胚胎不同发育阶段人类皮肤及附属器官汗腺的基因表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4421-4428.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.008

• 皮肤粘膜组织构建 skin and mucosal tissue construction • 上一篇下一篇

胚胎不同发育阶段人类皮肤及附属器官汗腺的基因表达

陈力莹¹，范锟铻¹，王金水²，余旭明¹，徐成¹

1深圳市第二人民医院烧伤整形科，广东省深圳市 518000
2深圳市北大高科五洲医药有限公司，广东省深圳市 518000

收稿日期:2012-11-11 修回日期:2013-02-04 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 范锟铻，硕士，主任医师，深圳市第二人民医院烧伤整形科，广东省深圳市 518000 fankunwu@hotmail.com
作者简介:陈力莹，男，1966年生，广东省湛江市人，汉族，1989年广东医学院毕业，副主任医师，主要从事烧伤-微量元素，烧伤-组织修复方面的研究。 624192754@qq.com

Gene expression of the skin and sweat glands in different development stages of embryo

Chen Li-ying¹, Fan Kun-wu¹, Wang Jin-shui², Yu Xu-ming¹, Xu Cheng¹

1 Department of Burns and Plastic Surgery, the Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
2 PKU Shenzhen Wuzhou Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2012-11-11 Revised:2013-02-04 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Fan Kun-wu, Master, Chief physician, Department of Burns and Plastic Surgery, the Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China fankunwu@hotmail.com
About author:Chen Li-ying, Associate chief physician, Department of Burns and Plastic Surgery, the Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China 624192754@qq.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：关于汗腺的发生与发育过程及汗腺损伤与再生之间的联系尚缺乏基因水平的证据，故各种原因所致的皮肤损伤都不能达到解剖结构与生理功能的完全修复。
目的：观察胚胎不同发育阶段皮肤组织的形态结构及皮肤附属器汗腺的发生和发育规律，寻找在汗腺发育中起重要作用的相关基因。
方法：13例胎龄为12-36周终止妊娠的胎儿，由深圳市第二人民医院妇产科严格遵循伦理原则、征得家属同意并签署合同书后提供。苏木精-伊红染色和ABC免疫组化法观察不同发育阶段人类胎儿皮肤组织及附属汗腺的结构和特征，采用RT-PCR方法分析生长发育过程中人类胎儿皮肤及汗腺附属器官相关基因的表达。
结果与结论：①不同胎龄的人类胎儿皮肤组织结构呈现规律性的变化，可大致划分为3个发育阶段：其中汗腺形成初期(胚芽或原基期)(E12-15周)、汗腺形成中期(E16-24周)，汗腺成熟期(E25+-36周)。②胎儿皮肤组织内的汗腺细胞中表达角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和癌胚抗原生物分子标记，而在真皮层和表皮层的其他细胞呈阴性反应，角蛋白19不是表皮干细胞的特异性标记物。③表皮生长因子及其受体积极地参与了皮肤及汗腺的形态发生过程，在皮肤及汗腺的功能维持中起着重要的作用。

关键词: 组织构建, 皮肤组织构建, 胚胎, 胚胎发育阶段, 皮肤, 汗腺, 皮肤附属器官, 基因, 基因表达, 皮肤再生

Abstract:

BACKGROUND: Because of the shortage of genetic evidence for the occurrence and development of the sweat glands as well as the relationship between sweat gland injury and regeneration, various reasons caused skin injury cannot reach complete repair of anatomical structure and physiological function.
OBJECTIVE: To observe the morphology of skin tissue, and the occurrence and development pattern of the sweat gland, a skin appendage, in different development stages of embryo, as well as to find the related genes that play important roles in the development of sweat glands.
METHODS: Thirteen fetuses with the gestational age of 12-36 weeks were provided by the Second People’s Hospital of Shenzhen, which strictly followed the ethical principles, and informed consent was written by their families. Hematoxylin-eosin staining and ABC immunohistochemical method were used to observe the structure and characteristics of fetal skin tissue and sweat glands in different development stages of embryo. Reverse transcription-PCR was used to analyze the gene expression of fetal skin tissue and sweat glands in the growth process.
RESULTS AND CONCLUSION: Skin tissue structure of human fetus with different gestational ages showed regular change, which could be roughly divided into three development stages: the early formation of sweat glands (germ or the original base period, E12-15 weeks), the middle formation of sweat gland (E16-24 weeks), sweat gland maturation period (E25+-36 weeks). The keratin 7, keratin 8, keratin 18 and carcinoembryonic antigen biomolecular markers were positively expressed in the sweat gland cells of fetal skin tissue, while negatively expressed in the other cells of dermis and epidermis. The keratin 19 was not the specific marker of epidermal stem cells. Epidermal growth factor and its receptor are actively involved in the skin and sweat gland morphogenesis, which play an important role in maintaining the function of skin and sweat glands.

Key words: tissue construction, skin tissue construction, embryo, embryonic developmental stage, skin, sweat glands, skin appendages, genes, gene expression, skin regeneration

中图分类号:

R318

陈力莹，范锟铻，王金水，余旭明，徐成. 胚胎不同发育阶段人类皮肤及附属器官汗腺的基因表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4421-4428.

Chen Li-ying, Fan Kun-wu, Wang Jin-shui, Yu Xu-ming, Xu Cheng. Gene expression of the skin and sweat glands in different development stages of embryo[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4421-4428.

图/表（结果） 4

2.1 不同发育阶段胎儿皮肤及附属汗腺的生物学特征 光镜下可见不同发育阶段的人类胚胎胎儿皮肤具有特殊的组织学结构，汗腺在胚胎期E10周首先于手足掌部开始发育，外观上表皮嵴中基底细胞呈树枝状向真皮方向延伸，这时表皮含有较多的脂类物质，仅由一二层细胞组成空泡状的周皮，周皮基底层细胞排列疏松且尚未形成极性细胞。

E12周后表皮基底层细胞开始充盈饱满并逐渐呈栏栅状排列，表皮嵴形成，毛囊的原基开始出现，外观形态呈相间分布的细胞团，间质细胞包绕其周围，见图1。

E13-15周皮肤表皮基底层向上已经比E10周多了1倍的细胞层组成，达2-4层，排列仍然无层次，毛乳头开始形成，见图2，相间出现的汗腺原基明显发育的比E10周更成熟。

E15-18周空泡状的周皮细胞开始脱落，皮下脂肪组织开始形成，表皮和真皮层均增厚，皮脂腺形成，足底汗腺原基内细胞呈条树枝状向真皮深层生长，见图3。

在E20周前后汗腺在身体其他部位也开始发育，并且已经能观测到完整的毛囊、皮脂腺结构。

E22-24周，皮肤表皮已经达到3-5层上皮细胞，且排列得非常规整，毛囊和皮脂腺结构进一步形成，汗腺起源于原始的上皮，通过上皮细胞增殖，向其下方的结缔组织内伸入，形成上皮芽和细胞索，随后通过进一步的演变而形成汗腺。在演变过程中，这些上皮芽或细胞索与表层上皮保持联系，并发育成导管，形成汗腺，3种汗腺的细胞形态均已经可见。

E26-32周，皮肤表层出现角化，汗腺、毛囊和皮脂腺结构完整、数量稳定，其汗腺结构基本与成人类似，毛干已形成，皮脂腺内开始出现类似油脂的脂性分泌物，见图4。

2.2 汗腺细胞中角蛋白的表达 根据皮肤汗腺结构形成的时序大致划分为汗腺形成初期(胚芽或原基期)、汗腺形成中期和汗腺成熟期；胎儿汗腺细胞能用角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和癌胚抗原等生物分子标记。角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和癌胚抗原只在皮肤组织内的汗腺细胞中表达，而在真皮层和表皮层的其他细胞呈阴性反应，见图5。

2.3 RT-PCR检测不同发育阶段人胎儿皮肤及附属汗腺的基因表达 表皮生长因子和表皮生长因子受体的mNRA经过RT-PCR扩增后，得到特异性的DNA片段分别由149 bp和168 bp组成。RT-PCR结果显示表皮生长因子基因在胚芽期即有表达，随着胎龄的增加，表皮生长因子的表达量总体呈高水平趋势；而表皮生长因子受体基因的表达量稍稍滞后，且其表达量增幅最快是在汗腺形成初期和中期，成熟期表皮生长因子及其受体的基因则持续表达，见表1。

实验结果表明在胎儿发育的第10-14周Eda基因存在少数表达，到胎儿发育的第16周，其表达有显著的增加，在17-24周期间，胎儿皮肤中都有Eda基因呈强表达，这正是人类汗腺的发育成形期，之后， Eda的表达最依然维持特定的水准，但已经开始下降，见图6。

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引言

皮肤覆于身体表面，是人体中代谢最大、最为活跃的器官，担负着防御保水、体温调节、吸收分泌、免疫应答、感觉和维持体貌等重要生理功能^[1]。

汗腺是表皮在生长发育过程中衍生的皮肤附属器之一，汗腺只发生于胚胎的早期发育阶段，出生后不再生成新汗腺，轻度烧伤后，汗腺细胞可以用其深部未受创部分为模板进行完全修复^[2-4]；但各种原因所致的中重度皮肤损伤至今也无法通过自身干细胞的增殖分化和空间重构而完全再生^[5]，烧伤或者其他原因所致的汗腺缺失给达到解剖学愈合后的患者带来极大的不适和痛苦，严重影响其生活质量^[6]，主要是人们对汗腺的发生与发育过程缺乏系统和微观的认识以及对汗腺损伤与再生之间的联系缺乏基因水平的认识^[7]，同时也是由于人们尚未完全了解皮肤细胞增殖分化与再生过程中的基因调控机制，因而缺乏有效的促增殖分化与再生修复手段^[8]。研究人类皮肤在不同生长发育过程中的特征及在不同的生长发育阶段诱导其分化发育形成汗腺细胞的表达基因及其功能，将有望能够找到调控人类皮肤及其附属汗腺分化的特异性基因，进而从基因水平上探求人类皮肤及其附属汗腺的发育分化机制。

RH谱的建立，使染色体精细定位成为可能。1996年Kere领导的实验小组将与人类汗腺的胚胎形成与分化发育密切相关的Eda基因定位于xq12-13.1染色体，并成功克隆，Eda基因属于较晚确定的肿瘤坏死因子超家族成员，1998年Baye等用RACE方法成功克隆该基因的全长基因(5 307 bp)并分析了其功能，Sheng等^[9]的研究也表明，Eda基因的表达产物及其受体在汗腺的胚胎发育中占有重要作用，人类和tabby小鼠的Eda突变，导致毛囊数量的下降和牙齿以及汗腺管的发育缺陷^[10]。新突变点的发现不仅可以充实人类的疾病基因库，而且有利于

全面深入了解该基因的结构和功能。大部分检测Eda表达的方法是通过原位杂交来分析，用RT-PCR方法检测发现Eda的表达较为普遍，采用PCR方法扩增Eda基因外显子，直接将PCR产物进行测序^[11-17]。

人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的相对分子质量为6×10³(SDS-PAGE)或6.4×10³(超速离心)，含有53个氨基酸残基，有3对二硫键，没有糖基化位点；二级结构中没有α螺旋。人表皮生长因子的20-31位氨基酸残基是表皮生长因子结合受体的部位，而N端和C端的氨基酸对结合部位的构型稳定性十分重要。其基因位于染色体4q25-27，mRNA长约4.75 kb，编码含1 217个氨基酸残基(相对分子质量130×10³)的表皮生长因子前体^[18]。

表皮生长因子受体是CerbBl/EGFR基因编码的Src族跨膜受体酪氨酸激酶，是相对分子质量为170×10³-175×10³的跨膜糖蛋白，含有1 186个氨基酸残基，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。其氨末端胞外区又可分成4个亚区，是表皮生长因子受体与配体(转化生长因子α、表皮生长因子、双调节素等)结合的部位；跨膜区由一个亲脂性多肽螺旋构成；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。表皮生长因子受体在非活性状态下是单体，当受体与配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生自我磷酸化并启始一系列胞内信号级联。与之相关的信号途径和信号传递蛋白有：磷酯酶C-γ1、磷酯酰肌醇3激酶、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶等。

伴随汗腺发育时相变化同步激活表达的相关基因及其表达产物、阐明细胞分化的基因调控机制和可能影响因素、筛选特异性发育基因，将有望为从基因水平调节汗腺修复或再生及完善皮肤功能开辟一条新的治疗方法和途径^[19-28]。

材料方法

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：于2012年5月18日在深圳市第二人民医院实验室设备研究中心完成。

材料：13例胎龄为12-36周终止妊娠的胎儿，由深圳市第二人民医院妇产科严格遵循伦理原则、征得家属同意并签署合同书后提供，于产后半小时内取头部、眼睑、耳郭、背部、腹部及手指等不同部位皮肤，确保所有取材部位均未经任何治疗并严格按无菌原则操作。

检测人类皮肤及汗腺附属器官在胚胎不同发育阶段的基因表达所需试剂和仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

分组：共收集符合条件的胎儿13例，胎龄为12-36周，按其胎龄分为3组，其中12-15周4例、16-24周5例， 25⁺-36周4例。

材料处理：所获取胎儿皮肤大致划分为3个发育阶段：其中汗腺形成初期(胚芽或原基期)(E12-15周)、汗腺形成中期(E16-24周)，汗腺成熟期(E25⁺-36周)。用于反转录多聚酶链反应(RT-PCR)进行基因表达检测的部分立即置液氮冻存；行组织形态学观察的包埋切片并置于40 g/L多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(含1/1 000 DEPC)固定；另有少部分用于消化分离汗腺组织。

苏木精-伊红染色：组织固定后石蜡包埋，用二甲苯Ⅰ脱蜡15 min，二甲苯Ⅱ脱蜡10 min，逐级降浓度乙醇水化，分别为无水乙醇Ⅰ1.0-2.0 min，无水乙醇Ⅱ1.0-2.0 min，体积分数为95%乙醇1.0-2.0min，体积分数为80%乙醇1.0-2.0 min。然后自来水冲洗，蒸馏水冲洗，苏木精染核10-15 min，自来水冲洗,1%盐酸乙醇分化1 min，碳酸锂饱和水溶液反蓝，0.5%伊红复染2- 5 min，逐级升浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

免疫组织化学染色：40 g/L多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液过夜，石蜡切片用0.01 mol/L KPBS清洗5 min×3；加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液30 min，消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L KPBS清洗5 min×3；加入配好的0.3%Triton×100 30 min，增加细胞通透性，0.01 mol/L KPBS清洗5 min×3；血清稀释液稀释一抗，4 ℃放置24 h，0.01 mol/L KPBS清洗 5 min×3；加二抗室温孵育2 h，0.01 mol/L KPBS清洗 5 min×3；加ABC复合物，室温孵育2 h，0.01 mol/L KPBS清洗5 min×3；蒸馏水迅速冲3次；显色，进行免疫组化染色，时间不超过30 min，用蒸馏水冲洗3次终止反应；梯度乙醇脱水，封固，拍照。

基因芯片检测：先用Trizol试剂一步法提取皮肤组织中的总RNA，采用AMV反转录酶和随机引物进行反转录，严格按Prmoega公司反转录试剂盒说明书操作，全部操作过程在冰浴中进行，反转录成DNA待芯片杂交，然后对样品的RNA进行标记并RT-PCR。

主要观察指标：苏木精-伊红染色光镜下观察不同胎龄胎儿皮肤组织的结构和特征；免疫组化方法光镜下观察汗腺细胞的特异性标记分子的表达；RT-PCR方法分析不同发育阶段人胎儿皮肤及附属汗腺的基因表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析，各项指标以x(_)±s表示，计量资料进行t 检验。 P < 0.05或P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

实验证实，在胚胎发育的不同时期，胎儿皮肤的表皮嵴、毛囊胚芽和汗腺原基呈现特殊的组织学结构，形成程序跨度大、紧凑且有序。

毛囊胚芽和汗腺原基向真皮内延伸的方式有很大差异，毛囊胚芽用一种表皮基底层结构向真皮下凹陷的方式延伸，汗腺细胞则是用树枝状结构向真皮下延伸形成，汗腺原基的发育略滞后于毛囊胚芽，毛囊胚芽和汗腺原基均在胎龄25-32周(E25-32周)发育基本处于成熟后的停滞状态。

实验以光镜下胚胎皮肤发育过程中毛囊胚芽和汗腺原基结构形成的时序和发育节点为划分依据，将胎儿皮肤划分为3个发育阶段：胎龄12-14周(E12-14周)为原基期，这实际是汗腺形成初期，这一时期在身体不同部位的数量和深浅各异的表皮峭开始形成，汗腺处于胚芽状态；表皮嵴的出现，一方面使得胎儿皮肤的表皮和真皮结构更加稳定，同时不同的表皮嵴也相互反馈发育信号，进而促进汗腺和毛囊的发育；胎龄15-24周(E15-24周)为发育期，这是汗腺形成中期，毛乳头、皮脂腺开始形成，这一时期的汗腺处于快速生长发育阶段；胎龄25-32周(E25-32周)为发育成熟期，皮肤表层角化层已经出现，汗腺、毛囊和皮脂腺结构完整、数量稳定，毛干已形成，这是汗腺形成末期，这一时期的汗腺处于发育成熟阶段；汗腺只发生于胚胎早期发育阶段，出生后即不再有新汗腺生成，使得汗腺胚胎期发育的研究与成体汗腺毁损后的修复与再生治疗之间关系更加密切^[29-31]。

细胞角蛋白泛指上皮细胞中等纤维蛋白，细胞角蛋白在表达时呈现特异性，一方面，细胞角蛋白仅在上皮细胞中表达，另一方面，特定细胞角蛋白只表达在特定的上皮细胞中。细胞角蛋白19是上皮源性细胞特异性标志基因^[32]，是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质，也是维持细胞形态的重要蛋白^[33]。免疫组化的结果表明：人类胎儿的基底层细胞、部分毛囊、汗腺导管部和分泌部细胞中均有角蛋白19的表达，汗腺的分泌细胞和分泌部相连的弯曲导管部则仅有角蛋白7、8和18的特异性表达，角蛋白19在这一部位无表达，导管的表皮内段和表皮层细胞未见角蛋白7、8和18的表达。表皮干细胞通常用角蛋白19标记和筛选，但本次研究表明，虽然角蛋白19在汗腺细胞中的表达呈现阳性，但是汗腺组织结构中证实不存在干细胞，角蛋白19也不能成为表皮干细胞的特异性标记物。

表皮生长因子是1959年由Cohen在大鼠颌下腺中发现的，它是由53个氨基酸组成的单链多肽，相对分子质量为6 040^[34]。Nakai等^[35]的研究表明，随着年龄的增加，外分泌汗腺中表皮生长因子的浓度(表皮生长因子/单位汗腺体积)增加，这种渐进模式的增加，也与汗液量的增加成正例。已查明其氨基酸序列，氨基端为天冬氨酸，羧基端为精氨酸^[36]。表皮生长因子能对多种组织来源的细胞增殖或分化起促进作用，但它必须与细胞质膜表面上的表皮生长因子受体结合而产生其生物学效应，通过表皮生长因子受体的介导作用可刺激表皮生长、分化和增殖，对多种组织有促进增殖的作用。表皮生长因子受体的相对分子质量为170 000，是一种糖蛋白，其基因位于人类第7号染色体短臂1区2带至3带上，含 1 186个氨基酸单链多肽，分为膜外结合区、跨膜转化区和胞质效应区3部分。表皮生长因子及其受体在皮肤及汗腺发育中的分布和作用早已是业界注视的焦点^[37]，光镜下表皮生长因子的免疫反应定位在表皮基底层以上细胞及外分泌汗腺的导管部和分泌部细胞，表皮生长因子受体及其配体表皮生长因子是细胞信号传递系统的一部分，外分泌汗腺的肌上皮细胞也有抗表皮生长因子抗体(表皮生长因子受体)的阳性反应，表皮生长因子-表皮生长因子受体作为皮肤发育中重要的多功能信号分子的一部分，是一种强有力的角质形成细胞促分裂剂^[38]，当表皮生长因子发生作用时，受体的膜外结合区构型发生变化，在具有酪氨酸激酶(TK)活性的胞质效应

区中，与ATP磷酸化底物结合，使位于TK区的1068、1148、1173的酪氨酸残基磷酸化，产生二酰甘油(DAG)及三磷酸肌醇(IP3)。部分大龄胎儿的分泌腔中可见无结构的表皮生长因子阳性染色，考虑此时汗腺细胞已具有分泌黏液的功能，可使细胞内游离钙离子增多，激活蛋白激酶C和环腺苷酶，改变细胞的骨架结构，使细胞发生分化、分裂和增殖^[39]。RT-PCR结果表明表皮生长因子及其受体积极地参与了皮肤及汗腺的形态发生过程，在皮肤及汗腺的功能维持中起着重要的作用。

总之，不同胎龄的人类胎儿皮肤组织结构呈现规律性的变化，其发育相关基因的转录表达水平的变化与胎儿皮肤组织结构的变化规律基本相符。同时证实角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和癌胚抗原为胎儿皮肤组织内汗腺细胞的生物分子标记，角蛋白19不是表皮干细胞的特异性标记物。而且表皮生长因子及其受体积极地参与了皮肤及汗腺的形态发生过程，在皮肤及汗腺的功能维持中起着重要的作用。这些研究均为探讨基因和干细胞治疗在汗腺组织再生修复方面的可行性提供理论依据。

胚胎不同发育阶段人类皮肤及附属器官汗腺的基因表达

Gene expression of the skin and sweat glands in different development stages of embryo

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