Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子体外促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞的定向分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1803

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Scleraxis：是肌腱/韧带细胞特异性的表达分子，不仅参与肌腱/韧带祖细胞的聚集及分化，还影响肌腱/韧带细胞外基质的形成，在肌腱/韧带的发生发育和损伤修复中扮演着重要的角色。
碱性成纤维细胞生长因子：是成纤维细胞生长因子家族中的一员，不仅能够加速细胞增殖、促进细胞有丝分裂，还能够促进新血管形成，目前已经广泛应用于各种损伤组织修复的研究。

摘要
背景：人羊膜间充质干细胞具有多向分化能力，相关研究表明Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子均能够促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞定向分化。
目的：探讨Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化的效果。
方法：经遵义医学院附属医院伦理委员会批准，术前签署知情同意书，取足月产胎盘羊膜组织，两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态；苏木精-伊红染色观察新鲜人羊膜结构；取第3代人羊膜间充质干细胞分4组进行培养：①单纯人羊膜间充质干细胞培养组；②人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染组；③人羊膜间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导组；④人羊膜间充质干细胞经Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导组。细胞培养3 d开始采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力；细胞培养14 d后，实时荧光定量PCR评价各组细胞向人韧带成纤维细胞定向分化的效果。
结果与结论：①第3代人羊膜间充质干细胞呈长梭形、涡旋状贴壁生长；②新鲜人羊膜呈明显的分层结构，共分为5层：上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层；③人羊膜间充质干细胞经Scleraxis基因慢病毒感染24 h后表达绿色荧光，荧光表达量较强且稳定；经过碱性成纤维细胞生长因子诱导后14 d的形态近似于人韧带成纤维细胞；④CCK-8实验结果显示：4组细胞均呈S型生长，其中Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组较单纯培养组增殖能力强(P < 0.05)，但这3组间的增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤实时荧光定量PCR显示：Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组韧带相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C、TNMD的mRNA表达量均高于单纯培养组(P < 0.05)，联合诱导组上述韧带相关基因的mRNA表达量高于Scleraxis基因慢病毒感染组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组(P < 0.05)；⑥结果表明，Scleraxis基因和碱性成纤维细胞生长因子联合促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化，为韧带损伤修复治疗提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3795-9704(桑鹏)

关键词: 人羊膜间充质干细胞, Scleraxis, 碱性成纤维细胞生长因子, 定向分化, 人韧带成纤维细胞, 慢病毒感染, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic mesenchymal stem cells have multi-directional differentiation ability. Studies have shown that both Scleraxis and basic fibroblast growth factor can promote the differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into human ligament fibroblasts.
OBJECTIVE: To explore whether Scleraxis combined with basic fibroblast growth factor can promote the differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into human ligament fibroblasts and to observe their differentiation effects.
METHODS: The study protocol was approved by the ethic committee of the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, and written informed consent was obtained from each puerpera. The amniotic membrane from the full-term placenta was separated, and human amniotic mesenchymal stem cells were isolated by a two-step enzyme digestion. The morphology of the cells was observed by inverted phase contrast microscope. The structure of fresh human amniotic membrane was observed by hematoxylin-eosin staining. The third generation of human amniotic mesenchymal stem cells were cultured in four groups: (1) normally cultured human amnion mesenchymal stem cell culture (simple culture group); (2) human amniotic mesenchymal stem cells infected with Scleraxis gene lentivirus (Scleraxis group); (3) human amniotic mesenchymal stem cells induced by basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor group); (4) human amniotic mesenchymal stem cells induced by Scleraxis and basic fibroblast growth factor (combined induction group). The proliferation ability of the cells in each group was detected by cell counting kit-8 method at 3 days of cell culture. Real-time quantitative PCR was performed to evaluate the cell differentiation into human ligament fibroblasts in each group at 14 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the inverted phase contrast microscope, the third-generation human amniotic mesenchymal stem cells were long-fusiform and exhibited vortex-like adherent growth. (2) Under the inverted phase contrast microscope, the fresh human amniotic membrane had an obvious layered structure, which was divided into five layers: epithelial layer, basal layer, dense layer, fibroblast layer and sponge layer. (3) Human amniotic mesenchymal stem cells strongly and stably expressed green fluorescence at 24 hours after infection with Scleraxis gene lentivirus. The morphology of human amniotic mesenchymal stem cells induced by basic fibroblast growth factor was changed, and after 14 days of induction its morphology was similar to that of human ligament fibroblasts. (4) The results of cell counting kit-8 showed that the four groups of cells showed a S-type growth. The Scleraxis group, basic fibroblast growth factor group, combined induction group had stronger proliferation ability than the simple culture group, but there was no significant difference in the proliferative capacity between the three groups. (5) Real-time fluorescent quantitative PCR showed that the mRNA expression levels of ligament-related genes type I collagen, type III collagen, Fibronectin, Tenascin-C and TNMD in the Scleraxis group, basic fibroblast growth factor group, and combined induction group were significantly higher than those in the simple culture group (P < 0.05). The mRNA expression levels of ligament-related genes in the combined induction group were significantly higher than those in the Slckleris group and basic fibroblast growth factor group (P < 0.05). These results indicate that the combination of Scleraxis gene and basic fibroblast growth factor can promote the differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into human ligament fibroblasts, providing a new idea for the treatment of ligament injury.

Key words: human amniotic mesenchymal stem cells, Scleraxis, basic fibroblast growth factor, directed differentiation, human ligament fibroblasts, lentivirus infection, tissue engineering

中图分类号:

桑鹏，刘毅. Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子体外促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞的定向分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4644-4650.

Sang Peng, Liu Yi. Scleraxis combined with basic fibroblast growth factor promotes the differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into human ligament fibroblasts in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4644-4650.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态 倒置相差显微镜显示：40倍镜下第3代人羊膜间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，可见漩涡形成，见图1A；100倍镜下可见细胞接触紧密，类似于三角形或长菱形，见图1B；200倍镜下观察细胞长梭状明显，细胞间相互黏附，见图1C。

2.2 倒置显微镜下羊膜的结构 人新鲜羊膜经过切片、苏木精-伊红染色后在倒置显微镜下观察呈现明显的分层结构，一共分为5层，分别为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层，各层均比较明显且很完整，见图2。

2.3 慢病毒包装载体的构建、包装与滴度检测结果 病毒梯度法感染293T细胞96 h后，荧光显微镜观察目的荧光表达量：0.03 μL/孔表达量约50%，0.10 μL/孔表达量约80%，0.30 μL/孔表达量约95%，见图3。

2.4 病毒感染人羊膜间充质干细胞 6.0 μL病毒原液感染人羊膜间充质干细胞96 h后荧光显示感染率良好，见图4。

2.5 碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞 经过碱性成纤维细胞生长因子诱导的人羊膜间充质干细胞形态发生改变，14 d时最明显，细胞呈涡旋状，形似人韧带成纤维细胞，见图5。

2.6 CCK-8检测人羊膜间充质干细胞活性 各组细胞的增殖能力均呈S型生长，其中Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组较对照组增殖能力强(P < 0.05)，但这3组间的增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6，说明Scleraxis、碱性成纤维细胞生长因子不仅能够促进羊膜间充质干细胞分化，而且还能够促进其增殖。

2.7 实时荧光定量PCR检测慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的表达及韧带成纤维细胞相关基因的表达 Scleraxis基因慢病毒能够成功感染人羊膜间充质干细胞，感染后Scleraxis mRNA的表达量急剧升高，是未转染组的40倍左右，差异有显著性意义(P < 0.05)；Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组韧带成纤维细胞相关基因mRNA的表达量均高于单纯人羊膜间充质干细胞培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)，联合诱导组韧带相关基因的mRNA表达量高于Scleraxis基因慢病毒感染组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组韧带相关基因的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

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引言

前交叉韧带损伤或断裂是临床上最常见的疾病之一，由于前交叉韧带损伤后很难自行修复愈合，其治疗一直困扰着当今的临床医生^[1]。目前临床上常用的治疗手段是韧带重建，包括自体/异体人韧带、人工韧带等，但是都存在一定的缺陷和不足^[2-3]。近年来随着再生医学和组织工程技术的快速发展，通过使用各种生长因子来促进韧带损伤修复已经取得了不错的进展，例如使用转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子等来促进韧带损伤的修复^[4-5]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是体内广泛分布的细胞因子，其与肝素具有较好的亲和力，是成纤维生长因子家族中的一员^[6]。人类的碱性成纤维细胞生长因子基因定位于四号染色体，为单拷贝基因，长度在40 kb左右^[7]。碱性成纤维细胞生长因子具有促进有丝分裂和加速增殖的作用，目前广泛应用于组织工程修复，例如骨组织工程技术、软骨组织工程技术、腱-骨愈合等^[8-12]。碱性成纤维细胞生长因子能够促进人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞定向分化，为临床韧带损伤的修复提供了新的方向^[13]。

Scleraxis是bHLH家族中的成员之一，其作为肌腱/韧带细胞的特异性标志分子，不仅参与肌腱和韧带的发生和发育，还能够诱导干细胞向肌腱/韧带的定向分化^[14-17]。最近几年，随着分子生物学和转染技术的快速发展，利用慢病毒/腺病毒转染目的基因到靶细胞来治疗相关疾病已经取得了不错的效果。因此，通过病毒转染技术将Scleraxis基因导入干细胞从而促进干细胞向人韧带成纤维细胞分化来修复韧带损伤，有希望成为一种新的治疗方法。

人羊膜间充质干细胞来源广泛、获取简单、增殖能力较强、低免疫原性、具有多向分化潜能^[18-20]，现已经广泛应用于多个领域^[21-24]。课题组长期以来一直从事人羊膜间充质干细胞的体外分离培养和诱导分化研究，并且相关实验已经证明人羊膜间充质干细胞具有向韧带成纤维细胞分化的能力。此次实验拟用Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子来诱导人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞定向分化，并观察其分化效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年6月至2019年2月在遵义医科大学附属医院细胞工程实验室完成。

1.3 材料 实验所用的1个胎盘来自于遵义医科大学附属医院产科足月健康产妇，无其他基础疾病，术前均已签署知情同意书并同意参与该科学研究，符合遵义医科大学附属医院伦理委员会要求。

实验用主要试剂和仪器：DMEM/F12培养液(美国Gibco公司)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)；RNAiso plus、转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；CCK-8试剂盒(索莱宝试剂公司)；超净工作台(北京冠鹏净化设备公司)；冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；CO₂恒温箱(美国Thermo Scientific公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞的分离与培养 在无菌条件下将胎盘胎儿面羊膜剥离并在4 ℃条件下迅速转移至实验室，在超净台上用含青霉素/链霉素(青霉素1×10⁵ U/L、链霉素1×10⁵ U/L)的无菌PBS反复冲洗3次，将羊膜放在玻璃皿中用刀片反复清刮，剔除结缔组织并冲洗掉血渍。然后将羊膜用剪刀剪成大小约为1 mm×1 mm×1 mm的碎片，加入羊膜体积2倍的0.05%EDTA-胰蛋白酶在37 ℃恒温水浴摇床上连续消化2次，每次30 min，再用含双抗的PBS冲洗，加入与羊膜等体积的0.75 g/L Ⅱ型胶原酶于37 ℃恒温水浴摇床充分震荡消化50 min，直到肉眼观察到羊膜碎片完全消失，300目滤网过滤，收集细胞滤液，以1 700 r/min离心7 min，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清、青霉素1×10⁵ U/L、链霉素1×10⁵ U/L、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的L-DMEM/F12培养基重悬细胞，以(1.5-2.0)×10⁸ L^-1的浓度将细胞接种于75 cm²培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养，每3 d更换1次培养基，倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长情况、形态变化并拍照记录。

1.4.2 人羊膜间充质干细胞的传代 镜下观察细胞融合率为80%-90%时，加入0.125%胰酶置于孵箱中消化3 min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM/F12培养基终止消化，以1 500 r/min的转速离心6 min，弃上清液，加入LG-DMEM/ F12培养基吹打重悬细胞，进行细胞计数，细胞数(/mL)=(4个大格的总数/4)×10⁴。以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，人羊膜间充质干细胞传至第3代细胞种板进行相关实验。

1.4.3 苏木精-伊红染色观察羊膜结构 将取下的新鲜羊膜剪成大小均匀的块状置于培养皿中，然后加入40 g/L多聚甲醛固定，经过乙醇脱水、石蜡包埋并切片，切片的厚度约为4 μm，然后进行苏木精-伊红染色。

1.4.4 慢病毒包装载体的构建与包装 将pHBLVCMVIE- ZsGreen-Puro载体及含有酶切位点及3×Flag标签的Scleraxis多核苷酸序列(三博远志生物技术公司)分别经EcoRⅠ、 XbaⅠ酶切后纯化(40 μL体系：2 μL载体，1 μL EcoRⅠ，2 μL XbaⅠ，8 μL 10×buffer，27 μL H₂O；37 ℃作用2 h)，纯化后载体及目的片段用T₄连接酶连接(20 μL体系：2 μL酶切后片段，100-200 ng酶切后载体，2 μL ligase buffer，1 μL T₄ ligase，15 μL H₂O；16 ℃过夜)，使用大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后进行挑单克隆及质粒抽取，测序确定目的片段已转入质粒载体。当293T细胞(贴壁细胞培养法：使用含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养；当细胞融合率80%时进行0.125%胰酶消化并传代培养)汇合率约60%，参照Lipofectamine^TM2000转染说明书，将空质粒和pHBLVCMVIE-ZsGreen-Puro-3XFLAG-SCX质粒分别与pSPAX2、pMD2G质粒共转染入293T细胞。转染后48，72 h分别收集上清，4 ℃，20 000 r/min离心120 min，用无血清PBS溶解病毒沉淀后分装保存于-80 ℃冰箱。

1.4.5 实验分组 实验分4组：单纯人羊膜间充质干细胞培养组、Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、Scleraxis/碱性成纤维细胞生长因子联合诱导组。

1.4.6 慢病毒滴度测定及感染人羊膜间充质干细胞 以4×10⁴/孔的密度将293T细胞接种到96孔板，24 h后准备6个EP管，第1个EP管中加入10 μL病毒液，做3倍梯度稀释，共6个稀释度，将病毒稀释液加入培养基中至总体积为100 μL，24 h后加入DMEM/F12完全培养基100 μL，96 h后观察荧光表达情况，计算荧光细胞百分比在10%-30%的病毒滴度。滴度(TU/mL)=细胞数×荧光细胞百分比×感染复数(1)×病毒稀释倍数×10³。取第3代人羊膜间充质干细胞以3×10⁵/孔接种于6孔板，24 h后当汇合率接近50%-60%时，加入6.5 μL病毒浓缩液及1.2 μL聚凝胺(5 mg/L)，感染24 h后换液，感染48 h后将细胞传至10 cm培养皿，待细胞汇合度为60%时，以3.5×10^-3 mg/L的嘌呤霉素对感染细胞进行筛选，从而获得稳定过表达Scleraxis蛋白的人羊膜间充质干细胞。

1.4.7 碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞 将装有50 μg碱性成纤维细胞生长因子的塑料管以10⁴ r/min离心1 min后，转移于超净台内，用450 µL灭菌超纯水溶解后，加入含有1%BSA的无菌PBS定容至500 µL，稀释成10 g/L的储备液，分装后-20 ℃保存。使用时按照每100 mL培养液中加入10 µL储备液，使用终质量浓度为10 μg/L。将第3代人羊膜间充质干细胞以1.5×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板，用含碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基诱导，每3 d更换1次培养基。诱导后7，14，21 d，倒置显微镜下观察细胞的形态改变。

1.4.8 CCK-8检测细胞活性 诱导培养后3 d开始，各组细胞消化并制备成浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液，取100 μL加入96孔板，同时设置3个副孔，在96孔板的4边孔(共36孔)中加入100 μL PBS，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，加入10 μL CCK-8溶液，放置于培养箱内孵育1-4 h，酶标仪测定波长为450 nm处的吸光度值，每天测定1次，重复连续测定7 d，记录数据并绘制增殖曲线。

1.4.9 实时荧光定量PCR检测慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的表达及韧带成纤维细胞相关基因的表达 细胞诱导培养14 d后，PBS冲洗3遍，采用Trizol法提取各组细胞的RNA，用紫外分光光度计测定RNA的质量。用反转录试剂盒得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，见表1。以GAPDH为内参，通过2^-^??Ct法计算目标基因相对表达量。引物在NCBI基因库中对比后，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 主要观察指标 各组细胞的增殖能力及向人韧带成纤维细胞定向分化的效果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

前交叉韧带损伤或断裂是临床上较为常见的一种疾病，尽管有相关文献报道损伤的前交叉韧带经缝合后具有一定的自我修复能力^[25-27]，但是临床上目前的主流方案仍然是前交叉韧带重建。腱-骨愈合是重建术后恢复的一大关键和难点，因此急需新的治疗方案来弥补其不足。组织工程技术的出现和迅速发展为韧带损伤修复提供了新的思路和方向，也取得了一定的成绩。既往相关研究表明，人羊膜间充质干细胞的增殖能力较骨髓间充质干细胞更强，并且具有高纯度、高活力、高丰度等特点，此外，人羊膜间充质干细胞来源广泛，不存在道德伦理问题。基于以上各大优势，实验采用人羊膜间充质干细胞作为种子细胞来诱导其向人韧带成纤维细胞分化，为韧带损伤修复开辟新的道路。实验结果显示：人羊膜间充质干细胞具有干细胞特性，在倒置相差显微镜下原代细胞多呈椭圆形或者不规则形生长，经过传代后其多呈长梭形、涡旋状贴壁生长。

Scleraxis是韧带和肌腱的特异性分子标志，作为韧带和肌腱的主要转录分子，Scleraxis表达于韧带和肌腱细胞分化的各个阶段，对韧带和肌腱细胞的发生和发育起着重要的作用^[28-30]。研究发现，Scleraxis可以在韧带/肌腱形成早期检测到，且在其整个发育和分化时期高表达。在Scleraxis基因敲除的小鼠模型中能够观察到韧带和肌腱明显的生长和分化缺陷，说明Scleraxis在韧带和肌腱的发育和分化过程中具有重要的作用^[31-32]。Alberton等^[33]研究发现，在人骨髓间充质干细胞中过表达Scleraxis后其向成骨和成软骨分化能力减弱，但是能够高表达韧带相关蛋白和胶原，此外，还能够明显增强韧带的另一个标志性蛋白TNMD的表达。Gulotta等^[34-35]利用Scleraxis来修饰骨髓间充质干细胞，发现其能够促进腱-骨界面的愈合和修复。以上实验均证实了Scleraxis能够促进细胞的成韧带分化，为韧带损伤修复提供了新的思路。

碱性成纤维细胞生长因子在韧带损伤修复过程中发挥着重要的作用，是韧带/肌腱损伤修复过程中的一个重要的因子，在损伤后高表达^[36-38]。韧带损伤重建术后1周，碱性成纤维细胞生长因子的表达达到峰值，并且持续表达3周，在第8周时其表达再次升高^[39]。在韧带损伤修复早期，碱性成纤维细胞生长因子的表达开始升高，主要是韧带细胞分泌的内源性碱性成纤维细胞生长因子通过刺激细胞增殖、迁徙，促进血管再生和提高Ⅲ型胶原的表达来发挥作用，但是作用效果和持续作用时间有限，所以导致韧带损伤自行愈合的能力较弱^[40]。因此，有学者开始试着将外源碱性成纤维细胞生长因子导入细胞内从而来促进韧带损伤修复。Thomopoulos等^[41]在韧带损伤后早期(10 d左右)加入外源性碱性成纤维细胞生长因子，结果发现外源碱性成纤维细胞生长因子与内源碱性成纤维细胞生长因子能够产生协同效应，促进细胞增殖、加速细胞外基质形成和重塑，从而明显缩短韧带愈合时间。

此实验首先用Scleraxis基因慢病毒感染人羊膜间充质干细胞，促进其向人韧带成纤维细胞分化，实验结果显示慢病毒能够成功感染人羊膜间充质干细胞，其转染效率较高且持续，转染后24 h即可以看到绿色荧光，Scleraxis mRNA表达量急剧升高，说明通过慢病毒转染技术能够成功将Scleraxis基因导入人羊膜间充质干细胞。通过实时荧光定量PCR实验发现转染后韧带相关基因的mRNA表达量明显上调，说明转染Scleraxis基因后人羊膜间充质干细胞能够向人韧带成纤维细胞分化。单独用10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞，14 d后细胞形态发生明显改变，近似人韧带成纤维细胞。实时荧光定量PCR结果提示：诱导后人羊膜间充质干细胞确实向人韧带成纤维细胞分化，其韧带相关基因的mRNA表达量上调。最后，通过Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子联合来诱导人羊膜间充质干细胞，仍然能够向人韧带成纤维细胞分化，并且其分化效果强于单纯转染Scleraxis基因和单纯应用碱性成纤维细胞生长因子。该研究还发现，经慢病毒转染Scleraxis基因与碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞的效果没有明显差异。

综上所述，实验通过联合Scleraxis基因和碱性成纤维细胞生长因子来促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化，为韧带损伤修复治疗提供了新的思路。但是实验还存在一些不足之处：①此实验只是在体外证明了Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子能够促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化，为韧带损伤修复提供了新的方向。但是，还缺乏相应的体内实验，后期还应在体内进一步证实其促进韧带损伤修复的作用；②碱性成纤维细胞生长因子诱导浓度是否为最佳还需要进一步的实验证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程