丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (29): 5269-5274.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.002

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丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架

叶鹏¹，田仁元¹，黄文良²，马立坤³，邓江⁴

遵义医学院，¹2011级骨外科研究生，³2012级骨外科研究生，贵州省遵义市 563003；遵义医学院第三附属医院，²骨一病区，⁴骨科，贵州省遵义市 563003

出版日期:2013-07-22 发布日期:2013-07-22
通讯作者: 邓江，教授，主任医师，研究生导师，遵义医学院第三附属医院骨科，贵州省遵义市 563003
作者简介:叶鹏★，男，1988年生，重庆市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事骨关节创伤方面的研究。 807346006@qq.com
基金资助:
贵州省科学技术基金项目（黔科合SY字[2010] 3101），项目名称：《 SF-CS-nHA支架与基因修饰后BMSCs构建人工骨种植体的成骨作用研究》；贵州省社会攻关项目(遵义市科合社字 [2010] 015号)，项目名称：《RGD表面修饰SF-CS-nHA材料复合携带目的基因的BMSCs成骨性能研究》；贵州省省长基金项目（2011（25）），项目名称：《 rhBMP-2缓释系统/自体松质骨复合生物支架修复骨缺损的研究》

Silk fibroin/chitosan/nano hydroxyapatite complicated scaffolds for bone tissue engineering

Ye Peng¹, Tian Ren-yuan¹, Huang Wen-liang², Ma Li-kun³, Deng Jiang⁴

¹Grade 2011, ³Grade 2012, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China; ²First Ward of Orthopedics Department, ⁴Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Online:2013-07-22 Published:2013-07-22
Contact: Deng Jiang, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Ye Peng★, Studying for master’s degree, Grade 2011, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China 807346006@qq.com
Supported by:
the Scientific and Technological Foundation of Guizhou Province, No. [2010] 3101*; the Social Tackle Key Program of Guizhou Province, No. [2010] 015*; the Governor Fund of Guizhou Province, No. 2011(25)*

摘要/Abstract

摘要：

背景：丝素蛋白、壳聚糖及纳米羟基磷灰石均是天然材料，具有良好的生物活性和理化特性，作为人体组织工程材料已取得了一定的成果，但3种材料在单独应用的研究中还存在一定的缺陷。
目的：制作丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维支架材料，分析其特性。
方法：将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石分别配制成2%的溶液后，分别按照 1∶1∶0.5，1∶1∶1， 1∶1∶1.5 的体积比混合，采用冷冻干燥与化学交联技术制备成三维复合支架材料。检测三维复合支架的孔隙率、吸水膨胀率及热水溶失率，采用材料力学测验机测试干燥三维复合支架材料的拉伸和压缩弹性模量，采用扫描电镜检测三维复合支架的孔径。
结果与结论：丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架在干燥状态下呈白色，无特殊气味，为稳定固态的圆柱体，触之有明显的抗压能力和弹性。随着复合支架材料中纳米羟基磷灰石含量的增高，支架材料的孔隙率、吸水膨胀率、平均孔径呈逐渐减小趋势，热水溶失率及抗压能力表现出相反的趋势，结果显示以1∶1∶1体积比制作的支架更符合骨替代材料要求，其平均孔径为85.67 µm、吸水膨胀率的为(135.65±4.56)%、热水溶失率为(22.84±1.06)%，支架材料内部孔隙均匀，呈现网状结构，孔隙之间交通发达，网状结构本身约10 µm。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 丝素蛋白, 壳聚糖, 纳米羟基磷灰石, 三维复合支架, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Silk fibroin, chitosan, and nano hydroxyapatite are natural materials, and they all have good biological activity and physical or chemical properties. As tissue engineering materials, they have been already widely used in clinic or research work, but there are some defects in the application of these three kinds of materials.
OBJECTIVE: To discuss the preparation and characteristics of silk fibroin/chitosan/nano hydroxyapatite complicated scaffolds which could be used in bone tissue engineering.
METHODS: Silk fibroin, chitosan, and nano hydroxyapatite were separately prepared into 2% solution, and then mixed at the ratio of 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5 respectively. The three-dimensional complicated scaffolds were prepared by those mixed liquids through repeated freeze drying and chemical crosslinking technology. Scanning electron microscope was used to detect the pore size of the scaffolds. Porosity, water absorption rate, and hot-water loss rate were determined. Mechanical tester was used to measure the tensile and compressive modulus of dried three-dimensional scaffolds.
RESULTS AND CONCLUSION: The silk fibroin/chitosan/nano hydroxyapatite complicated scaffold in the dry state had no special smell, appeared to be a stabilized solid cylinder, and exhibited clear resiliency and flexibility with a touch. With the increased content of nano hydroxyapatite, the porosity, water absorption rate and average pore size of the scaffolds appeared to be decreased, while the hot-water loss rate and compressive strength were increased. The scaffold prepared at 1:1:1 was better for bone tissue engineering, and the average pore size, water absorption rate and hot-water loss rate were 85.67 µm, (135.65±4.56)% and (22.84±1.06)%, respectively, closer to the needs of the bone tissue engineering. Uniform pores were found within the scaffold at 1:1:1, showing the network structure, developed transport among pores, and the network structure was approximately 10 μm.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, silk fibroin, chitosan, nano hydroxyapatite, three-dimensional complicated scaffold, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

叶鹏，田仁元，黄文良，马立坤，邓江. 丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(29): 5269-5274.

Ye Peng, Tian Ren-yuan, Huang Wen-liang, Ma Li-kun, Deng Jiang. Silk fibroin/chitosan/nano hydroxyapatite complicated scaffolds for bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(29): 5269-5274.

图/表（结果） 4

2.1 丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架的大体观察 图1所示复合支架材料在干燥状态下呈白色，无特殊气味，为稳定固态的圆柱体，触之有明显的抗压能力和弹性；临床骨缺损特别是创伤引起的骨缺损形状大小不一，难以获得合适的骨替代材料，而复合支架内部结构显得致密均匀，以指腹触压有较强弹性，切割面光滑平整，可以根据需要进行塑形。表1中数据显示随着纳米羟基磷灰石含量的增高，支架材料孔隙率、吸水膨胀率、平均孔径呈逐渐减小的趋势，而热水溶失率则表现出相反的趋势，这一现象可能是由于纳米羟基磷灰石的增加填充了内部材料空隙。纳米羟基磷灰石的增加虽然能够增加支架的机械性能，但过多则会影响其内部孔隙率，而合适的内部孔隙率才能够为细胞生长分化代谢提供充足空间。在三种构成材料中纳米羟基磷灰石的代谢速度最慢，过多的纳米羟基磷灰石会影响支架在体内的代谢速度，影响正常骨组织的生长修复过程，因此认为以1∶1∶1比例制作的复合支架最接近骨组织工程需要。

2.3 丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架的生物力学特性 见图2。为了达到临时支撑骨缺损的作用，抗压能力是衡量组织工程骨机械能力的最重要指标。生物力学测试结果表明随着纳米羟基磷灰石含量升高，支架抗压能力升高；当支架被压缩至0.5-1.0 mm时普遍表现出抗压能力显著上升，从低比例到高比例支架的最大抗压能力依次为0.14，0.20，0.26 kN。

2.4 扫描电镜检测复合支架的显微结构及孔径大小 见图3，4。

如图3所示，低倍镜下难以观察各组支架的差别，都展示出支架材料内部孔隙均匀，呈现出网状结构，这种结构有较大的表面积，能为细胞黏附生长提供相应的表面空间，孔隙之间交通发达，细胞及组织能够顺利代谢增殖，网状结构本身约10 µm，在骨组织生长修复过程中能够有效降解，为正常骨组织替代创造了良好条件。纳米羟基磷灰石均匀黏附于丝素蛋白、壳聚糖组成的支架上，构成了复合丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维支架。图4高倍镜下3种比例的支架呈现出了明显的不同，可以看到1∶1∶1.5的比例制作的支架内包裹着更多的纳米羟基磷灰石颗粒，而1∶1∶0.5比例组则明显比较稀疏。

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引言

自骨组织工程出现后，复合骨组织工程支架材料的研究始终是急需解决的难点之一。目前研究发现，丝素蛋白、壳聚糖及纳米羟基磷灰石均是天然材料，具有良好的生物活性和理化特性，作为人体组织工程材料已取得了一定的成果。

苗宗宁等^[1]将丝素蛋白复合大鼠骨髓间充质干细胞共培养后，用于大鼠全层皮肤创面的修复。结果显示，术后8周创面愈合良好，表皮层细胞增多，移植物被降解，角质层增厚，真皮层成纤维细胞增多，取得了良好的修复效果。Park等^[2]将采用冷冻干燥技术制备的纳米微球支架与MC3T3-E1细胞共培养构建人工组织工程骨，经过DNA计数和细胞增殖与代谢能力的分析表明细胞在丝素蛋白支架上生长良好；动物体内实验也表明支架植入小鼠骨缺损部位7 d后达到了骨完全修复。另外丝素蛋白在人工血管^[3-4]、神经^[5]、肌腱等诸多领域也展现出了良好的生物相容性^[6-7]。

刘小华等^[8]将以壳聚糖为原材料制作的神经导管植入家兔皮下，发现随着时间的延长植入物逐渐降解并与周围组织结合紧密，植入2周时无明显的中性粒细胞，4周时有少许血管，12周时与真皮界面模糊，新生血管进一步增加，表明壳聚糖神经导管具有良好的生物相容性，无毒，不引起炎症反应。Choi等^[9]研究发现壳聚糖反蛋白石支架有利于成骨前体细胞的生长和增殖。Lahiji 等^[10]体外研究发现壳聚糖可促使成骨细胞增生。壳聚糖分子上的氨基与羧基具有良好的化学活性，可与多种基团发生反应，生成各种不同衍生物。张文远等^[11]将壳聚糖、丝素蛋白复合制备三维支架材料，其孔径在100- 160 µm之间，孔隙率为84.2%；将其与骨髓间充质干细胞共培养后，发现细胞在支架上24 h后黏附率达到了94.3%，MTT检测显示细胞生长良好，表明复合材料仍具有良好的生物相容性。

朱伟民等^[12]制作的纳米羟基磷灰石人工骨材料孔径为100-250 nm，孔隙率为90%，此材料在兔桡骨骨缺损修复中显示出了良好的骨修复能力，可促进大量新生骨形成。Pezzatini等^[13]体外实验证实纳米羟基磷灰石能够刺激血管新生的主要信号通路内皮细胞一氧化氮合酶与成纤维细胞生长因子2的表达。李楠竹等^[14]、段宏等^[15]将纳米羟基磷灰石与聚酰胺66复合的支架分别用于先天性髋关节髋臼发育不良和良性骨肿瘤手术后骨缺损的治疗，术后都取得了良好的疗效，表明了复合支架具有生物安全性和诱发新生骨形成的作用。

丝素蛋白、壳聚糖和纳米羟基磷灰石在分别单独应用的研究中还有一定的缺陷，因此近年来将以上任两种材料复合制备的支架材料已见报道，而3种材料混合制备的支架材料是否可以弥补各自的不足更加满足骨组织工程的需要尚未见报道^[16-18]。鉴于此，实验旨在探索丝素/壳聚糖/羟基磷灰石骨组织工程支架材料的性质。

材料方法

设计：材料学观察实验。

时间及地点：于2011年5月至2013年3月在遵义医学院中心实验室完成。

材料：

丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架性质实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架的制备^[19]：将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石分别配制成为2%溶液，然后分别以体积比1∶1∶0.5，1∶1∶1， 1∶1∶1.5 三种比例混合，在C-MAG HS4磁力加热搅拌器中以55 ℃恒温搅拌直到3种液体中没有汽包，充分混合均匀，然后迅速将其用20 mL针筒注入9孔板中，放入-80 ℃冰箱冷冻24 h。将冷冻好的支架用封口膜迅速密封，在支架相应区域制作细孔后放入真空干燥机抽吸 36 h。将干燥后的支架浸入含有体积分数75%甲醇和 1 mol/L氢氧化钠的混合液中预处理15 h，超纯水反复洗净后再次真空干燥，然后将所得支架在以碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合的交联剂中浸泡10 h 后洗净，再将染湿的复合支架-80 ℃冷冻24 h，然后真空干燥 36 h。将制备的三维复合支架密封后备用。

丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架的性质测定：

孔隙率测定：采用改良的液体位移法测定支架孔隙率^[20]。将同等大小的不同体积配比支架分别放入含有乙醇的20 mL量筒中，分别记录放入前体积V₁。浸泡10 min待空气溢出乙醇体积V2，取出支架后剩余乙醇的体积为V₃，按孔隙率(%)=(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100%计算，每组测定5个样品，取平均值。

吸水膨胀率测定^[21]：将不同体积配比支架浸入超纯水中后36 h取出，用纱布吸干表面水分后称其质量m₁，然后将支架在真空干燥后称质量m₂，以公式(m₁-m₂)/ m₂×100% 测其吸水膨胀率。

热水溶失率测定^[22]：分别称取干燥支架的质量m₁，浸入蒸馏水中，在37 ℃的恒温水浴箱中持续振荡24 h，最后再将支架烘干，称取残余支架的质量m₂，以公式(%)=(m₁-m₂)/×100%测其热水溶失率。

支架的抗压抗张力学检测：将复合支架材料制备成长2.5 cm、直径1 cm的柱状体，以instron 1011 材料力学测验机对干燥支架以2 mm/min相同的速度对支架材料进行拉伸和压缩弹性模量测试。

扫描电镜下观察支架的形态及孔径：将支架材料切成长1 cm、宽0.5 cm、厚0.2 cm的薄片后真空干燥，离子溅射仪离子表面喷金后进行观察并测量其平均孔径。

主要观察指标：观察不同比例丝素/壳聚糖/羟基磷灰石三维复合支架的理化性质。

统计学分析：结果由第一作者采用SPSS 16.0统计软件包进行处理分析，所得数据以x(_)±s表示。两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前各种病因造成的骨缺损治疗材料主要分为3大类，即自体骨、异体骨和组织工程骨。自体骨拥有良好的效果但难以克服其来源有限，给患者造成二次创伤和高昂费用的缺点。异体骨因易产生免疫排斥而受到争议^[23-24]。组织工程骨旨在为骨缺损治疗构建出一种新的骨替代材料，成为骨缺损治疗研究的热点。理想的骨组织工程骨应具有无免疫原性，良好的生物降解性、生物力学性质和微观结构，能够承担在机体内的支撑作用，同时为骨细胞生存、生长提供空间^[25-26]。

丝素蛋白来源广泛，在天然蚕丝中约80%为丝素蛋白，主要由丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸组成，由于其具有低免疫原性和良好的生物相容性在临床上已被用于手术线和隐形眼镜、人造皮肤等的材料及食品添加剂；在骨、软骨组织工程和药物缓释材料的应用中也显示出了良好的生物特性。但丝素蛋白单一应用对于骨组织工程来说也表现出机械强度差的缺点^[27]。

壳聚糖是甲壳质的一种衍生物，其结构类似于糖胺聚糖，具有良好的生物相容性及可塑性，分子中存在着活性的-NH₂和-OH，两者之间或两羟基之间可形成较强的氢键使得其水溶性较小。壳聚糖溶解依赖于酸性溶液，用其制备的支架脆性大，韧性差，降解时间长，支架内孔隙小不利于细胞黏附生长，将其单一应用于骨组织工程受到了限制^[28-29]。

人体骨主要由纳米羟基磷灰石和1型胶原构成。对于骨组织工程来说人工合成的纳米羟基磷灰石与人体骨组织的无机结构相似，无毒，具有较好的抗压性能，也是一种理想的骨替代材料^[30]。

课题组在前期实验中发现丝素蛋白/壳聚糖具有良好的理化性质及生物相容性，有利于动物体内的软骨缺损修复。而骨缺损修复对支架材料的机械性能要求进一步提高，所以选择在丝素蛋白/壳聚糖支架的基础之上加入纳米羟基磷灰石达到提高支架机械性能的目的。实验将丝素蛋白、壳聚糖、羟基磷灰石3种材料以适当的比例混合，运用冷冻干燥、化学交联法制备成三维复合支架，支架呈圆柱形，雪白色，挤压时表现出一定的弹性和抗压性，其剖面结构与表面一致，内部均匀，表明其可以根据需要进行塑形；电镜显示其孔隙均匀，平均约 85 µm，孔隙率约为85%。随着纳米羟基磷灰石含量的增加，支架平均孔隙和孔径随之减小。吸水膨胀率代表支架能够吸收足够的营养成分供细胞生长分化。生物力学测试表明随着纳米羟基磷灰石体积的增加，支架抗压、抗张能力亦随之增加，这种现象是由于丝素蛋白、壳聚糖两种材料提供了韧性，而纳米羟基磷灰石的类骨质结构则提供了强度和坚固性，从而提高了支架的抗压与抗张能力。电镜观察支架内部为由丝素蛋白、壳聚糖构成的网状骨架结构，在网状骨架结构中均匀散布着纳米羟基磷灰石结晶形成的颗粒，有的颗粒突出于网状结构表面，有的则半埋于其中，说明在恒温保持混合液体充分溶解的情况下，以磁力搅拌器长时间匀速搅拌这一简便易操作可重复技术，以及化学交联法能够成功地结合这3种不同的生物力学材料。壳聚糖、丝素蛋白上含有的氨基及羧基互相之间可通过生成酰胺键或酯键形成较稳定的高分子物质。而纳米羟基磷灰石除了含有OH^-外还含有Ca²⁺，Ca²⁺也能与羧基紧密结合形成羟基磷灰石矿化结晶。纳米羟基磷灰石材料降解后释放的 Ca、P可参与植入区新骨形成，被成骨细胞摄取，构成新骨基质中的无机成分，同时释放的Ca、P 还可刺激局部新骨形成，发挥成骨作用。综上虽然以更高比例纳米羟基磷灰石制作的支架显示出更高的抗压抗张能力，但却降低了支架孔隙率，延长了支架在体内的降解时间，不利于正常骨组织的生长替代，所以实验认为以1∶1∶1制作的复合支架材料更符合骨替代材料的要求，但其细胞相容性、组织相容性及在体内的修复过程需进一步研究。

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课题组在前期实验中发现丝素蛋白/壳聚糖具有良好的理化性质及生物相容性，有利于动物体内的软骨缺损修复。而骨缺损修复对支架材料的机械性能要求进一步提高，所以选择在丝素蛋白/壳聚糖支架的基础之上加入纳米羟基磷灰石达到提高支架机械性能的目的。实验将丝素蛋白、壳聚糖、羟基磷灰石3种材料以适当的比例混合，运用冷冻干燥、化学交联法制备成三维复合支架，支架呈圆柱形，雪白色，挤压时表现出一定的弹性和抗压性，其剖面结构与表面一致，内部均匀，表明其可以根据需要进行塑形；电镜显示其孔隙均匀，平均约85µm，孔隙率约为85%。随着纳米羟基磷灰石含量的增加，支架平均孔隙和孔径随之减小。吸水膨胀率代表支架能够吸收足够的营养成分供细胞生长分化。生物力学测试表明随着纳米羟基磷灰石体积的增加，支架抗压、抗张能力亦随之增加，这种现象是由于丝素蛋白、壳聚糖两种材料提供了韧性，而纳米羟基磷灰石的类骨质结构则提供了强度和坚固性，从而提高了支架的抗压与抗张能力。电镜观察支架内部为由丝素蛋白、壳聚糖构成的网状骨架结构，在网状骨架结构中均匀散布着纳米羟基磷灰石结晶形成的颗粒，有的颗粒突出于网状结构表面，有的则半埋于其中，说明在恒温保持混合液体充分溶解的情况下，以磁力搅拌器长时间匀速搅拌这一简便易操作可重复技术，以及化学交联法能够成功地结合这3种不同的生物力学材料。壳聚糖、丝素蛋白上含有的氨基及羧基互相之间可通过生成酰胺键或酯键形成较稳定的高分子物质。而纳米羟基磷灰石除了含有OH^-外还含有Ca²⁺，Ca²⁺也能与羧基紧密结合形成羟基磷灰石矿化结晶。纳米羟基磷灰石材料降解后释放的 Ca、P可参与植入区新骨形成，被成骨细胞摄取，构成新骨基质中的无机成分，同时释放的Ca、P 还可刺激局部新骨形成，发挥成骨作用。综上虽然以更高比例纳米羟基磷灰石制作的支架显示出更高的抗压抗张能力，但却降低了支架孔隙率，延长了支架在体内的降解时间，不利于正常骨组织的生长替代，所以实验认为以1:1:1制作的复合支架材料更符合骨替代材料的要求。

丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架

Silk fibroin/chitosan/nano hydroxyapatite complicated scaffolds for bone tissue engineering

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