剂盒	南京建成
重组人转化生长因子β1 ELISA检测试剂盒	R&D,美国

实验方法：

胰岛素样生长因子1复合壳聚糖-胶原支架：将由鼠尾肌腱中提取的I型胶原0.4 g加入乙酸(浓度为0.5 mmol/L)，同时配置2%壳聚糖溶液，两者以3∶1质量比混合，配成质量浓度为5 g/L的溶液。随后将配制好的溶液注入DMEM高糖培养基中，在-20 ℃的温度下冷冻成型，并冻干。随后于体积分数75%乙醇浸泡后应用胎牛血清冲洗，去除乙醇，随后将材料再次溶于乙酸，配制成(乙酸∶实验材料)1∶1比例的混合溶液，加入胰岛素样生长因子1后再次冻干，形成10 mm×10 mm×5 mm的支架，其中每个支架中含 200 ng胰岛素样生长因子1，备用(图1)。

人牙周膜细胞的培养^[13-16]：选取因正畸需要拔除所拔除的无龋病及无龈炎的前磨牙(来源于天津医科大学口腔医院，供者知情同意)，除去血液后刮取根中1/3部位的牙周膜组织，贴于培养瓶底，加含胎牛血清及DMEM培养液的溶液于37 ℃下孵育，随后应用胰蛋白酶消化法进行传代，取4-7代细胞用于实验。

人牙周膜细胞在复合支架上的原代培养和来源鉴定：将制备好的牙周膜细胞，并用0.25%的胰酶消化，并稀释至浓度1×10⁹ L^-1，随后应用移液枪缓慢将标本加至置于六孔板的负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖-胶原支架与普通胶原支架中，每块支架加入100 µL，并进行细胞培养。培养7 d时首次换液，去除未贴壁的细胞，用0.25%胰酶消化，按1∶2传代，以后每3 d换1次液。细胞用ABC法染色，细胞表现为抗波形丝蛋白阳性，抗角蛋白阴性，证明所培养的细胞是来源于中胚层的成纤维细胞。取生长良好的第4代牙周膜细胞用于实验。

主要观察指标：

支架上重组人转化生长因子β1释放的检测：于每块样本中分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液 2 mL，于37 ℃条件下在转速为100 r/min的摇床中进行制备。于1 h、24 h及1周3个时间点采用复合重组人转化生长因子β1 ELISA试剂盒进行样本检测并计算在对应时间内复合重组人转化生长因子β1的释放速度。

细胞黏附和增殖检测：两组支架均接种人牙周膜细胞，于24 h后再次加入DMEM培养液并继续培养。分别于第1，7，28天时在两种支架中加入高糖DMEM 900 µL及MTT 100 µL继续培养。并于后4 h，测定每块的吸光度值。

统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行检测，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验；计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

牙周病是临床常见的口腔疾病之一，轻者可严重影响患者的生活质量，重者甚至可并发血液感染而危及患者生命^[17]。目前对于牙周疾病的治疗已成为临床重点研究的重点。目前临床治疗本病的目标主要为促进牙周组织再生，并使牙周出现新附着^[18-20]。近年来，对于本病的临床研究，其重点主要在于促进牙周病患者牙周尚存的健康牙周膜细胞再生，从而达到恢复牙周结构及功能的目的^[21-22]。

胰岛素样生长因子1属于生长因子之一，其有着很好的再生及分化作用^[23-26]。研究显示，胰岛素样生长因子1在牙周细胞的迁移、附着、增殖和分化等再生过程中均有着十分重要的作用。例如有研究了解胰岛素样生长因子1在三维培养条件下对人牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响。实验通过组织块法分离培养人牙周膜细胞，采用旋转细胞培养系统建立三维培养环境，将细胞分为4组，分别为阴性对照组、阳性对照组(三维培养组、胰岛素样生长因子1组)、实验组(三维培养加胰岛素样生长因子1组)。各组细胞分别培养1，3，5，7 d。采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测各组各时间点细胞增殖情况，分光光度计法检测碱性磷酸酶活性。结果显示与阴性对照组相比，三维培养加胰岛素样生长因子1组细胞增殖自3 d时显著增加(P < 0.05)，且高于三维培养组(P < 0.05)。在培养3，5，7 d时，三维培养加胰岛素样生长因子1组碱性磷酸酶活性显著高于阴性对照组(P < 0.05)；与三维培养组相比，三维培养加胰岛素样生长因子1组碱性磷酸酶活性在3，5，7 d均显著增高(P < 0.05)，说明胰岛素样生长因子1在三维培养条件下仍可显著促进人牙周膜细胞的增殖及其碱性磷酸酶活性。还有学者研究胰岛素样生长因子1对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响，实验将生长状态良好的转染胰岛素样生长因子1的人牙周膜成纤维细胞和未转染胰岛素样生长因子1的人牙周膜成纤维细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，经计数后进行接种并计数，绘制成细胞生长曲线，比较两种细胞生长速度的差异；用0.25%胰蛋白酶分别消化转染和未转染胰岛素样生长因子1的人牙周膜成纤维细胞，培养后采用MTT法测定A值，并比较两种细胞增殖活性的差异；采用碱性磷酸酶比色法检测比较转染和未转染胰岛素样生长因子1人牙周膜成纤维细胞的碱性磷酸酶活性。细胞生长曲线显示转染胰岛素样生长因子1人牙周膜成纤维细胞的生长速度高于未转染胰岛素样生长因子1人牙周膜成纤维细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)；转染胰岛素样生长因子1人牙周膜成纤维细胞的增殖能力及碱性磷酸酶活性高于未转染胰岛素样生长因子1人牙周膜成纤维细胞，差异有显著性意义(P < 0.05或 P < 0.01)，说明胰岛素样生长因子1可能通过人牙周膜成纤维细胞发挥其调节牙周组织改建的作用。

有实验表明胰岛素样生长因子1对人牙周膜细胞的有丝分裂有影响。同时也有报告显示联合应用胰岛素样生长因子1及血小板衍化生长因子对于牙周再生有着治疗的作用^[27]。例如有研究观察血小板衍生生长因子BB与胰岛素样生长因子1联合应用对大鼠正畸牙压力侧牙周膜细胞中整合素β3蛋白表达的影响。实验建立SD大鼠正畸牙移动模型，隔日于正畸牙颊侧牙龈黏膜下单独或联合注射10 ng血小板衍生生长因子BB及200 ng胰岛素样生长因子1，加力10 d后处死大鼠，取材用免疫组织化学方法检测正畸牙压力侧牙周膜细胞中整合素β3的表达。结果显示，血小板衍生生长因子BB、胰岛素样生长因子1单独或联合应用均能增强压力侧牙周膜细胞中整合素β3表达；与血小板衍生生长因子BB、胰岛素样生长因子1单独应用比较，胰岛素样生长因子1加血小板衍生生长因子BB组牙周膜细胞中整合素β3表达明显增强(P < 0.05和P < 0.01)。证实外源性血小板衍生生长因子BB和胰岛素样生长因子1在大鼠正畸牙的局部注射能上调压力侧牙周膜细胞中整合素β3表达，二者联合应用具有协同效应。故实验将胰岛素样生长因子1作为主要观察的影响因素。同时因牙周膜细胞是牙周膜的重要组成部分之一，因其具有分化潜能，在牙周膜的形成与修复中起着重要作用，是牙周组织再生与新附着形成的重要成分。因此促进牙周膜细胞在种植体一组织界面的黏附、增殖与分化，对于牙周膜的再生与修复具有重要意义^[28-29]，其含量充足对于牙周疾病的治疗有着十分重要的积极意义。但是，对于已患有牙周疾病的患者，其牙周部位存在的牙周膜细胞含量较少，如仅靠其种植界面内所存在的机体自身牙周膜细胞来达到修复牙周损伤的目的，其作用效果并不理想^[30]。因此实验应用胰岛素样生长因子1作为刺激因素，对牙周组织在胰岛素样生长因子1作用下牙周膜细胞的含量改善问题进行观察。结果显示：在含有胰岛素样生长因子1复合支架的作用下，牙周细胞黏附和增殖在培养1天两组比较未见明显差异，但是在培养第7，28天比较负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组明显高于普通胶原组。可见应用胰岛素样生长因子1可促进牙周细胞的进一步黏附和增殖。同时实验显示负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原对于复合重组人转化生长因子β1的释放更持久，普通胶原组在应用24 h后已基本释放完全，而负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原组在应用1周后其仍有良好的释放效果。可见应用负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架可使药物的释放更均衡，治疗的作用更持久，更有利于患者的治疗。

牙周组织形成是一个非常复杂的三维过程，因此牙周膜细胞体外培养模型的建立已成为研究牙周病病因、病理及治疗等的重要手段。也正因为如此支架的选择尤为重要。胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。胶原在各种动物中都有存在。脊椎动物中腱、软骨和骨中的胶原非常丰富，几乎占了蛋白总质量的一半。有研究观察不同质量浓度胶原蛋白膜对人牙周膜细胞增殖能力的影响，寻求牙周组织工程中胶原蛋白膜载体的最佳浓度。实验将细胞浓度为5×10⁷ L^-1的第3-8代人牙周膜细胞接种到3，6，9 g/L胶原蛋白膜上，然后分别将负载细胞的薄膜移至24孔板中，对照组为细胞直接接种于24孔板中。实验评估：①复合培养第7天对人牙周膜细胞进行细胞记数。②利用扫描电镜观察人牙周膜细胞在胶原蛋白膜上的生长情况。结果显示：①复合培养第7天人牙周膜细胞记数：随着培养时间的增长，3，6，9 g/L胶原蛋白膜上的细胞数量逐渐增加，9 g/L胶原蛋白膜上的细胞生长最旺盛，均高于对照组，4组之间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。②扫描电镜下人牙周膜细胞在胶原蛋白膜上的生长情况：复合培养1周，胶原蛋白膜具有较好的多孔状结构；人牙周膜细胞伸出多个伪足样突起，紧密贴附在材料表面，细胞沿材料的孔隙边缘生长。证实9 g/L胶原蛋白膜最适合人牙周膜细胞生长增殖。壳聚糖是从甲壳类动物外壳提取出来的由N-乙酰基氨基葡萄糖和N-氨基葡萄糖随机共聚形成直链纯天然多糖，也是自然界惟一具有弱阳性离子型电解质的复合物，具有良好的生物相容性。有研究制备壳聚糖屏障膜，观察其微观结构，以及在体外培养条件下壳聚糖膜对牙周膜细胞增殖的影响。实验采用相分离法制备壳聚糖膜，利用扫描电镜观察微观结构，MTT法评价壳聚糖膜对牙周膜细胞体外增殖的影响。结果显示于-5 ℃将20 g/L的壳聚糖液冷冻干燥可制备出孔隙率90%，孔隙直径介于50-100 μm的壳聚糖膜，这种壳聚糖膜具有促进牙周膜细胞体外增殖的效应，证实壳聚糖膜适合作为引导性组织再生屏障膜。另有研究评估新型壳聚糖-胶原支架材料的体外生物相容性，实验通过MTT法评估100%，75%，50%，25%壳聚糖-胶原支架材料浸提液对人牙周膜细胞的毒性。选择第4-6代生长状态良好的人牙周膜细胞与壳聚糖-胶原支架共培养，观察细胞在支架上的生长情况，并检测与壳聚糖-胶原支架复合培养前后人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的变化。结果显示，新型壳聚糖-胶原支架具有双层结构，一侧表面致密，一侧表面疏松多孔。MTT法检测不同浓度材料浸提液毒性评级为0或1级。扫描电子显微镜及组织学观察可见细胞在壳聚糖-胶原支架上增殖良好，且致密层可起屏障膜作用，阻挡细胞进入支架内部；复合培养24 h后，人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性与复合培养前比较差异无显著性意义(P > 0.05)，复合培养48，72 h后人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性高于复合培养前(P < 0.05)。以上结果提示新型壳聚糖-胶原支架具有良好的生物相容性及屏障功能，可进一步应用于牙周组织工程的研究。

综上所述，负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架可显著促进牙周膜细胞的增殖且作用持久。由此可见，在牙周疾病患者中应用以复合胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架作为基础进行治疗时，可显著提高牙周疾病患者残差牙周组织中牙周膜细胞的活性，加快其增殖，更有利于提高治疗效果。

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延伸阅读

胰岛素样生长因子1属于生长因子之一，其有着很好的再生及分化作用。研究显示，胰岛素样生长因子1在牙周细胞的迁移、附着、增殖和分化等再生过程中均有着十分重要的作用。有实验表明胰岛素样生长因子1对人牙周膜细胞的有丝分裂有影响。同时也有报告显示联合应用胰岛素样生长因子1及血小板衍化生长因子对于牙周再生有着治疗的作用。故实验将胰岛素样生长因子1作为主要观察的影响因素。同时因牙周膜细胞是牙周膜的重要组成部分之一，因其具有分化潜能，在牙周膜的形成与修复中起着重要作用，是牙周组织再生与新附着形成的重要成分。因此促进牙周膜细胞在种植体一组织界面的黏附、增殖与分化，对于牙周膜的再生与修复具有重要意义，其含量充足对于牙周疾病的治疗有着十分重要的积极意义。但是，对于已患有牙周疾病的患者，其牙周部位存在的牙周膜细胞含量较少，如仅靠其种植界面内所存在的机体自身牙周膜细胞来达到修复牙周损伤的目的，其作用效果并不理想。因此实验应用胰岛素样生长因子1作为刺激因素，对牙周组织在胰岛素样生长因子1作用下牙周膜细胞的含量改善问题进行观察。结果显示：在含有胰岛素样生长因子1复合支架的作用下，牙周细胞黏附和增殖在培养1天两组比较未见明显差异，但是在培养第7，28天比较负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组明显高于普通胶原组。可见应用胰岛素样生长因子1可促进牙周细胞的进一步黏附和增殖。同时实验显示负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原对于复合重组人转化生长因子β1的释放更持久，普通胶原组在应用24h后已基本释放完全，而负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原组在应用1周后其仍有良好的释放效果。可见应用负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架可使药物的释放更均衡，治疗的作用更持久，更有利于患者的治疗。

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