低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 81-87.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.014

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低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

程涛¹，余洋¹，张小磊²，郑亦静¹，楼宇梁¹，洪建军¹

1温州医科大学附属第二医院骨科，浙江省温州市 325027
2浙江大学医学院干细胞与组织工程研究中心，浙江省杭州市 310058

修回日期:2013-10-13 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 洪建军，硕士，主任医师，硕士生导师，温州医科大学附属第二医院骨科，浙江省温州市 325027
作者简介:程涛，男，1988年生，安徽省霍山县人，汉族，温州医科大学在读硕士，主要从事创伤骨科方面的研究。
基金资助:
温州市科技局科研基金资助项目(Y20100211)

Tenogenic differentiation of adipose-derived stem cells in hypoxia

Cheng Tao¹, Yu Yang¹, Zhang Xiao-lei², Zheng Yi-jing¹, Lou Yu-liang¹, Hong Jian-jun¹

1Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, Zhejiang Province, China
2Center for Stem Cells and Tissue Engineering, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang Province, China

Revised:2013-10-13 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Hong Jian-jun, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, Zhejiang Province, China
About author:Cheng Tao, Studying for master’s degree, Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, Zhejiang Province, China
Supported by:
the Scientific Research Foundation of Wenzhou Science and Technology Department, No. Y20100211

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪间充质干细胞在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视，研究其诱导分化的有利环境(氧体积分数)尤为必要。
目的：将脂肪间充质干细胞与跟腱细胞在不同氧体积分数条件下间接共培养，比较氧体积分数对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化能力的影响。
方法：无菌条件下获取SD大鼠跟腱细胞。SD大鼠脂肪间充质干细胞直接购买，经培养传至第1代后，与跟腱细胞一起在常氧(体积分数20%)和低氧(体积分数2%)条件下经Transwell间接共培养体系共培养。在培养7，14和21 d，实时荧光定量PCR检测跟腱细胞的特异指标胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ，Tenomodulin，Thrombospondin-4，Scleraxis基因相对表达量，免疫荧光染色法检测胶原蛋白Ⅰ和Thrombospondin-4蛋白表达量。
结果与结论：脂肪间充质干细胞与跟腱细胞经间接共培养后，低氧组检测到的跟腱细胞的相关特异指标在基因和蛋白水平上表达水平均高于常氧组。提示氧体积分数可显著影响脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的潜能，低氧是脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的有利条件之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 跟腱细胞, 低氧, 常氧, 共培养, 腱向分化

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells are gaining widespread interest in the Achilles tendon tissue engineering and regeneration, and an enabling environment (oxygen concentration) for cell induction and differentiation is particularly necessary.
OBJECTIVE: To co-culture adipose-derived mesenchymal stem cells with primary tenocytes in standard culture condition (20% O2 tension) and in an atmosphere of reduced oxygen (2% O2 tension) in order to determine whether the two conditions differ in their effect on tenogenic differentiation.
METHODS: Tenocytes were isolated via serial expansion in culture from several Sprague-Dawley rats’ Achilles tendons. Adipose-derived mesenchymal stem cells were purchased. After one passage, adipose-derived mesenchymal stem cells were indirectly co-cultured with tenocytes in standard culture condition (20% O2 tension) and in an atmosphere of reduced oxygen (2% O2 tension). Collagen 1, collagen 3, Tenomodulin, Thrombospondin-4, Scleraxis levels were compared for each culture condition at 7, 14 and 21 days following co-culturing. Immunofluorescence staining was performed to evaluate production of collagen 1 and Thrombospondin-4.
RESULTS AND CONCLUSION: Following indirect co-culturing, hypoxic differentiated adipose-derived mesenchymal stem cells expressed higher levels of tendon-related genes and proteins than normoxic controls, which suggest that oxygen levels can significantly affect tenogenic differentiation, and hypoxia is advantageous for efficient differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro for tendon tissue engineering.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, Achilles tendon, anoxia

中图分类号:

R394.2

程涛，余洋，张小磊，郑亦静，楼宇梁，洪建军. 低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 81-87.

Cheng Tao, Yu Yang, Zhang Xiao-lei, Zheng Yi-jing, Lou Yu-liang, Hong Jian-jun. Tenogenic differentiation of adipose-derived stem cells in hypoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 81-87.

图/表（结果） 3

2.1 跟腱细胞鉴定 从SD大鼠跟腱处获取的细胞经免疫荧光染色鉴定实验，发现跟腱细胞特异指标胶原蛋白Ⅰ和Thbs4强阳性表达而脂肪间充质干细胞表达阴性。该结果符合跟腱细胞胶原和蛋白分泌特点(图1)，可作为免疫荧光染色实验阳性对照组。

2.2 实时荧光定量PCR检测 脂肪间充质干细胞与跟腱细胞共培养第7天和第14天，常氧组(体积分数20%O₂)与低氧组(体积分数2%O₂)的胶原蛋白Ⅰ相对表达量分别上升为诱导前的8.6，11.9倍和11，16.8倍，2组间差异无显著性意义(P=0.37/0.16)。当第21天时，常氧组胶原蛋白Ⅰ表达量为诱导前的20倍，低氧组为33.8倍，在不同氧体积分数(2% vs. 20%)条件下的胶原蛋白Ⅰ表达量差异有显著性意义(P=0.004)(图2A)。

2.3 胶原蛋白Ⅰ与Thbs4免疫荧光染色 在诱导分化的第7，14，21天，常氧组胶原蛋白Ⅲ的表达量分别为诱导前的4.6，14和19倍，而低氧组为8，21和61倍，只有在第7天时，2组差异无显著性意义(P=0.08，图2B)。常氧组的Tnmd相对表达量分别为诱导前的7.4，16.4和26.4倍，低氧组为9.8，19.7和40倍，在第21天时，2组间Tnmd的表达量差异有显著性意义(P=0.022，图2C)。常氧组的Thbs4在诱导分化第7，14，21天相对表达量分别为诱导前的5.3，11.2和18.7倍，而低氧组的表达量呈现明显上升趋势，分别达到诱导前的8.4，18.2和37.7倍；在第14和21天，2组相对表达量差异有显著性意义(P < 0.05)，(图2D)。在共培养的第14和21天，Scx相对表达量与上述Thbs4基本一致，也在第14和21天时，两组差异有显著性意义(P < 0.05)(图2E)。

为进一步验证实时荧光定量PCR的结果，采用免疫荧光染色法进一步观察胶原蛋白Ⅰ和Thbs4的蛋白表达量。胶原蛋白Ⅰ与Thbs4在2种氧浓度条件下，在诱导前(第0天)脂肪间充质干细胞2个指标均阴性表达，诱导分化后的染色强度均随共培养时间的延长而逐渐增强。胶原蛋白Ⅰ在第21天时，低氧组的荧光染色强度明显要高于常氧组(图3)，这与实时荧光定量PCR结果基本相符。低氧组中的Thbs4在第14天时荧光染色就已明显呈阳性表达，在随后培养过程中逐渐增强。相比而言，常氧组Thbs4荧光染色增强幅度则比较缓和(图4)。

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引言

材料方法

设计：双样本观察实验。

时间及地点：于2012年5月至2013年4月在温州医科大学骨科研究所(省重点实验室)完成。

材料：

实验动物：成年SD大鼠18只，雌雄不限，体质量100-120 g，平均106.5 g，由温州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(浙)2009-0129。实验过程中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

脂肪间充质干细胞培养：从液氮箱中取出冻存管后，将其置于37 ℃水浴箱中，3 min内迅速完成解冻。 1 000 r/min、5 min离心细胞悬浮液，弃去上清液，用含体积分数15%胎牛血清和1%青链霉素混合物的SD大鼠间充质干细胞生长培养基再次悬浮沉淀细胞并将其接种于细胞培养瓶，置于37 ℃、体积分数5% CO₂常氧培养箱中培养。每3 d换1次液，细胞铺满80%-100%后传代，P1代细胞用于本次实验^[15-16]。

跟腱细胞获取、培养以及鉴定：取成年SD大鼠, 从大鼠后肢获取跟腱组织，去除腱鞘包膜后将其剪碎至约1 mm× 1 mm×1 mm。10 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化跟腱组织碎片5 h，之后用200目过滤网过滤。1 000 r/min、5 min离心过滤液，弃上清。PBS悬浮沉淀细胞，再次1 000 r/min、5 min离心。用含体积分数15%胎牛血清和1%青链霉素混合物的DMEM/F12培养基重新悬浮细胞并将其接种于细胞培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂常氧培养箱中培养。每3 d换1次液，细胞铺满80%-100%后传代，P1代细胞用于免疫荧光染色鉴定试验和共培养实验^[17-18]。

大鼠脂肪间充质干细胞与跟腱细胞共培养：细胞间接共培养板中有一孔径为0.4 µm的Transwell小室，可根据实验需要选择不同规格的Transwell小室嵌入6孔板或1孔板中，由此构成上下两个培养室，建立间接共培养体系。以1∶1的比例将1×10⁴/孔的脂肪间充质干细胞接种于下层培养室，跟腱细胞接种于上层培养室。跟腱细胞分泌的诱导因子通过0.4 µm孔径滤膜在上下室间自由移动，模拟跟腱细胞体内生长的微环境，诱导脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化。细胞培养基为含体积分数15%胎牛血清和1%青链霉素混合物的DMEM/F12，培养条件为 37 ℃、体积分数5%CO₂、20%O₂或2%O₂，每3 d换一半培养液。

RNA提取与实时荧光定量PCR检测跟腱细胞相关基因相对表达量：分别在共培养的第0，7，14，21天4个时间点，采用实时荧光定量PCR检测不同氧体积分数条件下分化后的脂肪间充质干细胞跟腱细胞相关特异基因相对表达量。按照操作步骤，采用TRI试剂分别从脂肪间充质干细胞和诱导分化后的脂肪间充质干细胞中提取mRNA，并利用反转录试剂盒合成cDNA。实时荧光定量PCR检测并比较胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、Tenomodulin(Tnmd), Thrombospondin-4(Thbs4)和Scleraxis(Scx)基因相对表达水平。对于每个基因，都用纯水替代cDNA作为阴性对照实验同时进行实时荧光定量PCR操作，以18S rRNA的转录扩增水平对基因表达量进行标准化，独立重复3次实时荧光定量PCR实验，各指标随机引物序列统计如下(表1)。

免疫荧光染色：在共培养诱导分化后的第0，7，14，21天，用免疫荧光染色法观察分化后的脂肪间充质干细胞的胶原蛋白 1和Thbs4蛋白表达量。具体步骤为：室温下，40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，0.5%曲拉通打孔通透 15 min。体积分数5%兔封闭血清或5%山羊封闭血清室温下封闭无关抗原1 h，然后分别孵一抗(山羊抗胶原蛋白 1、兔抗Thbs4)(1∶200)，4 ℃过夜。次日，PBS清洗一抗后，再常温孵二抗(Alexa Fluor 488兔抗山羊或Alexa Fluor 594山羊抗兔)(1∶200)2 h。细胞核染料DAPI标记细胞核，倒置共聚焦显微镜观察培养板各孔荧光染色强度。P1代跟腱细胞的胶原蛋白 1、Thbs4荧光染色作为阳性对照组。

主要观察指标：跟腱细胞免疫荧光染色鉴定；胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白 Ⅲ、Tnmd，Thbs4及Scx基因相对表达量；胶原蛋白Ⅰ和Thbs免疫荧光染色结果。

统计学分析：由本文作者运用PASW Statistic 18.0软件进行数据分析。课题至少独立重复3次实验，所得实验数据以x(_)±s表示。方差分析比较各时间点胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、Tnmd，Thbs4，Scx基因相对表达量差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

2002年日本学者Zuk等^[19]首次发现从脂肪组织中提取的一种细胞(lipoaspirate cells)可像间充质干细胞一样诱导分化成软骨源性、成骨源性、脂肪源性、肌源性等细胞。经分子生物学检测发现该类细胞的多种CD抗原表型与间充质干细胞十分相似，经诱导分化后也可表达多系细胞相关特异基因与蛋白，证实了脂肪组织中也含有间充质干细胞。由于脂肪间充质干细胞来源广泛且取材方便，在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视。Park等^[20]实验证实脂肪间充质干细胞在生长分化因子5刺激作用下可分泌胶原蛋白Ⅰ、氨基多糖等细胞外基质以及跟腱细胞特异蛋白(如scleraxis, tenomodulin，tenascin-C)。Uysal等^[21]分别在实验兔的左右跟腱修复模型上注入血浆和血浆与脂肪间充质干细胞混合液，4周后检测两组跟腱的拉伸强度以及Ⅰ型胶原、转化生长因子β1，2，3、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子的表达。结果表明实验组的拉伸强度以及Ⅰ型胶原、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子的表达均显著高于对照组，而转化生长因子β的表达量低于对照组。对于脂肪间充质干细胞如何提高拉伸强度以及促进Ⅰ型胶原、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子的高表达尚未进一步研究解释。此外，Uysal等^[2]还将脂肪间充质干细胞注射入活体跟腱炎模型，通过免疫组化及生物力学检测分析发现，注有脂肪间充质干细胞的实验组，胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ表达均明显增多，且力学载荷也高于对照组。由此认为脂肪间充质干细胞在体内分化成了有类似跟腱

细胞功能的类跟腱细胞，并评估出在整个分化过程中，脂肪间充质干细胞自身占11.53%的直接作用，而对分化微环境的控制以及生长激素与细胞因子的分泌才是主要的促进因素，因为这往往决定了脂肪间充质干细胞是向跟腱细胞还是向成纤维细胞分化，故作者认为研究优化脂肪间充质干细胞诱导分化环境是十分必要的。

机体的大部分组织都处于生理性低氧环境中，例如骨组织氧体积分数范围在1%-7%^[22]，在脂肪组织中要低于3%^[14]。虽然没有文献报道跟腱组织确切的氧浓度数值，但毫无疑问的是，跟腱组织内的氧浓度应该也是较低的，特别在受损的情况下会更低。因为其血供仅有肌肉组织的1/3^[23]。故作者认为不论是脂肪间充质干细胞还是跟腱细胞都应处于相对低氧的环境中，低氧可能在细胞的增殖、分化以及代谢过程中起着不可或缺的作用。

目前，已有较多关于低氧与脂肪间充质干细胞相关研究报道，Merceron等^[24]研究低氧对脂肪间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化效率的影响，他们发现在低氧环境下，脂肪间充质干细胞分别经向软骨和成骨细胞诱导后,其表达的软骨细胞特异指标会明显上升，相反，成骨细胞相关特异指标表达量，矿化度以及碱性磷酸酶活性则明显降低。该研究结果说明低氧培养环境对脂肪间充质干细胞向不同方向分化的调节作用是不一致的，低氧有利于促进向软骨分化，但却抑制向成骨分化。Valorani等^[25]先将脂肪间充质干细胞在低氧环境中培养1周后，再置于常氧条件下进行诱导分化，研究其成脂分化潜能。结果表明在低氧预培养1周后的脂肪间充质干细胞不仅增殖能力提升，而且其成脂分化潜能也均显著提高。脂肪间充质干细胞由于其来源广泛、易于获取，体外增殖能力较强且具有多向性分化潜能，在干细胞治疗与组织工程领域中具有广泛的应用前景。然而，氧浓度对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化影响尚未见较多文献报道。

实验主要是将大鼠脂肪间充质干细胞分别在标准氧(体积分数20%)和低氧(体积分数2%)条件下与跟腱细胞间接共培养，诱导脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化，比较不同氧浓度组的分化效率。通过实时荧光定量PCR检测跟腱细胞特异指标胶原蛋白 Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、Tnmd，Thbs4和Scx基因表达量，免疫荧光染色检测胶原蛋白Ⅰ和Thbs4蛋白表达量。2组脂肪间充质干细胞与跟腱细胞间接共培养后，测得的跟腱细胞相关基因和蛋白表达量均随培养时间的延长而逐渐增加。其中，低氧组中的胶原蛋白Ⅲ、Thbs4和Scx表达量与常氧组相比均有显著提高，但是，在共培养的第7天时，两组间的所有指标表达量差异均无显著性意义，其中胶原蛋白 1与Tnmd在第14天时差异亦无显著性意义。作者认为这是由于脂肪间充质干细胞是先在常氧培养箱中培养传代至第1代后，再分别置于不同氧体积分数下进行诱导分化。脂肪间充质干细胞在低氧环境中诱导分化前期还处于适应新氧浓度阶段，细胞增殖分化能力尚未激发，Rosova等^[26]通过实验也证实间充质干细胞在2%-5%氧体积分数培养环境中需经历一段增殖滞后期，随后细胞活力以及增殖能力才显著提高，但具体机制尚未阐明，将是本课题组以后的重点研究内容。另外，本次诱导分化实验并未采用含生长分化因子诱导培养基，而是采用跟腱细胞与脂肪干细胞间接共培养诱导分化，作者经文献复习认为间接共培养环境能更好地模拟跟腱体内微环境^{[18, 27-29]}，在该培养体系中，脂肪间充质干细胞可获得来自跟腱细胞分泌的多且全的生长分化因子。Barboni等^[18]将羊膜上皮细胞与跟腱细胞间接共培养后发现来自跟腱细胞释放的分泌因子通过共培养体系可诱导上皮细胞表达跟腱相关基因(TNMD，OCN和SCXB)。Schneider等^[29]通过PKH染色和免疫电镜观察也证实了诱导因子从跟腱细胞分泌后被间充质干细胞所吸收，其他研究也阐明了这一诱导分化效应^[30-31]。

特异指标中的Tnmd属于Ⅱ型跨膜糖蛋白家族，只有成熟跟腱细胞才有较高表达量，常作为向跟腱细胞分化过程中的晚期指标，其在胶原纤维合成过程中可能发挥着重要作用^[32-33]。该实验研究结果表明：仅在诱导分化后的第21天，2组的Tnmd表达量差异才出现显著性意义，可见低氧环境对Tnmd的表达并不像其他相关指标一样敏感。同时说明由于实验诱导时间比较短，诱导后的细胞不全是成熟跟腱细胞，同时存在功能相近的类跟腱细胞。

该实验的不足之处：①实时荧光定量PCR实验数据的较高变异性，存在一定的误差，可能掩盖了其他有意义的结果。②实时荧光定量PCR实验没有设计跟腱细胞阳性对照组，将诱导分化后的脂肪间充质干细胞(即类跟腱细胞)与跟腱细胞直接作对比，以了解不同氧体积分数条件下的脂肪间充质干细胞分化成熟度。③免疫荧光染色强度未做定量分析，缺少客观比较依据。④本实验仅在蛋白和基因水平进行检测研究，至于低氧细胞信号通路尚不清楚，这将是作者下一步研究的重点。

该实验研究表明，与传统常氧(体积分数20%)培养相比，脂肪间充质干细胞在低氧(体积分数2%)条件下，向跟腱细胞分化的效率要更具优势。但是，该实验结果只是在体外细胞培养水平上进行的，在体内或组织层次上，实验结果可能不具重复性，作者今后将在这些层面上继续深入研究。总之，在跟腱组织工程领域中，低氧将是提高脂肪间充质干细胞向跟腱细胞体外诱导分化效率的有利因素之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
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[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
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[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[11]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[12]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
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[14]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
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