贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性的检测方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.013

中国组织工程研究

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贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性的检测方法

刘茜^{1, 2}，兰华林^{1, 3}，顾铭⁴，高敏⁴，王召旭¹

1中国食品药品检定研究院，生物材料与组织工程室，北京市 100050；2江苏省医疗器械检验所，生物安全评价中心，江苏省南京市 210022；3重庆大学生物工程学院，教育部生物流变科学与技术重点实验室，重庆市 400044；4中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室，北京市 100190

收稿日期:2013-07-04 修回日期:2013-07-12 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 王召旭，副研究员，中国食品药品检定研究院，生物材料与组织工程室，北京市 100050 WangZX@nicpbp.org.cn
作者简介:刘茜★，女，1985年生，江苏生泰州市人，汉族，南京师范大学毕业，硕士，主要从事医疗器械生物学评价研究。 liuqian0916@126.com
基金资助:
国家科技部项目(2012BAI18B02)*

Cytotoxicity tests for the mussel adhesive protein dressing for wound healing

Liu Qian1, 2, Lan Hua-lin1, 3, Gu Ming4, Gao Min4, Wang Zhao-xu1

1Laboratory of Biomaterials and Tissue Engineering, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2Center of Biological Safety Evaluation, Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing 210022, Jiangsu Province, China; 3Key Laboratory of Biorheological Science and Technology, Ministry of Education, College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing 400044, China; 4National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Science, Beijing 100190, China

Received:2013-07-04 Revised:2013-07-12 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Wang Zhao-xu, Associate investigator, Laboratory of Biomaterials and Tissue Engineering, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China WangZX@nicpbp.org.cn
About author:Liu Qian★, Master, Laboratory of Biomaterials and Tissue Engineering, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; Center of Biological Safety Evaluation, Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing 210022, Jiangsu Province, China liuqian0916@126.com
Supported by:
the Projects of the Ministry of Science and Technology of China, No. 2012BAI18B02

摘要/Abstract

摘要：

背景：在贻贝粘蛋白创面修复敷料的体外细胞毒性检测中，由于蛋白分子表面带正电荷，1∶9的浸提比会使细胞聚团而导致测定产生误差，影响测定结果。
目的：在已有标准的基础上，根据贻贝粘蛋白特殊的性质及使用状态，改进贻贝粘蛋白创面修复敷料的浸提比例或前处理方法。
方法：①浸提液法：将贻贝粘蛋白创面修复敷料与细胞培养液分别以1∶9、1∶131浸提比例制备浸提液，分别以贻贝粘蛋白创面修复敷料浸提液、天然乳胶浸提液、高密度聚乙烯浸提液及细胞培养液培养L929小鼠成纤维细胞。②直接接触法：分别以蒸馏水、贻贝粘蛋白创面修复敷料溶液、二甲基亚砜及细胞培养液培养L929小鼠成纤维细胞。
结果与结论：采用浸提比1∶9测定样品体外细胞毒性时，细胞产生聚团作用，不适用于样品毒性的检测；调整浸提比为1∶131后，絮凝作用和细胞聚团现象明显降低，提高了检测结果的可信度，显示样品无细胞毒性。直接接触法显示样品无细胞毒性。采用经调整过的浸提液法或直接接触法均可适用于贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性的检测。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 贻贝粘蛋白, 浸提液, 体外细胞毒性, 小鼠成纤维细胞, 医疗器械生物学评价, 部级基金

Abstract:

BACKGROUND: In the cytotoxicity test of the mussel adhesive protein dressing for wound healing, because of positive charge properties of the protein, when extracting ratio is 1:9, the cells exhibit poly-group phenomenon that results in errors in the cytotoxicity test of mussel adhesive protein samples.
OBJECTIVE: According to the existing standards, to improve the leaching proportion and pretreatment of mussel adhesive protein dressing for wound healing based on the special properties and working condition of mussel adhesive protein.
METHODS: (1) Extract method: Extract solution of mussel adhesive protein dressing was prepared with mussel adhesive protein dressing and cell medium at extracting ratios of 1:9 and 1:131. Then, L929 cells were cultured in extract solutions of mussel adhesive protein dressing, natural latex and high-density polyethylene, respectively. (2) Method of direct contact: Distilled water, solutions of mussel adhesive protein dressing, dimethyl sulfoxide and cell medium were used to culture L929 cells.
RESULTS AND CONCLUSION: When the extracting ratio was 1:9, the cells agglomerated which is not suitable for cytotoxicity test. When the extracting ratio was 1:131, flocculated sediment and cell aggregation disappeared, the cytotoxicity test results showed no cytotoxicity with higher reliability. Direct contact method showed the samples had no cytotoxicity. The extract method with adjusted extracting radio or direct contact method can be applied to test the in vitro cytotoxicity of mussel adhesive protein dressing for wound healing.

Key words: mucins, biocompatible materials, biological dressings, cytotoxicity, immunologic

中图分类号:

R318

刘茜，兰华林，顾铭，高敏，王召旭. 贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性的检测方法[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.013.

Liu Qian, Lan Hua-lin, Gu Ming, Gao Min, Wang Zhao-xu . Cytotoxicity tests for the mussel adhesive protein dressing for wound healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.013.

图/表（结果） 3

2.1 浸提液法浸提液法分别采用两种浸提比进行实验，即常规使用的1∶9和按照产品实际使用量确定的浸提比1∶131。
采用常规浸提比1∶9实验时，样品组、阳性对照、阴性对照及空白对照组细胞培养24 h后的形态观察见图1所示：空白对照组及阴性对照组均无胞浆离散颗粒，无细胞溶解，不影响细胞增长；样品组出现絮状沉淀，细胞团聚等现象影响观察；阳性对照细胞层几乎完全或完全破坏，评分结果见表1所示。

当用浸提比为1∶9的样品行体外细胞毒性实验时，由于贻贝粘蛋白在培养基pH下所带有的正电荷，吸引带负电荷的细胞聚团，导致无法评价体外细胞毒性结果。
贻贝粘蛋白创面修复敷料的主要成分贻贝粘蛋白作为生化试剂应用于促进细胞贴壁培养领域已有报道，贻贝粘蛋白的工作浓度从50 μg/cm2至3.5 μg/cm2[5-6]。而根据贻贝粘蛋白创面修复敷料在人体使用的规律(2%人体面积上每天使用量不超过1 mL)计算，贻贝粘蛋白的使用量为3.0 μg/cm2。按照细胞培养使用6孔培养板计算(每孔面积9.5 cm2，每孔中培养基2.5 Ml)，贻贝粘蛋白的质量浓度应为11.4 mg/L，使用培养基浸提蛋白样品的浸提比为1∶131。
采用浸提比1∶131实验时，样品组、阳性对照、阴性对照及空白对照组细胞培养24 h后的形态观察见图2所示：样品组、阴性对照及空白对照组无胞浆离散颗粒，无细胞溶解，不影响细胞增长；阳性对照细胞层几乎完全或完全破坏，评分结果见表2所示。

当采用浸提比为1∶131的样品进行体外细胞毒性实验时，空白对照、阴性对照、阳性对照、样品均获得可信的结果，在此条件下贻贝粘蛋白创面修复敷料的细胞毒性评价结果显示为无细胞毒性。
2.2 直接接触法标准中规定，当采用直接接触法测定液体样品的体外细胞毒性时，液体样品应直接附着或附着到具有生物惰性和吸收性的基质上[4]。细胞培养采用的培养板是生物惰性材料，而且直接接触细胞，因此考虑将贻贝粘蛋白样品直接固化到培养板上，再按照常规方法测定体外细胞毒性。采用直接接触法实验时，样品、阳性对照、阴性对照及空白对照组细胞培养24 h后的形态观察见图3所示：样品组、阴性对照及空白对照无胞浆离散颗粒，无细胞溶解，不影响细胞增长；阳性对照细胞层几乎完全或完全破坏，评分结果见表3所示。

采用直接接触法进行体外细胞毒性实验时，各组均获得可信的结果，在此条件下贻贝粘蛋白创面修复敷料的细胞毒性评价结果显示为无细胞毒性。

参考文献

引言

材料方法

设计：对比观察细胞实验。

时间及地点：实验于2013年1至4月在中国食品药品检定研究院完成。

材料：

细胞系：L929小鼠成纤维细胞株购自北京协和细胞资源中心。

贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性检测方法实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

浸提液法：将样品(贻贝粘蛋白创面修复敷料)、阳性对照(天然乳胶)与阴性对照(高密度聚乙烯)分别用细胞培养液浸提，浸提温度为37 ℃，浸提时间为24 h。空白对照为DMEM细胞培养液。样品、阳性对照及阴性对照分别采用两种浸提比(1∶9和1∶131)进行实验。采用常规浸提比1∶9时，取1 mL贻贝粘蛋白创面修复敷料(或天然乳胶，高密度聚乙烯)加入9 mL培养基浸提；采用浸提比1∶131时，取0.115 mL贻贝粘蛋白创面修复敷料(或天然乳胶，高密度聚乙烯)加入15 mL培养基浸提。

取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞，加入到6孔细胞培养板中，细胞浓度为1×10⁷L^-1，每孔加入2.5 mL样品浸提液，加等量的空白对照和阴性及阳性对照浸提液至其他平行器皿中，37 ℃培养24 h后观察细胞的生长情况。细胞毒性评价采用定性和定量两种评价方法。

定性评价：根据最新版ISO10993.5中细胞毒性定性评价中规定，用显微镜检查细胞(如果需要，使用细胞化学染色)评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态改变可描述性地在实验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法^[5]。

定量评价：根据标准中体外细胞毒性定量评价中的规定，可用客观方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试。目前常用的评价方法是MTT比色法，它采用外源性MTT将活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。细胞培养结束后，在每孔中加入20 µL MTT溶液 (5 g/L，即0.5%MTT)，继续培养4 h，终止培养，并于每孔中加入二甲基亚砜，置摇床上上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪A_{570 nm}处测量各孔的吸光度值，计算细胞活性，评价细胞存活和生长情况。每个样品平行测定3组，并计算相对标准偏差。

体外细胞毒性计分的含义：

接接触法：

样品包被方法：将阴性对照(蒸馏水)，样品溶液(贻贝粘蛋白创面修复敷料为液体产品，产品中蛋白含量为3 g/L，用蒸馏水稀释到0.75 g/L后取0.76 mL的样品溶液)加入6孔细胞培养板中；置55 ℃鼓风干燥箱中2 h完全干燥。空白对照为细胞培养液。

细胞培养方法：取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞，加入包被好样品的6孔细胞培养板中，细胞浓度为1×10⁷ L^-1，每孔2.5 mL，加入阳性对照二甲基亚砜， 37 ℃ 培养24 h后观察细胞的生长情况。观察及评价方法与浸提法相同。

主要观察指标：贻贝粘蛋白创面修复敷料干预前后小鼠成纤维细胞的形态变化。

讨论

体外细胞毒性实验是医疗器械生物学评价体系中最基本的评价指标之一，能反映化学物质对细胞基本结构或生理过程的作用，无论是持久接触、长期接触或短期接触器械，还是植入型、外部接入型或表面器械的生物学评价中均要求检验体外细胞毒性。医疗器械样品的体外细胞毒性检测通常按照GB/T16886.5 及ISO10993.5中体外细胞毒性实验进行，体外细胞毒性的实验方法分成3类：浸提液实验、直接接触实验和间接接触实验，其中应用最为广泛的是浸提液法。医疗器械产品中以固体类产品占绝大多数，采用常规的浸提液法测定较容易得出合理结果，而对于液体类产品，尤其是具有特殊性质的液体类产品的测定容易产生误差。例如在贻贝粘蛋白创面修复敷料的体外细胞毒性检测中，由于蛋白分子表面带正电荷，1∶9的浸提比会使细胞聚团而导致测定产生误差，影响测定结果。因此，有必要在已有标准的基础上，根据贻贝粘蛋白特殊的性质及使用状态，对贻贝粘蛋白创面修复敷料的浸提比例或前处理进行改进，以达到检测其体外细胞毒性的目的。同时要保证所选择的方法在平行样品的测定中具有较好的重现性和合理的误差，阴性、阳性及其他对照物在试验系统中应存在预期反应。

贻贝粘蛋白创面修复敷料的主要成分是贻贝粘蛋白，是由多种结构相似的蛋白亚类构成如Mefp-1，Mefp-2，Mefp-3，Mefp-4，Mefp-5等，这些亚类蛋白虽然分子量跨度较大，但均具有相似的等电点，均为pI>9^[3]。同时，这些亚类蛋白中均含有数量不等的多巴基团，多巴中的邻苯二酚基团(又称儿茶酚)具有亲和多样性和化学多功能性，是贻贝发挥超强粘附功能的关键^[11-16]。正是由于贻贝粘蛋白的这些结构上的特点才使其在创面修复过程中发挥修复作用，促进细胞的爬行、增殖和替代，保持创面湿润，阻碍细菌等病源微生物的生长，促进创面快速愈合^[17-18]。例如，贻贝粘蛋白因结构中赖氨酸的存在(pI>9)使其在人体生理pH下带有正电荷，容易吸引带有负电荷的细胞；因结构中存在大量的DOPA基团，使其易于黏附于固体表面，形成细胞贴壁生长的骨架。正是由于贻贝粘蛋白的这些特征，使其在以细胞作用评价目标的体外细胞毒性测定中表现出假阳性结果。

贻贝粘蛋白的特殊结构使其在pH值或氧化等条件发生变化都可触发凝聚体的凝胶化或交联而快速固化^[17]，这也是以贻贝粘蛋白作为医疗器械产品作用的关键。实验表明贻贝粘蛋白能快速地形成永久性的粘接^[18]，并可粘接各种材料，且贻贝粘蛋白具有很好的生物安全性，对人体无毒性，具有较好的生物可降解性，可被用作环境友好的生物医用黏合剂^[19-21]，同时，不会引起人体产生免疫反应^[22]。在医学方面，贻贝粘蛋白以其优异的性能已得到普遍认可，其中有关其作为细胞核组织黏附因子的报道有很多，其中主要有齿根膜、眼球虹膜、纤毛、肝脏和神经细胞的粘接，但此类研究一直停留在研发阶段，贻贝粘蛋白创面修复敷料是一种以贻贝粘蛋白主要成分的新型医疗器械产品。实验在传统体外细胞毒性检测方法的基础上，结合贻贝粘蛋白的特性，建立了适用于这种特殊蛋白质的检测方法并经实验证明方法具有可行性和良好的重现性。

3.1 浸提液法在贻贝粘蛋白创面修复敷料体外细胞毒性检测中，当采用浸提法时，由于细胞培养液的pH值一般为7.2-7.4，贻贝粘蛋白表面带有大量的正电荷，可以吸引带有负电荷的细胞聚团，影响原本需要贴壁生长细胞的生长环境，使体外细胞毒性的检测产生误差；另外，细胞培养液中含有多种金属离子和血清，这些都导致浸提比为9∶1时贻贝粘蛋白在细胞培养液中发生了变化，产生了絮状沉淀，从而不能检测其对细胞的毒性作用。

当根据贻贝粘蛋白创面修复敷料在临床上的使用特点计算获得的蛋白使用量来测定体外细胞毒性时，由于样品用量降低，在细胞培养体系中发生的相互作用降低，从而可以获得合理的测定结果。为大剂量时样品的细胞毒性，作者放大样品量，选用直接接触法进一步实验。

3.2 直接接触法直接接触法测定液体产品的体外细胞毒性时，通常采用滤膜作为吸附介质，前期实验结果显示，将滤膜置于贻贝粘蛋白溶液中浸泡前后溶液中的蛋白含量没有明显变化(数据未提供)，证明滤膜对贻贝粘蛋白的吸附能力弱，因此，采用这种方法容易得到假阴性的结果。而体外细胞毒性测试中，细胞培养所用的培养板也是一种惰性的表面，并且与细胞直接接触，将蛋白定量地固化到培养板表面后进行测试理论上是可行的。实验中采用将贻贝粘蛋白加入到培养板中后完全干燥的方法使蛋白定量固化到细胞培养板中。按照实验采用的剂量计算，贻贝粘蛋白的浓度为60 μg/cm²，相当于正常使用量的20倍挑战，在这种条件下仍能得到阴性结果，证明贻贝粘蛋白创面修复敷料不存在体外细胞毒性。阳性对照组测定结果表明，DMSO产生了阳性作用，细胞凋亡，证明实验具有比较意义。同时，采用直接接触法测定细胞活性的相对标准偏差低于0.02，证明方法具有较好的重现性，此方法适用于此样品的细胞毒性检测。

综上所述，根据使用情况调整过浸提比例后的细胞毒性检测方法，以及放大剂量后的直接接触法均可适用于贻贝粘蛋白修复敷料细胞毒性的检测。随着科学的发展，将有越来越多类似于贻贝粘蛋白的新材料应用于医疗器械领域，因此在实际的检测过程中，应该根据的医疗器械检品的特性以及产品的使用特性，在不违背国家有关标准的前提下，合理地调整检测方法，以期达到有效地评价医疗器械产品生物相容性的目的。

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贻贝粘蛋白创面修复敷料的主要成分是贻贝粘蛋白，是由多种结构相似的蛋白亚类构成如Mefp-1，Mefp-2，Mefp-3，Mefp-4，Mefp-5等，这些亚类蛋白虽然分子量跨度较大，但均具有相似的等电点，均为pI>9。同时，这些亚类蛋白中均含有数量不等的多巴基团，多巴中的邻苯二酚基团（又称儿茶酚）具有亲和多样性和化学多功能性，是贻贝发挥超强粘附功能的关键。正是由于贻贝粘蛋白的这些结构上的特点才使其在创面修复过程中发挥修复作用，促进细胞的爬行、增殖和替代，保持创面湿润，阻碍细菌等病源微生物的生长，促进创面快速愈合。例如，贻贝粘蛋白因结构中赖氨酸的存在（pI>9）使其在人体生理pH下带有正电荷，容易吸引带有负电荷的细胞；因结构中存在大量的DOPA基团，使其易于黏附于固体表面，形成细胞贴壁生长的骨架。正是由于贻贝粘蛋白的这些特征，使其在以细胞作用评价目标的体外细胞毒性测定中表现出假阳性结果。贻贝粘蛋白的特殊结构使其在pH值或氧化等条件发生变化都可触发凝聚体的凝胶化或交联而快速固化，这也是以贻贝粘蛋白作为医疗器械产品作用的关键。实验表明贻贝粘蛋白能快速地形成永久性的粘接，并可粘接各种材料，且贻贝粘蛋白具有很好的生物安全性，对人体无毒性，具有较好的生物可降解性，可被用作环境友好的生物医用黏合剂，同时，不会引起人体产生免疫反应。在医学方面，贻贝粘蛋白以其优异的性能已得到普遍认可，其中有关其作为细胞核组织黏附因子的报道有很多，其中主要有齿根膜、眼球虹膜、纤毛、肝脏和神经细胞的粘接，但此类研究一直停留在研发阶段，贻贝粘蛋白创面修复敷料是一种以贻贝粘蛋白主要成分的新型医疗器械产品。实验在传统体外细胞毒性检测方法的基础上，结合贻贝粘蛋白的特性，建立了适用于这种特殊蛋白质的检测方法并经实验证明方法具有可行性和良好的重现性。

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