放射性胸腺损伤小鼠模型的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4465-4472.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.014

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放射性胸腺损伤小鼠模型的建立

宁昌¹，余长林²，胡锴勋²

1解放军第161医院肿瘤科，湖北省武汉市 430010
2军事医学科学院附属307医院血液科，北京市 100071

收稿日期:2012-11-17 修回日期:2012-12-06 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 胡锴勋，博士，副主任医师，军事医学科学院附属307医院血液科，北京市 100071 hukaixun@sohu.com
作者简介:宁昌★，男，1973年生，陕西省安康市人，汉族，2011年军事医学科学院毕业，硕士，主治医师，主要从事血液肿瘤的临床和基础研究。 thisisyourfriend@sina.com

Establishing a mouse model of radiation-induced thymus injury

Ning Chang¹, Yu Chang-lin², Hu Kai-xun²

1 Department of Oncology, the 161st hospital of PLA, Wuhan 430010, Hubei Province, China
2 Department of Hematology, Affiliated 307 Hospital of Academy of Military Medical Science, Beijing 100071, China

Received:2012-11-17 Revised:2012-12-06 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Hu Kai-xun, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated 307 Hospital of Academy of Military Medical Science, Beijing 100071, China hukaixun@sohu.com
About author:Ning Chang★, Master, Attending physician, Department of Oncology, the 161st hospital of PLA, Wuhan 430010, Hubei Province, China thisisyourfriend@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：胸腺对于维持机体免疫功能起着重要的作用，在放射性损伤发生时的损伤和修复机制有待于进一步研究，但目前缺乏相应的动物模型。
目的：单纯照射小鼠胸腺以构建放射性胸腺损伤模型。
方法：160只雌性BALB/C小鼠随机分为4组，每组40只，对照组予以假照射；6 Gy照射组给予⁶⁰Co γ射线6 Gy胸腺单次照射，9 Gy照射组给予胸腺单次照射9 Gy，12 Gy照射组给予胸腺单次照射12 Gy。观察各组小鼠照射后1-7 d体质量及进食水量变化，照射后1，7，14，21，28 d检测各组小鼠血象、胸腺指数及胸腺病理变化，并于照射后7 d检测小鼠食管、肺、气管病理组织学变化，照射后14 d检测小鼠外周血T细胞亚群和胸腺T细胞亚群表达。
结果与结论：与对照组相比，照射组小鼠各项指标均发生变化，但6 Gy照射组由于损伤相对较轻，在照后1周内就开始修复；12 Gy照射组出现了放射性食管、气管损伤，而9 Gy组即保留了放射性损伤的特点，也避免了其他脏器损伤带来的干扰，能反映胸腺放射性损伤后的改变。以9 Gy ⁶⁰Co γ射线单次纵膈照射可成功制作小鼠放射性胸腺损伤模型。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 小鼠, 放射性损伤, 胸腺, 动物模型, 免疫功能, 纵膈, 体质量, 血象, 胸腺指数, 病理

Abstract:

BACKGROUND: The thymus plays an important role in maintaining the immune function of the body. Damage and repair mechanisms of radiation-induced thymus injury require further studies, but there lacks an appropriate animal models.
OBJECTIVE: To establish a mouse model of radiation-induced thymus injury.
METHODS: Totally 160 female BALB/C mice were randomly classified into four groups, 40 mice in each group: control group received sham-irradiation, and the other groups were irradiated with different doses of ⁶⁰Co γ-rays, 6 Gy, 9 Gy and 12 Gy. After the irradiation, the body mass, food and water intake, the thymus index, and thymus pathology were detected at 1, 7, 14, 21, 28 days; esophageal, trachea and lung pathological changes were observed at 7 days; thymus and peripheral blood T subsets of the mice were measured at 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: ALL three doses (6 Gy, 9 Gy, 12 Gy) could damage mouse thymus. After 6 Gy radiation, radiation-induced thymus injury was relatively mild and repaired within 1 week. Radioactive esophagus and trachea injury were found in mice exposed to 12 Gy radiation. Only exposed to 9 Gy, the thymus had a typical change and other organs were normal. Therefore, single mediastinal ⁶⁰Co γ-ray irradiation at a dose of 9 Gy can successfully produce a mouse model of radioactive thymus injury.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, mice, radiation injury, thymus, animal models, immune function, mediastinum, body mass, hemogram, thymus index, pathology

中图分类号:

R318

宁昌，余长林，胡锴勋. 放射性胸腺损伤小鼠模型的建立[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4465-4472.

Ning Chang, Yu Chang-lin, Hu Kai-xun. Establishing a mouse model of radiation-induced thymus injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4465-4472.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入雌性BALB/C小鼠160只，分为对照组、6 Gy照射组、9 Gy照射组、12 Gy照射组4组，全部进入结果分析，实验过程中无脱失。

2.2 小鼠体质量及进食水量变化 3个剂量照射组在照射后各个时间点体质量均低于对照组，但6 Gy照射组仅在第14天与对照组差异有显著性意义(P < 0.05)， 9 Gy照射组在照后第14，21天与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，而12 Gy照射组在照射后第14，21，28天对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

照射后1周内平均每日进食量和饮水量，6 Gy及 9 Gy两组与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)， 12 Gy组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 小鼠胸腺指数变化 3个剂量组在照后各个时间点胸腺指数均低于对照组；6 Gy照射组在照后第14，21，28天与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；9 Gy及12 Gy照射组在照后第7，14，21，28天与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，第21，28天与对照组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

2.4 小鼠病理组织学改变 苏木精-伊红染色可见对照组小鼠的胸腺组织结构清晰，皮质髓质分界明显，皮质区淋巴细胞排列整齐、密集，髓质区可见胸腺小体。

照射组小鼠胸腺体积均不同程度缩小，镜下见皮质区淋巴细胞变性坏死，出现较多细胞碎片，髓质区胸腺小体消失，细胞数量减少，尤以照射后第7天较明显，且损伤程度与放射剂量呈正相关；照射后第14天，胸腺皮质区变性坏死淋巴细胞减少，细胞数量逐渐增加；照射后第28天，胸腺皮质区及髓质区的细胞数量均明显增加，胸腺体积逐渐增大，但仍小于照射前。

3个剂量组中，6 Gy组胸腺损伤最轻，于照射后第7天已出现修复，照射后第14天可见胸腺细胞明显增加；12 Gy组损伤最重，照射后第7天变性坏死淋巴细胞减少，但未见明显修复迹象，第14天胸腺细胞数量有所增加，但较6 Gy组少；9 Gy组介于两者之间，见图3。

3个剂量照射组中，12 Gy照射组部分小鼠出现了放射性食管炎和放射性气管炎的改变，镜下表现为食管、气管黏膜基底层细胞增多，血管充血，上皮层部分坏死脱落，固有层、黏膜下层可见炎细胞浸润；其余2组食管、气管、肺均未出现放射性损伤，见图4。

2.5 小鼠外周血象测定结果 3个剂量照射组外周血白细胞和淋巴细胞计数在照射后低于对照组，照射后第7天降到最低，其后逐步升高，但至照射后28 d仍未完全恢复正常。

3组在照射后各个时间点上与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)；3组之间比较，6 Gy组与9 Gy组在各时间点差异无显著性意义，12 Gy组在照后第7天和第14天与6 Gy组及9 Gy组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5，6。

2.6 小鼠胸腺T细胞亚群检测结果 对照组胸腺CD4⁺CD8⁺细胞比例大约为70%，CD4⁺CD8^-细胞比例约为20%，CD4^-CD8⁺细胞比例约为7%，而CD4^-CD8^-细胞仅占2%左右。在胸腺受照射后，CD4⁺CD8⁺细胞下降幅度最大。CD4^-CD8^-细胞则于照后出现大幅度升高，幅度最大者接近于20倍。CD4⁺CD8^-和CD4^-CD8⁺细胞比例在照射后与对照组相比均出现下降(P < 0.05-0.01)。3个照射组的变化趋势相同，但随着照射剂量的增大，各群细胞的变化幅度均增大，见表2。

2.7 小鼠外周血T细胞亚群测定结果 对照组外周血中CD3⁺细胞比例在40%左右，CD3⁺CD4⁺细胞比例约为30%，而CD3⁺CD8⁺细胞比例约为10%，CD4/CD8约为3.0。照射后各群细胞的比例都出现了变化，主要表现为CD3⁺细胞比例上升；CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺细胞比例下降，CD4/CD8的值也下降(P < 0.05)。3个剂量照射组的变化趋势是相同的，但随着照射剂量的增高，变化幅度增大，见表3。

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引言

材料方法

设计：分子、细胞水平，体外观察实验。

时间及地点：于2010年9月至2011年4月在军事医学科学院附属307医院放射病研究所完成。

材料：

实验动物：雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，体质量18-22 g，购于解放军军事医学科学院动物中心，在军事医学科学院动物中心二级清洁动物房饲养。动物许可证号：SCXK-(军) 2007-004。

小鼠放射性胸腺损伤模型建立实验的主要试剂与仪器：

Main experimental reagents and instruments:

方法：

动物分组及照射方法：雌性BALB/C小鼠160只，按随机数字表法分为4组：对照组40只，予以假照射；6 Gy照射组40只，胸腺单次照射6 Gy；9 Gy照射组40只，胸腺单次照射9 Gy；12 Gy照射组40只，胸腺单次照射12 Gy。将戊巴比妥钠配成1%浓度，以40-60 mg/kg剂量腹腔注射麻醉小鼠，然后使用自制固定装置将小鼠仰卧固定，暴露纵膈，10 cm铅板屏蔽其他部位。用⁶⁰Co放射治疗机经前胸野单次照射小鼠纵膈，剂量率为154.7 cGy/min，动物距放射源80 cm，照射时长分别为6 Gy组257 s，9 Gy组386 s，12 Gy组514 s。对照组小鼠仅予以相同剂量药物麻醉后假照射。

观察小鼠体质量改变及进食水量：动态观察各组小鼠体质量改变，并观察照射后1周内各组小鼠平均每日进食量和饮水量。

胸腺指数测定：照射后7，14，21，28 d检测。采集标本前称取小鼠体质量，以颈椎脱臼法处死小鼠后从胸部正中线打开胸腔，充分暴露位于胸骨上段后的乳白色胸腺，从根部完整剥离，用滤纸吸取血液、剔除结缔组织和脂肪后在分析天平上称取质量，按照公式计算胸腺指数。

病理组织学观察：照射后7，14，21，28 d处死小鼠留取胸腺左叶，置于体积分数10%甲醛溶液中固定 24 h，常规脱水、浸蜡、包埋、切片(5 μm)，苏木精-伊红染色，在光镜下观察组织的病理改变。

照射后第7天处死小鼠留取食管、气管、肺，置于体积分数10%甲醛溶液中固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋、切片(5 μm)，苏木精-伊红染色，在光镜下观察。

外周血血象检测：照射后1，7，14，21，28 d留取各组小鼠尾静脉血40 μL，EDTA抗凝(干燥管)，上全自动血细胞分析仪检测。

胸腺T细胞亚群检测：照射后14 d处死小鼠留取胸腺右叶，用滤纸吸取血液、剔除结缔组织和脂肪后用眼科剪剪碎，100目钢丝滤网过滤，以PBS制作浓度为 1×10¹⁰ L^-1的单细胞悬液，取100 μL加入相应抗体1 μL， 4 ℃避光孵育25 min，PBS清洗2遍，重悬后流式细胞仪检测。

外周血T细胞亚群检测：照射后14 d留取各组小鼠尾静脉血100 μL，EDTA抗凝，每100 μL外周血加入相应抗体1 μL，4 ℃避光孵育25 min，加入3 mL溶血素常温避光静置30 min，去除红细胞，PBS清洗2遍，重悬后流式细胞仪检测。

主要观察指标：照射前后小鼠体质量及进食水量，胸腺指数，食管、气管、肺、胸腺的病理切片，外周血血象，胸腺T细胞亚群和外周血T细胞亚群变化。

统计学分析：由作者采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，各组间在同一时间点的差异性比较采用t 检验，各组间总的趋势比较采用重复测量数据的方差分析。

讨论

胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所，从骨髓迁入的淋巴样祖细胞，在与胸腺微环境基质细胞的相互作用下，历经CD4、CD8双阴性、双阳性和单阳性3个阶段以及阳性选择、阴性选择等复杂的分化发育过程，最终成为功能性CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞，迁移出胸腺，定位于外周淋巴组织和器官而发挥作用。在这个过程中，T细胞不仅具有了自身MHC限制性，同时也形成了T细胞的中枢免疫耐受。胸腺中的基质细胞可产生多种肽类激素，在促进胸腺细胞分化成熟的同时，还能参与调节外周成熟T细胞。因此，胸腺的功能状态直接决定机体细胞免疫功能，并间接影响着体液免疫功能，对机体正常的免疫平衡起着重要的作用。通常情况下，由于胸腺的位置比较隐蔽，而且胸腺内的血管为网状细胞包围，构成胸腺屏障，避免机械和生化因素引起的胸腺损伤，但胸腺对辐射高度敏感，在放射性事故、尤其是急性中重度放射病发生时，常受到射线的损伤，导致T细胞的发育受到严重影响、免疫功能下降，进而继发严重感染引起患者的死亡。但胸腺的放射损伤机制及防治措施至今仍然是放射生物学家和临床医学工作者面临的难题之一，因此建立合适的模型对胸腺放射性损伤的机制探讨和防治都至关重要。

在放射性损伤模型的构建中，可供选择的动物有猴、猪、羊、狗、兔、鼠等^[1-6]，其中猴、狗、大鼠和小鼠复制放射病模型比较理想，尤其是BALB/C小鼠和Wistar大鼠多做为首选^[7]。由于小鼠具有成本低、可控性强、重复性好、模型稳定可靠等特性，作者所在实验室前期有关放射损伤的实验中多选用BALB/C小鼠，故实验中继续选用BALB/C小鼠建模。

在照射方式的选择上，文献报道基本上均为全身照射^[8-12]。虽然全身照射更接近核事故等放射损伤发生时受照射个体的状态，但全身照射时射线同时损伤骨髓、脾脏、淋巴结以及其他组织、脏器，导致机体出现多脏器损伤的反应，使某些结果受到干扰而不能反映胸腺放射损伤的变化，因此，为了避免其他组织、器官受损后对结果的影响，实验制作了单纯胸腺放射性损伤的模型。由于小鼠胸腺体积小、位置较深，难以精确定位，为了保证胸腺能充分受到射线照射同时尽量减少其他组织的损伤，在实验中采用了纵膈照射的模式。在实验过程中解剖小鼠采集胸腺时，未发现有胸腺位置变异的样本，而且各照射组小鼠胸腺标本均较对照组小鼠体积减小、质量减轻，同时经病理组织学验证均不同程度存在损伤，证明通过纵膈照射模式可引起小鼠胸腺损伤。

在照射总剂量相同的情况下，可采用单次照射和多次照射两种方式，两种方式均可引起脏器相应的损伤，这在其他脏器放射性损伤模型的构建上得到验证：有报道对比大鼠一次性给予30 Gy或3 Gy每周2次总剂量30 Gy的照射，组织学证实两组均能引发典型的放射性肺损伤^[13]；在肾脏放射性损伤的模型构建中，每周1次照射共计3周也能复制出肾脏放射损伤的模型^[14]。尽管分次照射能构建放射损伤的模型，但照射后采集的标本不如单次照射后采集的标本更能体现脏器受辐射后的损伤、修复过程，而且还有报道指出由于分次照射时程长，实验动物存活率高，其中部分实验动物因组织代偿及自身修复等原因而导致建模失败^[15]。因此本实验中采用单次照射的模式。

对于剂量的选择，既要考虑到能诱导胸腺出现典型的放射损伤，又要尽量减少周围组织脏器的损伤。根据文献的报道，在2-12 Gy辐照剂量范围内，组织脏器会表现出经典的损伤和修复模式^[16]，而以亚致死量全身照射时小鼠脏器的改变比较典型^[17]。因为小鼠的亚致死照射剂量为6 Gy，所以实验在6-12 Gy范围内制定照射

剂量。又因食管和气管黏膜在10 Gy以下基本不会出现损伤，而超过10 Gy后半数实验动物会出现黏膜损伤，进而导致放射性食管炎、气管炎的发生而引起进食、水量的下降，甚至继发肺部感染而影响实验结果，故实验中选择6，9，12 Gy 3个剂量。实验结果显示，3个剂量照射组的小鼠均出现了胸腺的放射性损伤，而且，损伤程度随着剂量的递增而逐步加重。同时，在周围脏器的损伤方面，6 Gy和9 Gy 2个剂量组小鼠未发生食管、气管及肺脏的放射性损伤，而12 Gy照射组部分小鼠出现了放射性食管和气管损伤，引起了小鼠的进食、水量的显著下降和小鼠体质量的减轻，进而在一定程度上干扰了胸腺的修复过程。因此，从尽量减少无关脏器损伤的角度看，12 Gy的照射量不适合小鼠胸腺放射损伤模型的构建。又因为9 Gy剂量组比6 Gy剂量组的胸腺损伤更典型，从病理改变的角度看，9 Gy更适合胸腺建模。

目前对于胸腺放射性损伤的研究一般都是在全身照射的背景下进行^[18-20]，未见单独照射胸腺建模的报道，也缺乏相应的模型构建标准，因此，为了能准确构建胸腺放射性损伤的模型，本实验依据胸腺放射损伤的特点，从形态、病理、胸腺指数、血象、胸腺及外周血T细胞亚群等几个方面的改变来判断模型是否构建成功。胸腺辐射损伤后主要经历淋巴细胞坏死清除期、残留期、枯竭期、再生修复期和基本恢复期5个阶段，与造血组织的损伤过程相同，但胸腺照射后的坏死清除期更迅速和剧烈，残留期极短，再生时间更早、再生能力更强。在病理形态上表现为照后淋巴细胞很快出现分裂抑制、核固缩、核崩解，数小时内T细胞的凋亡率就增加数倍至数十倍，胸腺小体消失，胸腺极度缩小；照射后1 d，大量的核碎片以及受损T细胞由巨噬细胞清除，胸腺内仅存留少量的淋巴细胞^[21]；再生时间则由照射剂量和受损程度决定，剂量越大、受损程度越重，再生开始时间越晚，再生周期越长，经中等致死剂量照射后一般于1周左右开始再生，但至照后三四周尚未完全恢复^[17]。从实验结果看，小鼠胸腺的病理改变基本符合上述过程。

胸腺的损伤反映到外周血象则表现为白细胞和淋巴细胞的数量改变。3个剂量照射组小鼠的外周血白细胞计数及淋巴细胞计数均明显下降，于第7天降至最低值，其后逐步升高，比文献报道的最低值持续时间明显缩短^[22-24]，考虑为实验是单独照射胸腺，而不是全身照射，因此小鼠的骨髓未受损，造血干细胞的数量和功能保持完好，在受照射后骨髓可以通过增加淋巴干祖细胞的数量并归巢至胸腺而加快胸腺的修复和功能的恢复；另外，外周淋巴组织及器官中的T细胞也可通过扩增及T细胞再生的非胸腺依赖途径维持T细胞稳态。

试验中胸腺T亚群结果显示，CD4⁺CD8⁺细胞在照射后快速下降，证实与双阴性及单阳性细胞相比，它对辐射的敏感性最高；在照射后14 d双阳性细胞出现增殖高峰，这与Penit等^[23]关于小鼠胸腺细胞受亚致死量照射后CD4⁺CD8⁺细胞有两个增殖高峰的报道不同，考虑也与模型构建时照射模式不同、骨髓造血干细胞未受损可以持续增加干祖细胞归巢有关；同时，Penit等^[23]的结果还显示，如果给予造血干细胞移植，由于正常淋巴干祖细胞的植入，大量增殖则可以避免照后21 d出现的CD4⁺CD8⁺细胞再次减少。照射后胸腺T亚群中，双阴性细胞比例大幅升高是因为它对辐射的敏感性最低，凋亡细胞的数量不如其他几群细胞多，因而虽然绝对值下降，但相对比例却增高。单阳性的细胞比例升高也是由于它们对辐射的敏感性低于双阳性细胞，所以尽管绝对值下降了，但相对比例却增高，但其增高的幅度比双阴性细胞小，说明CD4⁺或CD8⁺单阳性细胞对辐射的敏感性低于双阳性细胞却高于双阴性细胞。外周血T细胞亚群的结果T细胞比例下降，考虑为由于胸腺受损，T细胞输出持续减少，导致外周血T细胞数量减少，而且B细胞数量未受影响，所以外周血T细胞比例下降。

从实验数据上看，相对于对照组，3个剂量照射组的小鼠胸腺无论从形态、病理还是血象、T细胞亚群等方面均符合放射损伤的特点，但12 Gy照射组由于出现了放射性食管、气管损伤，这在一定程度上干扰了小鼠的进食水量，并影响了胸腺的修复；而6 Gy组由于损伤相对较轻，在照后1周内就开始修复，病变也不如 9 Gy照射组典型；而9 Gy组即保留了放射性损伤的特点，也避免了其他脏器损伤带来的干扰，能反应胸腺放射性损伤后的改变，故可将9 Gy单次纵膈照射作为制作小鼠胸腺放射性损伤模型的模式。

实验较好地模拟了放射性胸腺损伤过程，成功建立了小鼠胸腺放射性损伤模型，为进一步的研究提供了实验基础。

放射性胸腺损伤小鼠模型的建立

Establishing a mouse model of radiation-induced thymus injury

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