犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1808

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4637-4643.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1808

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犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用

詹小舒，罗惠娜，罗冬章，陈胜锋，王丙云，白银山，陈志胜，刘璨颖，计慧琴

佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省佛山市 528231

修回日期:2019-03-14 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 王丙云，博士，教授，佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省佛山市 528231；陈胜锋，博士，副教授，佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省佛山市 528231
作者简介:詹小舒，女，1993年生，广东省饶平县人，汉族，2016年佛山科学技术学院毕业，主要从事动物干细胞基本特性和临床应用研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2017A030313171)，项目负责人：王丙云；广东省自然科学基金(2018A030313893)，项目负责人：陈胜锋；广东省教育厅预防兽医学重点实验室项目(2014KTSPT037)，项目参与人：王丙云，陈胜锋

Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on proliferation, migration and apoptosis of vascular endothelial cells

Zhan Xiaoshu, Luo Huina, Luo Dongzhang, Chen Shengfeng, Wang Bingyun, Bai Yinshan, Chen Zhisheng, Liu Canying, Ji Huiqin

School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China

Revised:2019-03-14 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Wang Bingyun, MD, Professor, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China；Chen Shengfeng, MD, Associate professor, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China
About author:Zhan Xiaoshu, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313171 (to WBY) and 2018A030313893 (to CSF); a grant from the Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Guangdong Provincial Department of Education, No. 2014KTSPT037 (to WBY and CSF [project participants])

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：活细胞分泌的具有生物活性的胞外囊泡，大小在30-200 nm之间，其中包含了丰富的生物活性物质如miRNA、mRNA、蛋白质等，因此参与多项生命活动的调控，在信息传递、疾病诊断及治疗方面发挥较大作用。
血管内皮细胞：通常指衬于血管内表面的单层扁平上皮细胞，其在血管再生过程中可迁移出血管内表面并进行大量增殖，招募成纤维细胞，使胞外基质堆积诱导新血管形成。

摘要
背景：以往研究发现，脐带间充质干细胞来源外泌体具有促进犬皮肤伤口愈合的作用，但犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管再生的作用机制尚未明确。
目的：探讨犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移及凋亡能力的影响及其机制。
方法：采用低温超高速离心法分离犬脐带间充质干细胞来源外泌体；采用血管内皮机械剥离和Ⅰ型胶原酶消化法分离犬血管内皮细胞并通过表面标记和分化特性对其进行鉴定。使用CCK-8法、划痕实验和Annexin V流式检测法测定犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响，高通量测序检测犬脐带间充质干细胞来源外泌体中miRNA的表达并探讨其可能性机制。
结果与结论：实验成功建立了犬动脉血管内皮细胞的分离与培养方法，其形态呈铺路石状，阳性表达CD34和CD31表面蛋白；犬脐带间充质干细胞来源外泌体能显著促进血管内皮细胞增殖与迁移，抑制内皮细胞凋亡，而其作用机制可能是其中富含丰富的miRNA。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8205-3338(詹小舒)

关键词: 脐带间充质干细胞, 外泌体, 血管内皮细胞, 细胞增殖, 细胞迁移, 细胞凋亡, 高通量测序, miRNA, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have found that wound healing in dogs can be expedited by umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes (UC-MSC-Exo). Angiogenesis is an important process of wound healing, but the mechanism of UC-MSC-Exo on angiogenesis is yet unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of UC-MSC-Exo on the proliferation, migration and apoptosis of vascular endothelial cells.
METHODS: Canine UC-MSC-Exo was isolated by low temperature ultracentrifugation. Canine vascular endothelial cells were isolated by mechanical exfoliation, digested by collagenase type I, and then identified by cell surface markers and differentiation characteristics. The effects of canine UC-MSC-Exo on proliferation, migration and apoptosis of vascular endothelial cells were determined by cell counting kit-8 method, wound healing test and Annexin V flow cytometry assay. High-throughput sequencing was used to detect the expression of miRNA in canine UC-MSC-Exo and to explore its possible mechanism.
RESULTS AND CONCLUSION: This study successfully established a method for isolation and culture of canine arterial endothelial cells with the “paving stone” morphology and positive expression of CD34 and CD31 surface proteins. The canine UC-MSC-Exo could significantly promote the proliferation and migration of vascular endothelial cells and inhibit cell apoptosis. And the mechanism might be related to the miRNAs enriched.

Key words: umbilical cord mesenchymal stem cells, exosomes, vascular endothelial cells, cell proliferation, cell migration, apoptosis, high-throughput sequencing, miRNA, Natural Science Foundation of Guangdong Province

中图分类号:

詹小舒, 罗惠娜, 罗冬章, 陈胜锋, 王丙云, 白银山, 陈志胜, 刘璨颖, 计慧琴. 犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4637-4643.

Zhan Xiaoshu, Luo Huina, Luo Dongzhang, Chen Shengfeng, Wang Bingyun, Bai Yinshan, Chen Zhisheng, Liu Canying, Ji Huiqin. Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on proliferation, migration and apoptosis of vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4637-4643.

图/表（结果） 3

2.1 犬血管内皮细胞的原代培养和鉴定结果 倒置相差显微镜下连续观察发现，原代培养24 h后细胞贴壁生长，呈纺锤形或椭圆形；72 h后单个贴壁细胞开始增殖并形成克隆；随后细胞增殖迅速，克隆逐渐增大，呈现“铺路石”样集落。挑取典型铺路石样集落进行纯化和扩大培养，2 d时可见短梭形细胞相互连接呈管腔样生长，长满后再传代，细胞形态及生长状况稳定，增殖能力强，见图1。免疫荧光鉴定结果显示，该细胞阳性表达CD31和CD34，并且具有成脂和成骨分化能力，见图2，3，与已报道血管内皮细胞特性相一致。

2.2 犬脐带间充质干细胞外泌体分离和鉴定结果 透射电镜下观察，分离和提纯的犬脐带间充质干细胞外泌体呈茶杯托状，见图4A。NTA粒径检测显示，其大小为30- 200 nm，主要集中在84 nm。Western blot结果显示，犬脐带间充质干细胞外泌体表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81，见图4B。以上特性表明，分离获得的囊泡体即为外泌体。

2.3 犬脐带间充质干细胞和脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞增殖的影响 共培养实验结果显示，犬脐带间充质干细胞及其细胞培养上清液均能显著促进血管内皮细胞增殖，证明脐带间充质干细胞可能是通过分泌外泌体来促进血管内皮细胞增殖。单独取外泌体对血管内皮细胞进行培养，发现在2.5-20 mg/L范围内，随着质量浓度的增高，外泌体对血管内皮细胞增殖的促进作用增强，见表1，图5，6。

2.4 犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞迁移的影响 由图7和表2可见，当划痕0 h时, 划痕宽度基本保持一致, 培养12 h后均可见两组细胞开始向划痕迁移，但迁移速度差异并不明显；而培养至24 h后，两组划痕宽度均变窄，但外泌体组迁移率(67.73%)显著高于对照组(32.17%)。

2.5 犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞凋亡的影响 由图8可见，喜树碱能有效诱导犬血管内皮细胞凋亡，且外泌体组细胞凋亡率[(2.67±0.37)%]显著低于对照组[(4.17±0.35)%]，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 犬脐带间充质干细胞外泌体测序结果 数据过滤后，将clean tag和已知miRNA数据库进行比对，并使用TPM对数据进行标准化。根据结果，列出在犬脐带间充质干细胞外泌体中表达量最高的5个已知miRNA，见表3。

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引言

间充质干细胞是来源于中胚层的多潜能干细胞，其存在于机体各个组织器官中，具有成脂肪、成骨、成软骨和成神经等多向分化的能力^[1]。间充质干细胞在体内能归巢至损伤部位，并通过分化为受损细胞和旁分泌途径促进组织器官损伤修复^[2-3]。外泌体作为干细胞旁分泌的一种重要物质，是活细胞向外界释放的微小囊泡，大小在30-200 nm，囊泡内包含蛋白质、微小RNA、DNA等多种生物活性分子，其在促进软骨再生、减轻缺血再灌注损伤和肝肾损伤等方面均有显著作用^[4-8]。

关于间充质干细胞及外泌体作用的研究多来源于人类、小鼠、大鼠等，鲜有报道犬来源间充质干细胞及外泌体的研究^[9-11]，而犬是最受人类欢迎的伴侣宠物，其健康问题备受人们重视。各种原因导致的犬皮肤创伤、神经损伤、肾衰、肝脏损伤和胰腺炎等发病率高，治疗效果不佳，而间充质干细胞在组织器官损伤修复方面具有独特和明显的效果。课题组前期实验证明，间充质干细胞及其外泌体能减轻伤口炎症，促进皮肤损伤修复，但其机制尚不清楚^[12]。有研究表明，间充质干细胞通过释放外泌体促进皮肤成纤维细胞的增殖和迁移从而促进伤口愈合^[13]，但创伤愈合需经过一系列复杂反应，除了成纤维细胞的增殖和迁移，血管的再生同样具有重要作用^[14]。间充质干细胞外泌体对血管生成是否有影响，其作用机制如何？这些问题仍需要进一步研究探索。该实验探讨犬脐带间充质干细胞来源外泌体对犬血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响，并对犬脐带间充质干细胞外泌体中的miRNA进行高通量测序，以探索其在血管生成过程中的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年4至11月在佛山科学技术学院生命科学与工程学院动物生理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物与样品采集 犬血管内皮细胞取自车祸救治无效的中华田园犬，无菌获取犬主动脉于含5%双抗的PBS中保存，冰盒运送至佛山市干细胞工程中心进行原代分离培养。新鲜脐带组织取自刚生产的成年中华田园母犬，保存于含10%双抗的PBS中并立即在超净工作台上分离培养脐带间充质干细胞。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM高糖培养基、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素(Hyclone，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)；胰酶-EDTA(Gibco，美国)；Transwell小室(0.4 μm，Corning，美国)；CD31抗体(BIOSS，中国)；CD34抗体(Abcam，美国)；羊抗鼠二抗-FITC(Beyotime，美国)；超净工作台(苏州苏净，中国)；普通倒置显微镜(Nikon，日本)；荧光显微镜(Olympus，日本)；超速低温离心机(Beckman，美国)；扫描电镜(HITACHI，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 犬脐带间充质干细胞分离培养和鉴定 新鲜犬脐带组织使用Ⅰ型胶原酶法进行消化，原代培养至贴壁80%时进行传代，取第3代细胞进行成脂成骨分化鉴定及免疫荧光鉴定细胞表面标记。详细方法见作者以往发表文章^[15]。

1.4.2 血管内皮细胞原代培养和鉴定 取车祸救治无效犬的主动脉，用含10%双抗的PBS清净，转移至装有3 mL PBS的玻璃培养皿中，使用解剖剪将血管剪开并使内壁朝上。用细胞刮轻轻刮取内壁层细胞，加入PBS制备细胞悬液，离心后，用1 g/LⅠ型胶原酶消化细胞40 min，200目筛网过滤，收集滤液，1 200 r/min离心5 min，弃上清，沉淀使用ECM完全培养基重悬后，以1×10⁶ L^-1的细胞浓度接种至培养皿中，待细胞长出克隆，挑取短梭形或铺路石状细胞克隆进行扩大培养。选取第4代细胞进行成脂、成骨分化鉴定，并通过免疫荧光法检测CD31和CD34表面蛋白表达。

1.4.3 外泌体的分离和鉴定 参照作者以往发表文章所述^[15]，使用低温超高速离心法分离外泌体，并使用透射电镜观察外泌体形态，NTA检测细胞粒径，Western Blot鉴定外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81表达。

1.4.4 犬脐带间充质干细胞与血管内皮细胞共培养实验 取第3代犬血管内皮细胞消化后用ECM完全培养基重悬，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，每孔500 μL接种至24孔板中，然后按照以下分组分别加培养液：①对照组：加入200 μL新鲜犬脐带间充质干细胞完全培养基；②共培养组：取第3代犬脐带间充质干细胞消化后重悬计数至1×10⁷ L^-1，每孔200 μL加入transwell小室中，下室为500 μL用ECM完全培养基重悬的血管内皮细胞悬液；③条件培养基组：加入200 μL犬脐带间充质干细胞培养上清液；④去除外泌体条件培养基组：加入200 μL去除外泌体后的犬脐带间充质干细胞培养上清液，以上每组3个重复。

以上各组细胞于37 ℃培养箱中共培养3 d后取出消化，重悬细胞后每孔100 μL接种至96孔板中，置于37 ℃培养箱中贴壁2 h后取出，每孔加入10 μL CCK-8溶液温育1 h，检测450 nm处吸光度值。

1.4.5 不同浓度犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞增殖的影响 取第3代犬血管内皮细胞消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，每孔100 μL接种至96孔板中，培养4 h或过夜至细胞贴壁；弃原ECM培养液，分别加入含20，10，5，2.5 mg/L犬脐带间充质干细胞外泌体的ECM完全培养液，加入含等量生理盐水的ECM完全培养液作为对照组，每孔100 μL，每组10孔，37 ℃培养箱中培养3 d取出，每孔加入10 μL CCK-8溶液温育1 h，检测450 nm处吸光度值。

1.4.6 犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞迁移的影响 取第4代犬血管内皮细胞，胰酶消化后用ECM完全培养基重悬，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1；将划痕插件(Corning Culture Insert)置于24孔板孔正中间，然后将细胞悬液接种至插件两个孔之中，置于37 ℃培养箱中培养至细胞长满，用无菌镊子移出插件，PBS清洗2次，外泌体组加含20 mg/L犬脐带间充质干细胞外泌体的ECM基础培养液，对照组加含等量生理盐水的ECM基础培养液，每组3孔。加液完毕，于0，12，24 h时分别拍照记录细胞迁移情况。图片使用Image J进行对比分析，测出细胞迁移面积，计算迁移率。

1.4.7 犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞凋亡的影响 取第4代犬血管内皮细胞，胰酶消化后接种至24孔板中，待细胞长满至70%-80%时，对照组和外泌体组将培养液更换成含100 mmol/L喜树碱的PBS，诱导凋亡4 h，正常组则换成等量PBS作用4 h。4 h后外泌体组更换成含20 mg/L犬脐带间充质干细胞外泌体的ECM完全培养液，对照组和正常组则更换成含等量生理盐水的ECM完全培养液，每组3孔，继续培养48 h后胰酶消化，按照美国BD公司的Annexin V凋亡试剂盒使用说明采用流式细胞技术检测凋亡率：使用预冷PBS将消化后细胞清洗2次，然后用1×Buffer将每孔细胞细胞重悬至浓度为1×10⁹ L^-1，每孔取100 μL细胞悬液转移至5 mL流式细胞管中，分别加入5 μL Annexin V和5 μL PI溶液，轻轻涡旋震荡后于室温下避光孵育15 min，最后加入400 μL 1×Buffer，流式细胞仪检测。

1.4.8 犬脐带间充质干细胞外泌体miRNA测序 分离得到犬脐带间充质干细胞外泌体送至深圳华大基因股份有限公司，由BGISEQ-500测序技术进行测序：总RNA使用PAGE电泳切胶分离得到18-30 nt的RNA，分别进行3'接头和5'接头连接；以RT引物进行反转录延伸，合成一链cDNA；使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3'接头和5'接头的cDNA；使用PAGE电泳分离100-120 bp范围PCR产物，有效去除了引物二聚体等副产物，最后上机测序。

1.5 主要观察指标 ①犬血管内皮细胞的培养和鉴定结果；②犬脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定结果；③犬脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞增殖速度、迁移速度和凋亡率的影响。

1.6 统计学分析 实验数据使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，使用Graphpad Prism 5.0软件进行绘图。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脐带间充质干细胞来源于产后废弃组织，来源丰富，且无伦理道德争议。与胎盘、羊膜等其他产后废弃组织来源的间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞具有分离方法简易、产量高、增殖快的特点，因而备受青睐。该研究在前人基础上对脐带间充质干细胞原代分离培养方法进行了改良，采用Ⅰ型胶原酶长时间消化法可以高效获得大量的脐带间充质干细胞。

外泌体作为干细胞旁分泌作用的主要生物成分，由于其不具备分裂和分化能力，降低了干细胞在体内成瘤的可能性^[16-1⁸^]，与间充质干细胞移植疗法相比，具有相对稳定性。外泌体通过其粒径大小与间充质干细胞分泌的其他囊泡进行区分，直径为30-200 nm，密度为1.10-1.20 g/mL^[1⁹^]。该研究采用目前较常用的低温超高速离心法分离获得较纯的外泌体，电镜下呈杯托状，大小多集中在90 nm，并且能表达CD9、CD63和CD81标志性表面蛋白，符合外泌体的生物学特性和鉴定标准，说明成功分离获得了犬脐带间充质干细胞外泌体。

血管内皮细胞是覆盖在血管内壁的单层扁平细胞，呈多边形或短梭形，细胞之间紧密连接，有效地将血管壁及血液分隔开来并在两者之间进行信息传递^[²⁰^]。血管的再生依赖于血管内皮细胞的增殖与迁移，因此原代分离培养血管内皮细胞对于血管再生及其作用机制的研究极为重要^[2¹^]。该研究使用机械法刮取血管内壁单层细胞，并扩大培养单个细胞，形成了“铺路石状”克隆，获得的原代细胞表达CD34和CD31表面抗原，并能进行成脂和成骨分化。这些结果表明，实验成功分离获得了血管内皮细胞。

Timmers等^[2²^]在小鼠心肌缺血再灌注损伤的猪和小鼠模型中，静脉注射间充质干细胞条件培养基，发现能使心肌梗死面积分别降低60%和50%，进一步确认起作用的活性介质的大小在50-200 nm范围内。研究发现间充质干细胞条件培养基能减少小鼠心肌梗死面积，而去除外泌体的条件培养基则无此功能^[2³^]。以上研究均证明，间充质干细胞主要通过细胞培养的上清液发挥作用，其主要成分是外泌体。该研究将脐带间充质干细胞与血管内皮细胞共培养时，血管内皮细胞增殖能力较对照组显著提高，使用含有犬脐带间充质干细胞培养上清液来培养血管内皮细胞时发现其亦能显著促进血管内皮细胞增殖，但促进作用较共培养组弱。将犬脐带间充质干细胞培养上清液中的外泌体去除时，则丧失了对血管内皮细胞增殖的促进作用。另外，用不同质量浓度的脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞进行培养，发现其增殖能力与外泌体的质量浓度呈正相关。这些实验提示，脐带间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖主要通过其分泌的外泌体发挥作用。

间充质干细胞来源外泌体在皮肤损伤模型中的研究已被广泛开展，作用效果也非常一致，其能促进胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，促进皮肤创伤的再上皮化，防止肌纤维形成^[2⁴^]。在小鼠皮肤缺损模型中，脐带间充质干细胞来源外泌体能减少肌成纤维细胞积累和瘢痕形成^[2⁵^]。大鼠皮肤烧伤模型中，人脐带间充质干细胞来源外泌体能明显加速伤口再上皮化，其中CK19、PCNA和Ⅰ型胶原在体内表达增加，体外实验也表明外泌体能促进皮肤细胞增殖和抑制凋亡^[13]。该研究证明了脐带间充质干细胞外泌体对血管内皮细胞的增殖、迁移同样具有促进作用，并抑制其凋亡，提示脐带间充质干细胞外泌体可通过促进血管的修复，从而促进皮肤以及其他器官组织的损伤修复。

高通量测序结果显示犬脐带间充质干细胞外泌体中富含249种已知miRNA及150种未知miRNA，作者列出其中含量最高的5个miRNA，发现其均与细胞增殖、迁移和凋亡等生理活动相关。①miR-199：miR-199家族在细胞凋亡及增殖中发挥潜在作用，其中miR-199可通过下调MAP3K5的表达抑制人髓核细胞的凋亡^[2⁶^]；miR-199a-5p可以防止应激引起的肝细胞凋亡，保护肝脏免受损伤^[2⁷^]；miR-199a-3p的表达促进内皮细胞以及乳腺癌细胞的增殖和存活^[2⁸^]；②miR-21：许多证据表明，富含miR-21的胞外囊泡在促进血管再生中具有显著作用^[2⁹^-³⁰^]，而过量表达miR-21的脐血间充质干细胞可促进严重肢体缺血中的新血管形成，体外实验表明其具有促进细胞增殖、迁移和血管生成的作用^[3¹^]；③let-7：目前为止，共发现13个let-7家族成员^[3²^]，对比测序结果发现其均在犬脐带间充质干细胞外泌体中高表达。Let-7家族与心血管疾病的发展息息相关^[3³^]。在缺氧损伤哺乳动物模型中，let-7a和let-7c表达下调可促进心肌细胞发生去分化而增强细胞的增殖能力，从而减少缺氧造成的细胞死亡^[3⁴^]；④miR-23a：近期研究表明，miR-23 参与到了细胞发育的各个阶段中，包括细胞增殖、凋亡和变异等^[3⁵^]，郑永法^[3⁶^]发现外泌体携带含量升高的miR-23a至人脐带血管内皮细胞，能抑制其表达PTEN，进而促进人脐带血管内皮细胞增殖及迁移。

总之，犬脐带间充质干细胞外泌体能在体外促进犬血管内皮细胞增殖、迁移并抑制凋亡，而这种作用很可能是由于其中含有丰富的miRNA引起的，但脐带间充质干细胞外泌体中还含有mRNA、IncRNA及蛋白质等多种生物活性分子，具体由哪一种或者由哪几种活性物质，以何种方式起作用目前还研究不透彻，还需要做进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

犬脐带间充质干细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用

Effects of exosomes derived from canine umbilical cord mesenchymal stem cells on proliferation, migration and apoptosis of vascular endothelial cells

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