建立裸鼠皮下荧光子宫内膜异位症模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.013

中国组织工程研究

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

建立裸鼠皮下荧光子宫内膜异位症模型

袁华¹，龚健¹，王嘉圆¹，黄伟²

1南京医科大学附属无锡市妇幼保健院，江苏省无锡市 214002
2苏州大学附属无锡市第三人民医院，江苏省无锡市 214041

收稿日期:2012-07-30 修回日期:2012-09-11 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 黄伟，硕士，副主任医师，硕士生导师，苏州大学附属无锡市第三人民医院，江苏省无锡市 214041 hwhucb2004@163.com
作者简介:袁华☆，女，1971年生，湖南省湘潭市人，汉族，南方医科大学在读博士，副主任医师，主要从事子宫内膜异位症的基础及临床研究。yuanhua62099@163.com
基金资助:
江苏省无锡市科技局基金项目(CSZ00946)。

Establishing a nude mouse model of green fluorescence endometriosis

Yuan Hua¹, Gong Jian¹, Wang Jia-yuan¹, Huang Wei²

1 Wuxi Maternal and Child Health Hospital, Nanjing Medical University, Wuxi 214002, Jiangsu Province, China
2 Third People’s Hospital of Wuxi City, Soochow University, Wuxi 214041, Jiangsu Province, China

Received:2012-07-30 Revised:2012-09-11 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Huang Wei, Master, Associate chief physician, Master’s supervisor, Third People’s Hospital of Wuxi City, Soochow University, Wuxi 214041, Jiangsu Province, China hwhucb2004@163.com
About author:Yuan Hua☆, Studying for doctorate, Associate chief physician, Wuxi Maternal and Child Health Hospital, Nanjing Medical University, Wuxi 214002, Jiangsu Province, China yuanhua62099@163.com
Supported by:
the Funding Program of Science and Technology Bureau of Wuxi City, No. CSZ00946*

摘要/Abstract

摘要：

背景：将绿色荧光蛋白标记的裸鼠子宫内膜注射于裸鼠皮下，构建子宫内膜异位症动物模型，操作简便，同时可在一定时间内体外动态观察异位病灶的生长，有利于子宫内膜异位症的深入研究。
目的：探讨构建裸鼠皮下子宫内膜异位症荧光模型的方法。
方法：取裸鼠子宫内膜，采用增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染后，注射入6只裸鼠皮下(转染荧光组)，将未接受增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染的子宫内膜组织块注射到另6只裸鼠腹部皮下(对照组)。于注射后第 5，10，15，20，25，30天在体视荧光显微镜下观察皮下绿色荧光强度，记录荧光标记病灶的持续时间，同时行组织学检测两组异位病灶的情况。
结果与结论：成功构建5个内膜异位症活体荧光裸鼠模型及5个内膜异位症活体非荧光裸鼠模型，平均每只裸鼠形成二三个病灶。利用体视荧光显微镜可通过活体动物的皮肤直接观察到体内病灶生长和发展，荧光面积和强度随时间延长逐渐减弱，可持续观察4 周左右。对照组未检测到绿色荧光病灶。获取病灶组织经苏木精-伊红染色，可观察到典型的子宫内膜腺体和基质结构。结果可见这种改良的裸鼠荧光模型可以动态无损伤量化观察病灶生长和发展情况，有助于内膜异位症新药的开发及其发病机制的研究。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 子宫内膜异位症, 裸鼠, 增强型绿色荧光蛋白, 腺病毒, 转染, 皮下, 动物模型, 体视荧光显微镜, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: It is simple to fabricate an animal model of endometriosis by subcutaneous injection of green fluorescence labeled endometrium of nude mice. Meanwhile, in vitro ectopic lesions can be observed dynamically within a certain period, which contributes to the depth study of endometriosis.
OBJECTIVE: To explore the method to establish an animal model of subcutaneous endometriosis in nude mice.
METHODS: Enhanced green fluorescent protein adenovirus transfected endometrium of nude mice was injected subcutaneously into six nude mice (fluorescent group) and non-transfected endometrium was injected into another six nude mice (control group). Green fluorescence intensity, duration of fluorescence labeled lesions, and histological changes of ectopic lesions in vivo were detected under stereological fluorescence microscope at 5, 10, 15, 20, 25, 30 days after injection.
RESULTS AND CONCLUSION: Five living fluorescence mouse models of endometriosis were induced successfully in the fluorescent group and another five living non-fluorescent nude mouse models of endometriosis were also prepared in the control group. There were 2-3 lesions per nude mouse. Development of ectopic lesions in the mice could be monitored under the stereological fluorescence microscope. The fluorescent area and intensity were decreased with time, which lasted for about 4 weeks. Fluorescence labeled lesions were invisible in the control group. Hematoxylin-eosin staining showed the typical endometrial glands and stroma structure. These findings indicate that this modified nude mouse model can enable the dynamic and quantitative observation of lesion growth and development without injury and contribute to the development of new drugs for endometriosis and the underlying mechanism of endometriosis．

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, endometriosis, nude mice, green fluorescent protein, adenovirus, transfection, subcutaneously, animal models, stereological fluorescence microscope, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

袁华，龚健，王嘉圆，黄伟. 建立裸鼠皮下荧光子宫内膜异位症模型[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.013.

Yuan Hua, Gong Jian, Wang Jia-yuan, Huang Wei . Establishing a nude mouse model of green fluorescence endometriosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.013.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年6月至2011年3月在无锡市第三人民医院干细胞实验室及动物实验室完成。
材料：
实验动物：清洁级雌性裸鼠18只，6-8周龄，体质量17-20 g，由中国科学院上海生命科学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

建立裸鼠皮下绿色荧光子宫内膜异位症模型所需主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
动物分组：将18只雌性裸鼠随机分成3组，第1组6只接受增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染的裸鼠子宫内膜的种植(简称为转染荧光组)，第2组6只接受裸鼠子宫内膜的移植作为对照组，第3组6只作为供体用于取子宫内膜。
子宫内膜标本处理：4%水合氯醛以 0.01 mL/g对裸鼠行腹腔注射麻醉，将其仰卧固定于操作板上，腹部乙醇消毒，自腹中线脐下方做一长约 2 cm的切口，进入腹腔取出供体小鼠子宫，小心剥去子宫肌层，分离出子宫内膜，立即用无菌PBS在培养皿上漂洗数次，眼科剪剪成1 mm3左右大小组织粒置入5 mL离心管，500 r/min，离心5 min后弃上清液，将底层内膜组织块置于24孔板的孔内，加入DMEM/F12培养液，培养液中含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，10 nmol/L 17β-雌二醇、整合了增强型绿色荧光蛋白的复制缺陷腺病毒颗粒，在37 ℃，体积分数为5%CO2环境下感染16 h后将子宫内膜组织收集，用含体积分数为2%胎牛血清的PBS洗3遍后置于300 μL含体积分数为2%胎牛血清的PBS中。将组织块用胰酶消化后进行流式细胞仪检测其转染率及凋亡率。以上手术过程均为无菌操作。
裸鼠荧光子宫内膜异位症模型制作与观察：将转染16 h裸鼠内膜组织块收集于一1.5 mL Ep管中，加入DMEM/F12培养基，将1 mm3大小的组织块5片注射到转染荧光组裸鼠腹部皮下，将没有接受增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染的子宫内膜组织块注射到对照组裸鼠腹部皮下，建立对照组裸鼠模型，种植后每5 d肌肉注射苯甲酸雌二醇2 mg/kg，于裸鼠注射后第 5，10，15，20，25，30天进行体视荧光显微镜观察。当病灶体外荧光完全不能探测到时，颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖动物获取病灶进行病理组织学苏木精-伊红染色。
主要观察指标：免疫荧光检测法比较两组动物病灶荧光信号、持续时间及两组异位病灶的大体形态，组织学表现。

讨论

子宫内膜异位症是雌激素依赖的妇科常见病，在育龄妇女中发病率高达10%-15%，是造成妇女炎症，疼痛及不孕的主要原因，严重影响着孕龄妇女的生活质量，其发病率较高但病因仍未完全阐明。为深入研究内膜异位症，各国学者已成功构建各种内膜异位症的动物模型，尤其是啮齿类动物模型[1-3]。但传统的动物模型常需阶段性的解剖动物获取病灶进行研究，因而难以无创而连续的评价药物对内膜异位病灶的影响。针对这一不足，有学者应用磁共振成像及核素显像等影像学等手段对病灶部位进行检测[4-5]，还有学者利用绿色荧光蛋白技术，构建出可无创观察的改良内异症动物模型[6-7]。

绿色荧光蛋白是一种在海洋生物水母中发现的，能在多种生物体内表达并发出明亮绿色荧光的蛋白质。绿色荧光蛋白作为一种新型的报告基因，能在活细胞中直观地观察其表达，性质十分稳定。将其作为细胞的标记物，具有检测方便、表达稳定、无毒害性和不影响细胞功能等优点。不需要做任何预处理就可以用荧光显微镜或流式细胞仪直接检测到荧光，对活的细胞、组织、器官进行观察，这是其他任何报告基因无法比拟的[8-9]，绿色荧光蛋白不像半乳糖苷酶及荧光素酶需要添加特殊底物或辅助因子，又具有动态观察的特点，已作为肿瘤细胞在免疫缺陷鼠体内生长并且具有能够无损伤观察的荧光标志[10-11]。

Hirata等[12]将切除卵巢的“绿色荧光转基因小鼠”的子宫内膜碎片注射入切除卵巢的同种异体的野生型小鼠的腹盆腔内。2周后通过肉眼或荧光显微镜观察盆腔内病灶的发展并测量病灶的质量，结果相对于传统的肉眼检测，利用荧光显像，子宫内膜异位病灶更容易被识别，并从组织学角度来说，取自绿色荧光小鼠的子宫内膜病灶在荧光显微镜下，较对照组更容易与周围的宿主组织相鉴别。

Fortin等[13]以绿色荧光蛋白腺病毒感染人子宫内膜组织，流式细胞仪测得绿色荧光蛋白感染率为15%-40%，腺病毒颗粒有很强的CMV启动子，将其作为载体标记子宫内膜组织产生的病毒滴度高，转染效率高，表达较稳定，其DNA不整合到宿主基因。感染的子宫内膜细胞形态、增殖能力和表面标志不受影响。

根据Fortin等[13]的发现，内膜异位病灶的质量与检测到的荧光强度高度相关，内膜异位症病灶大小可作为一个较敏感的指标，用以评价病情的发展以及治疗后病症的消退。故可通过电脑系统检测荧光的强度达到快速定量分析药物对内膜异位症疗效的目的。

实验将裸鼠子宫内膜与编码绿色荧光蛋白的腺病毒孵育，流式细胞仪测得腺病毒可转染20%-50%的内膜细胞。将绿色荧光蛋白转染的子宫内膜小片段注射入同周龄同系裸鼠的皮下，移植1周左右转染绿色荧光蛋白的裸鼠异位内膜在荧光体视镜下经蓝光激发出绿色荧光，明显区别于周围不表达绿色荧光蛋白的组织，故可以更加灵敏的检测并定位内膜异位症病灶，这比仅凭肉眼进行分辨取材要准确得多。同时通过皮肤可以无创而动态监测异位病灶的形成和发展。结果显示病灶荧光面积和强度随种植时间延长逐渐减弱，于裸鼠移植3周后，内膜异位病灶开始有萎缩趋势，组织荧光逐渐减弱，这提示在移植后二三周内通过活体动物的皮肤反复观察子宫内膜异位病灶发展是可行的。

既往啮齿类动物模型，多选择剖腹行腹腔内种植建模[14]，实验选择裸鼠皮下注射建模，是因为注射法与种植法相比，前者具有小鼠无需开皮，内膜片段小且量多，成模率高的优点。此外裸鼠皮下模型的病灶较表浅，增强型绿色荧光蛋白发出的光不易被组织吸收，而腹腔种植虽然更能体现移植物在宿主体内的自然生长过程，更好地体现腹腔内环境的变化，但增强型绿色荧光蛋白发出的光可被组织大量吸收，通过皮肤观察到腹腔种植的病灶荧光明显减弱，故相对于腹腔种植模型而言，皮下种植模型更适于在体视荧光显微镜下无创动态观察病灶的生长、发展，即异位病灶的量化研究[15]。

实验中的两组裸鼠异位病灶的形态学表现与人腹膜的子宫内膜异位病灶很相似，同时组织学观察显示，啮齿类具有典型的子宫内膜腺体和基质结构，亦与人子宫内膜相似，这提示啮齿类内膜异位症模型研究人类子宫内膜异位症的意义所在。同时鼠类子宫内膜较人子宫内膜更容易获得，这避免了需获取人子宫内膜而不可避免造成的一系列伦理问题。

总之，实验构建裸鼠皮下绿色荧光内膜异位症模型，建模操作简便，成模率较高。建立此动物模型旨在能动态无损伤量化观察异位病灶的生长情况，可为子宫内膜异位症的发病机制及治疗方面的深入研究提供动物实验基础，如精确的病灶定位，监测病灶活力, 动态观察同一动物不同时间点的病灶的消长, 对药物反应有更精确的判断。这种改良的非侵袭性荧光裸鼠模型有望用于人子宫内膜异位症的发病机制及治疗内膜异位症新药临床前疗效的研究

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