D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性和细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.008

中国组织工程研究

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D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性和细胞相容性

须建²，彭坤^{1, 2}，甘哓玲²，王易振²，段巧玲²，李永刚¹

1重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工程中心，重庆市 400030；2重庆医药高等专科学校医学技术学院，重庆市 401331

收稿日期:2013-06-25 修回日期:2013-07-11 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 彭坤，在读博士，讲师，重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工程中心，重庆市 400030；重庆医药高等专科学校医学技术学院，重庆市 401331 pk3001@163.com
作者简介:须建，男，1955年生，江苏省无锡市人，汉族，1979年原重庆药剂学校毕业，副教授，主要从事医学检验与生物材料方面的研究。
基金资助:
重庆市教委项目(KJ112501)*，重庆市卫生局项目(2012-2-257)*，重庆医药高等专科学校重点科研项目(2012103)*

Shape-memory polymer based on D,L-poly(lactic acid): Biosecurity and cytocompatibility

Xu Jian², Peng Kun¹, 2, Gan Xiao-ling², Wang Yi-zhen², Duan Qiao-ling², Li Yong-gang¹

1Research Center of Bioinspired Material Science and Engineering, Department of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China; 2Department of Medical Technology, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China

Received:2013-06-25 Revised:2013-07-11 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Peng Kun, Studying for doctorate, Lecturer, Research Center of Bioinspired Material Science and Engineering, Department of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China; Department of Medical Technology, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China pk3001@163.com
About author:Xu Jian, Associate professor, Department of Medical Technology, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China
Supported by:
the Project of Chongqing Educational Committee, No. KJ112501*; Project of Chongqing Health Bureau, No. 2012-2-257*; the Major Scientific Research Project of Chongqing Medical and Pharmaceutical College, No. 2012103*

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期实验研制了输卵管避孕器材料D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物，依据国内《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》规定，植入体内的组织工程材料必须进行生物安全评价和细胞相容性实验。
目的：观察D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性。
方法：①内毒素实验：在鲎试剂中分别加入聚合物浸提液、内毒素工作标准品溶液和细菌内毒素检查用水。②致敏实验：在昆明小鼠肩胛骨内侧分别注射聚合物浸提液+弗氏完全佐剂+生理盐水、弗氏完全佐剂+生理盐水，通过皮内诱导、局部诱导和激发阶段，观察动物激发部位皮肤红斑和水肿反应程度。③急性毒性实验：分别在昆明小鼠腹腔注射100%，50%，25%聚合物浸提液及生理盐水。④细胞增殖MTT实验：直接法为将人脐静脉内皮细胞分别接种于聚合物膜、聚乳酸与玻璃片上；间接法为将人脐静脉内皮细胞分别接种于聚合物浸提液、丙烯酰胺溶液及1640培养液。
结果与结论：D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料无细菌污染状况，符合生物安全标准，无致敏性及毒性，并且具有较好的细胞相容性。

关键词: 生物材料, ；材料生物相容性, D, L-聚乳酸形状记忆聚合物, 生物安全性, 细胞相容性, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous experiments have prepared shape memory polymer based on D,L-poly(lactic acid). According to domestic technical requirements for biologically evaluating biomaterials and medical equipments, tissue-engineered grafts must be subjected to preclinical experiment for biosecurity and cytocompatibility evaluation.
OBJECTIVE: To observe the biosecurity of the shape memory polymer based on D,L-poly(lactic acid).
METHODS: (1) Bacterial endotoxin test: polymer extract, endotoxin working standard solution and checking standard water were added into limulus reagent, respectively. (2) Sensitization test: Polymer extract + Freund’s complete adjuvant + physiological saline and Freund’s complete adjuvant + physiological saline were injected into the scapula of Kunming mice. After induction by intradermal injection, local induction and excitation, stimulate skin erythema and edema degree were observed in animals. (3) Acute toxicity test: Kunming mice received intraperitoneal injection of 100%, 50%, 25% polymer leaching solution and physiological saline, respectively. (4) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay for cell proliferation: The direct method was that human umbilical cord vascular endothelial cells were inoculated onto the polymer film, lactic acid and glass, respectively; the indirect method was that human umbilical cord vascular endothelial cells were inoculated into
the polymer leaching solution, acrylamide solution and 1640 culture solution.
RESULTS AND CONCLUSION: This shape memory polymer based on D,L-poly(lactic acid) is free of bacterial contamination in compliance with the biosecurity standards, and it has no allergenic and toxicity but has good cytocompatibility.

Key words: biocompatible materials, histocompatibility, polymers, acute toxicity tests

中图分类号:

R318

须建，彭坤，甘哓玲，王易振，段巧玲，李永刚 . D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性和细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.008.

Xu Jian, Peng Kun, Gan Xiao-ling, Wang Yi-zhen, Duan Qiao-ling, Li Yong-gang. Shape-memory polymer based on D,L-poly(lactic acid): Biosecurity and cytocompatibility[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.008.

图/表（结果） 7

2.1 D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物内毒素实验结果实验采用D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物浸提液进行内毒素实验，结果见图1所示：在阳性对照管内可见管内已形成凝胶且坚硬不易变形物质，见图1A；在阴性对照管内无明显凝胶形成，见图1B；在样品管中内，2支管均无明显凝胶形成，见图1C，表明D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物浸提液内毒素实验结果为阴性。

2.2 D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料致敏实验结果在致敏实验过程中将D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料浸提液注入实验用小鼠皮下组织，分别于注入后1，2，3 d观察实验现象并记录实验结果，均未发现红斑或水肿等皮肤致敏性反应症状。实验结果表明D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料无致敏性。
2.3 D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料急性毒性实验结果见表1。

数据表明，从25%到100%剂量为实验用小鼠给药后，连续观察14 d发现存活动物体质量无明显变化，均未出现死亡情况。
2.4 D,L-聚乳酸基形状记忆聚合物对人脐静脉内皮细胞黏附效率和铺展的影响细胞的黏附与材料表面的物理化学性质密切相关，它是评价生物材料细胞相容性的一个重要指标。图2为细胞在玻璃、聚乳酸和D,L-聚乳酸基形状记忆聚合物膜表面的黏附效率，从图中可以看出，其黏附率的大小为：D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物>聚乳酸>玻璃。

图3为人脐静脉内皮细胞在玻璃、聚乳酸和D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料膜表面的贴壁和黏附状态，从图中可以看出，在培养4 h后细胞在聚乳酸上大部分为圆点，未进行贴壁，而在D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料上黏附状态都较好，表现出一定的铺展，周围出现半透明光晕。

2.5 细胞增殖能力评价结果
直接法评价：实验中在D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料上直接培养人脐静脉内皮细胞，并采用MTT法评价D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的细胞增殖活性，结果见表2。

对表2中实验数据进行单因素方差分析，结果表明组间数据差异有显著性意义，3种材料上细胞的增殖活力大小依次为聚乳酸<D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物<玻璃(P均< 0.05)，且细胞在D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物上的增殖能力要高于聚乳酸。很明显，伴随着培养时间的延长，各组材料上的细胞数量均在增加。可能是因为D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物本身具有良好的亲水性，使得细胞更容易黏附在其表面，进而有效促进了细胞增殖行为，见表3。

对表3中实验数据进行单因素方差分析，结果表明组间数据差异有显著性意义(P < 0.05)。可以得出，培养前2 d，玻璃组的细胞增殖率为97%，均高于D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物组与聚乳酸组(P < 0.05)，而第2-6天时间内，D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物与聚乳酸组的细胞增殖率高于玻璃组(P < 0.05)，且在培养前4d聚乳酸组的细胞增殖率低于D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物(P < 0.05)，这说明D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物的细胞相容性好于聚乳酸。
间接法评价：在培D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料的浸提液中培养人脐静脉内皮细胞，实验通过MTT法检测细胞增殖情况，结果见表4，图4。
对表4中实验数据进行单因素方差分析，结果表明组间数据差异有显著性意义(P < 0.05)。实验中采用的D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物浸提液浓度分别为25%，50%，100%。实验结果表明，阴性对照组中的细胞生长情况好于在材料浸提液中的生长情况，且不同浓度D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物浸提液对细胞的生长行为有一定影响。但细胞在3种浓度的浸提液分别培养6 d后，细胞相对增殖率仍均能达到94%以上，且细胞毒性为0或1级。
从理论上分析，可能是由于D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料在降解过程中生成了寡聚体或小分子物质，导致D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物浸提液对细胞增殖有一定影响。同时实验结果还表明，随着浸提液浓度的逐渐增大，其对细胞增殖的影响作用也在逐渐增大。但是值得庆幸的是D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料已经达到生物材料医用标准。因此，实验认为D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料已具备良好的细胞相容性。

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引言

材料方法

设计：随机分组，对比观察动物实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年4月在重庆大学生物工程学院和解放军第三军医大学大坪医院动物实验中心完成。

材料：

实验动物：实验选用SPF级6-9周龄昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(200±20) g，由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK 2002008。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物生物安全性和细胞相容性实验的主要材料：

实验方法：

制备D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料浸提液：将4 g D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料加入20 mL生理盐水中，37 ℃水浴箱保温72 h，制备标准浸提液。用 0.22 μm微孔过滤器过虑除菌，置于4 ℃冰箱保存待用。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料内毒素实验^[2-3]：实验中选取规格为0.1 mL/支鲎试剂安瓿4支：样品管抽取2支，分别加入0.1 mL上述浸提液；阳性对照管抽取1支，加入2λ内毒素工作标准品溶液0.1 mL；阴性对照管抽取1支，加入细菌内毒素检查用水0.1 mL。将试管中溶液轻轻混匀后封闭管口，垂直放入(37±1) ℃水浴中保温(60±2) min。在保温和取试管过程中须避免试管受振动而造成假阴性结果。

结果评定：将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时管内凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为阳性(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为阴性(-)。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料致敏实验^[4-5]：在皮内诱导阶段，选取昆明种小鼠6只，通过去毛后于肩胛骨内侧成对完成皮内注射0.1 mL。①按体积比为50∶50混合弗氏完全佐剂与选定的溶剂生理盐水。②实验组皮内注射浓度为50%聚合物浸提液，对照组仅注射相应体积生理盐水。③实验组皮内注射，按体积比为50∶50将聚合物浸提液(浓度同上)与弗氏完全佐剂及溶剂配成乳化剂进行；对照组仅注射佐剂和溶剂配成的乳化剂。

在局部诱导阶段，须在局部诱导前1 d对待实验部位进行预处理。通过按摩法将浓度为10%的十二烷基硫酸钠石蜡导入皮肤组织。相同方法处理对照组动物。将20 mm×20 mm滤纸置于浸提液中，充分浸透后，在皮内诱导结束后7 d，在实验动物肩胛骨内侧的诱导注射点贴敷滤纸并固定。2 d后除去包扎带和滤纸。相同方法处理对照组动物。

在激发阶段，局部诱导结束后14 d，用聚合物浸提液原液对实验动物和对照动物进行激发。浸透滤纸片局部贴敷于实验动物的单侧腹部，并用封闭式包扎带进行固定。在(24±2) h后，除去包扎带和滤纸。

结果评定：除去敷贴物后24，48，72 h观察实验组和对照组动物激发部位皮肤红斑和水肿反应程度。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料急性毒性实验^[6-9]：急性毒性实验是指在24 h内一次或多次通过包括经口、经皮肤、经腹腔和经静脉等途径，大剂量给予机体外来化学物后发生的有害作用。通过不同的给予方法可从不同角度了解样品进入机体后的全身代谢和对造成的毒性影响，从而评价生物材料的急性毒性作用。实验选取昆明种小鼠作为实验动物，执行给药量1 mL/20 g的标准，通过腹腔注射途径给药。实验组聚合物浸提液的浓度分别为100%，50%，25%；空白对照组采用生理盐水，每组8只小鼠，雌雄各半。

结果评定：连续观察14 d，对实验小鼠的毒性反应和死亡情况做详细记录。对死亡动物进行解剖学检查，观察脏器的病理变化。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物对人脐静脉内皮细胞黏附效率和铺展的影响^[10-14]：

人脐静脉内皮细胞在膜上的黏附效率：将D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物膜置于紫外灯下，充分照射 30 min，彻底灭菌。随后放入24孔板中，按照密度为2×10⁴每孔，在膜上接种人脐静脉内皮细胞。培养4 h后，在显微镜下观察细胞状态，并用相机拍照记录。将未贴壁的细胞吸出，用PBS清洗后，采用胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化，加入培养液吹打细胞，使其完全脱落，吹打均匀，计数板计数。以接种于玻璃及聚乳酸为对照。细胞黏附效率(A)采用下面的公式计算：

其中N₁为黏附后的细胞数目，N₀为初始细胞数目。

人脐静脉内皮细胞在膜上的形态与铺展：人脐静脉内皮细胞接种后将其培养4 h，在显微镜下观察细胞形态，用相机拍照。

测定细胞增殖能力^[15-19]：在细胞生物学研究中MTT法是一种应用广泛的分析细胞活性、增殖及毒性作用等的方法。实验步骤：①直接法：将聚合物材料膜经预处理后，放置于24孔板上，接种人脐静脉内皮细胞(密度1×10⁴/孔)，以接种于玻璃及D，L-聚乳酸为对照。细胞接种2，4，6 d后在各组中每次取5个，用MTT法测定细胞增殖能力。在Model 550酶标仪上读取吸光度值，检测波长490 nm。②间接法：将细胞接种到96孔板(密度为5 000/孔)，实验组培养介质为100%，50%，25%的聚合物材料浸提液，阳性对照组为0.7%的丙烯酰胺溶液，阴性对照组为1640培养液。细胞接种2，4，6 d后在各组中每次取5个，MTT法测定细胞增殖能力。在Model 550酶标仪上读取吸光度值，检测波长490 nm。

根据公式可得出细胞在不同时间段内的细胞相对平均增殖速率。细胞毒性分级评估标准：0级，细胞相对增殖率≥100%；1级，80%≤细胞相对增殖率<100%；2级，50%≤细胞相对增殖率<80%；3级，30%≤细胞相对增殖率<50%；4级，0≤细胞相对增殖率<30%。

主要观察指标：D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物内毒素实验、致敏实验、小鼠急性毒性实验及细胞增殖能力实验结果。

统计学分析：对实验结果进行单因素方差分析，均数间的两两比较采用最小显著差法(Least-significant difference, LSD)，P < 0.05代表差异有显著性意义。

D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性和细胞相容性

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