血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1743

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3349-3356.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1743

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活

金文虎¹，周爱婷²，吴中桓³，范振海⁴，王达利¹，魏在荣¹

遵义医学院附属医院，¹烧伤整形外科，²生殖中心，⁴细胞工程实验室，贵州省遵义市 563003；³黔东南州人民医院，贵州省凯里市 556000

修回日期:2019-01-12 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
作者简介:金文虎，男，1982年生，黑龙江省密山市人，朝鲜族，四川大学华西医学院在读博士，副主任医师，主要从事手、显微皮瓣外科方面的研究。
基金资助:
贵州省科技厅基金(黔科合J字LKZ[2012]30号)，项目负责人：金文虎

Vascular endothelial growth factor gene modified human amnion-derived mesenchymal stem cells promote the survival of ultra-long random skin flap

Jin Wenhu¹, Zhou Aiting², Wu Zhonghuan³, Fan Zhenhai⁴, Wang Dali¹, Wei Zairong¹

¹Department of Plastic Surgery and Burns, ²Reproductive Centres , ⁴Key Laboratory of Cell Engineering of GuiZhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China; ³People’s Hospital in Southeastern Guizhou Province, Kaili 556000, Guizhou Province, China

Revised:2019-01-12 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
About author:Jin Wenhu, Doctorate candidate, Associate chief physician, Department of Plastic Surgery and Burns, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Foundation of Guizhou Province, No. LKZ[2012]30 (to JWH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人羊膜间充质干细胞：与间充质干细胞相似的表面标志，在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的间充质细胞，具有间充质干细胞的共性，有减轻炎症反应、促进肉芽组织沉积、促进再上皮化及血管生成作用。
血管内皮生长因子：是一种高度特异性的促血管化生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，被认为是目前研究血管生成的热点因子。

摘要
背景：研究证实血管内皮生长因子能够诱导新生血管形成，人羊膜间充质干细胞也可通过多种机制改善皮瓣移植的缺血再灌注损伤。因此，用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞为促进皮瓣成活提供了可能。
目的：探索局部应用血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞对超长比例随意皮瓣成活的影响。
方法：将30只成年SD大鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组10只，在其背部左右分别构建2 cm×8 cm超长缺血随意皮瓣模型，皮瓣蒂部位于髂棘水平，分别为Ⅰ-left，Ⅰ-right，Ⅱ-left，Ⅱ-right，Ⅲ-left，Ⅲ-right。皮瓣掀起后即刻，Ⅰ-left、Ⅱ-left注射0.5 mL LG-DMEM培养基划分为对照组，Ⅰ-right、Ⅲ-left注射0.5 mL细胞浓度为1×10⁹ L^-1的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组1，Ⅱ-right、Ⅲ-right注射0.5 mL细胞浓度为1×10⁹ L^-1转染血管内皮生长因子基因的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组2，每个皮瓣共注射5点，每点注射0.1 mL。移植后即刻、24，48 h以及4，7 d，激光多普勒血流监测仪监测皮瓣中部和蒂部的血流灌注值，移植后7 d观察各组皮瓣的成活率，取成活皮瓣组织通过组织学观察各组皮瓣毛细血管密度，荧光显微镜观察人羊膜间充质干细胞在皮瓣内的分布及存活状况，Western blot检测皮瓣组织中血管内皮生长因子蛋白水平。
结果与结论：①实验组2皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于实验组1及对照组，实验组1皮瓣成活率、血流灌注值、皮瓣毛细血管密度明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②在荧光显微镜下观察发现，实验组1、实验组2皮瓣组织内有CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞；③各组皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达均呈阳性，实验组2皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于实验组1及对照组，实验组1皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果证实，在超长随意皮瓣中、远部位应用人羊膜间充质干细胞可明显改善皮瓣成活率；人羊膜间充质干细胞经血管内皮生长因子基因转染后能够分泌更多的血管内皮生长因子蛋白，进而促进超长随意皮瓣血管新生，提高皮瓣成活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7515-9030(金文虎)

关键词: 超长缺血随意皮瓣模型, 人羊膜间充质干细胞, 血管内皮生长因子, 基因转染, 皮瓣成活率

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that vascular endothelial growth factor can induce angiogenesis, and human amnion-derived mesenchymal stem cells improve the repair of ischemia-reperfusion injury using flap transplantation via various mechanisms. Therefore, the modification of human amnion-derived mesenchymal stem cells using vascular endothelial growth factor gene promotes the survival of skin flaps.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human amnion-derived mesenchymal stem cells modified by vascular endothelial growth factor gene on the survival of ultra-long random skin flaps.
METHODS: Thirty healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into group I, group II and group III, 10 rats in each group. Two ultra-long ischemic random skin flap models were constructed at the left and right back of each rat, and the skin flap pedicle was located at iliac spine level. These skin flaps received the following treatment immediately after removal: The flaps were divided into group I-left, I-right; II-left, II-right; III-left and III-right. 0.5 mL of LG-DMEM was injected in the skin flaps in I-left and II-left groups (control group); 0.5 mL of 1×10⁹/L human amnion-derived mesenchymal stem cells was injected into the skin flaps in I-right and III-left groups (experimental group 1); 0.5 mL of 1×10⁹/L vascular endothelial growth factor-transfected human amnion-derived mesenchymal stem cells was injected into the flaps in II-right and III-right groups (experimental group 2). There were five injection sites for each flap, 0.1 mL per each site. The blood perfusion in the middle and pedicle of each skin flap was monitored using laser Doppler flow meter immediately, 1, 2, 4 and 7 days after transplantation. The survival rate of skin flaps in all groups was measured at 7 days after transplantation. The capillary density in survived skip flaps was histologically observed. The distribution and survival rate of CM-Dil labeled human amnion-derived mesenchymal stem cells were observed by fluorescent microscope. The vascular endothelial growth factor protein level was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The survival rate of skin flaps, blood perfusion, and capillary density showed significantly difference among groups (P < 0.05) and ranked as follows: experimental group 2 > experimental group 1 > control group. (2) Under fluorescent microscope, CM-Dil labeled human amnion-derived mesenchymal stem cells were visible in the flaps in the experimental groups 1 and 2. (3) Vascular endothelial growth factor positively expressed in all the flaps, while the protein expression of vascular endothelial growth factor was ranked as follows: experimental group 2 > experimental group 1 > control group and there were significant differences among groups (P < 0.05). To conclude, the application of human amnion-derived mesenchymal stem cells in the middle and distal parts of ultra-long random skin flap can remarkably improve the survival rate of skin flaps, and moreover transfection with vascular endothelial growth factor can increase the secretion of vascular endothelial growth factor, further improving the effects of human amnion-derived mesenchymal stem cells promoting angiogenesis and survival rate of ultra-long random skip flaps.

Key words: ultra-long ischemic random flap model, human amnion-derived mesenchymal stem cells, vascular endothelial growth factor, gene transfection, flap survival rate

中图分类号:

金文虎，周爱婷，吴中桓，范振海，王达利，魏在荣. 血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3349-3356.

Jin Wenhu, Zhou Aiting, Wu Zhonghuan, Fan Zhenhai, Wang Dali, Wei Zairong. Vascular endothelial growth factor gene modified human amnion-derived mesenchymal stem cells promote the survival of ultra-long random skin flap[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3349-3356.

图/表（结果） 5

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态及表型特征 体外分离、培养获得的第3，4代人羊膜间充质干细胞多呈梭形或多角形，贴壁呈漩涡、网状或辐射状排列生长，单层扁平分布，形态与成纤维细胞类似，见图3。

流式细胞仪分析结果表明，人羊膜间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD166，不表达造血系统和内皮系统抗原标记CD34、CD45，见图4。

2.2 荧光显微镜观察pCMV-VEGF165-eGFP转染效率 Lipofectamine 2000介导pCMV-VEGF165-eGFP转染人羊膜间充质干细胞12 h后，荧光显微镜下可观察到部分人羊膜间充质干细胞内有少量绿色荧光蛋白表达，胞质、胞核内均有绿色荧光蛋白分布，间接反映pCMV-VEGF165-eGFP转染成功，转染效率为5.53%。伴随时间的延长，绿色荧光蛋白在人羊膜间充质干细胞内的分布也逐渐增多，表明转染效率较高。绿色荧光蛋白在转染后72 h表达明显增多，96 h时也持续较高的表达，见图5。12，24，48，72，96 h的转染率分别为5.53%，13.37%，32.37%，43.62%，48.08%，差异有显著性意义(P < 0.05)，选择转染效率相对高的时间点(96 h)的人羊膜间充质干细胞用于实验。

2.3 荧光显微镜体外观察CellTracker^TM CM-DiI标记效果 荧光显微镜观察发现，标记CellTracker^TM CM-DiI的人羊膜间充质干细胞发红色荧光，呈球形(经消化、重悬)，胞浆丰富，CellTracker^TM CM-DiI标记人羊膜间充质干细胞阳性率高，见图6。

2.4 各组皮瓣模型的成活率 术后7 d皮瓣坏死区域与存活区域界线已经清晰，适时评估各组皮瓣成活率，见表2。

实验组2超长缺血皮瓣模型成活率明显高于实验组1和对照组，实验组1超长缺血皮瓣模型成活率明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、Ⅰ-right和Ⅲ-left、Ⅰ-left和Ⅱ-left之间皮瓣成活率差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

2.5 激光多普勒血流监测仪监测不同时间缺血皮瓣模型不同部位灌注单位(PU)变化 在缺血皮瓣模型建立后即刻、24，48 h以及4，7 d检测蒂部及中部灌注单位(PU)，见表3，4。

2.6 组织学分析各组皮瓣模型的血管断面密度 实验组2超长缺血皮瓣模型微血管断面密度明显高于实验组1和对照组，实验组1超长缺血皮瓣模型微血管断面密度高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、Ⅰ-right组和Ⅲ-left、Ⅰ-left和Ⅱ-left之间微血管断面密度差异无显著性意义(P > 0.05)，见表5和图8。

2.7 移植人羊膜间充质干细胞在体内的存活和增殖情况 在荧光显微镜下观察，对照组未见红色荧光，实验组1和实验组2均可见红色荧光，可以认为其是经CellTracker^TM CM-DiI标记的人羊膜间充质干细胞，见图9，表明植入体内的人羊膜间充质干细胞可存活和增殖。

2.8 Western blot 检测各组大鼠超长缺血皮瓣组织中血管内皮生长因子蛋白表达 各组皮瓣组织内血管内皮生长因子表达均呈阳性，实验组2超长缺血皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于实验组1和对照组，实验组1超长缺血皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达明显高于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。Ⅱ-right和Ⅲ-right、Ⅰ-right 和Ⅲ-left、Ⅰ-left 和Ⅱ-left之间皮瓣组织血管内皮生长因子蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图10和表6。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年3月至2016年3月在遵义医学院附属医院烧伤整形科创伤实验室及贵州省细胞工程重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年健康SPF级SD大鼠30只，6-9周龄，体质量(250±30) g，购于第三军医大学动物实验中心，动物使用许可证号：SCXK(渝)2012-0005，实验过程中对动物的饲养及操作处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 实验试剂和仪器 pCMV-VEGF165-eGFP重组质粒(GeneCopoeia公司)；LG-DMEM培养基、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶(美国GIBICO公司)；小鼠抗人CD29-PE流式抗体、CD73-PE流式抗体、CD166-PE流式抗体、CD44-FITC流式抗体、CD34-FITC流式抗体、CD45-FITC流式抗体(美国eBioscience公司)；羊抗小鼠lgG-FITC流式抗体(美国Santa Cruz公司)；CellTracker^TMCM-DiI(美国Invitrogen公司)；Western blot试剂盒(Beyotime碧云天公司)；激光多普勒血液监测仪(瑞典PERIMED公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；Cell Quest软件(美国苹果公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞分离、培养、鉴定 经知情同意后，从遗弃的胎盘上获得羊膜，PBS重复冲洗，采用双酶(胰蛋白酶-胶原酶)消化法体外培养，倒置相差显微镜观察人羊膜间充质干细胞形态及排列方式，取第3，4代对数生长期人羊膜间充质干细胞用于实验^[10-11]。

1.4.2 pCMV-eGFP-VEGF的构建、扩增、提取、纯化和鉴定 在Genebank上查询血管内皮生长因子的序列，设计引物；提取以包含VEGF全序列的质粒总RNA，反转录合成cDNA；用上述获得的cDNA为模板，通过巢式PCR从cDNA中扩增编码血管内皮生长因子成熟肽的基因序列，将获得的血管内皮生长因子基因与质粒载体进行连接，再将连接成功的质粒载体转化感受态大肠杆菌(BL21)，鉴定测序，回收纯化。将重组血管内皮生长因子克隆载体和真核表达载体pCMV-ORF-SV40-eGFP-IRES 以BamH Ⅰ、PspXⅠ进行双酶切，获得重组质粒pCMV-VEGF165-eGFP。用无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。

1.4.3 pCMV-EGFP-VEGF体外转染人羊膜间充质干细胞 取第3代人羊膜间充质干细胞接种于24孔板上培养，按Lipofectamine 2000试剂说明，将pCMV-VEGF165-eGFP重组质粒和Lipofectamine 2000试剂分别溶于无血清培养基(OPTI-MEM)中。将24孔板中的人羊膜间充质干细胞用OPTI-MEM洗2次，将上述得到的混合液逐滴加入孔中，混匀，继续培养(37 ℃，90%湿度，体积分数为5%CO₂)，5 h后更换成含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养基培养。

1.4.4 荧光显微镜观察pCMV-eGFP-VEGF转染效率 用荧光显微镜在脂质体介导pCMV-VEGF165-eGFP转染人羊膜间充质干细胞后12，24，48，72，96 h时观察转染效果，随机选择5个视野(400倍)，分别计数全部人羊膜间充质干细胞数量和发绿色荧光的人羊膜间充质干细胞数量，按公式(转染率=发绿色荧光的人羊膜间充质干细胞数量/人羊膜间充质干细胞总数量×100%)计算转染效率，评估转染效果。

1.4.5 CellTracker^TM CM-DiI荧光标记人羊膜间充质干细胞 人羊膜间充质干细胞在体内移植之前，CellTracker^TM CM-DiI按终质量浓度2 mg/L加入含转染和未转染人羊膜间充质干细胞的培养瓶内，先于37 ℃避光孵育5 min，再换为4 ℃避光孵育15 min，弃掉染液，PBS洗3遍，向标记好的人羊膜间充质干细胞培养瓶内加酶消化，离心，弃去上清，再加入LG-DMEM培养基制成悬液，4 ℃避光备用。

1.4.6 大鼠随意皮瓣模型建立及分组处理 实验动物在术前12 h开始禁食准备，用100 g/L水合氯醛3 mL/kg剂量腹腔注射麻醉后俯卧位固定，鼠背术区用硫化钠(10%)脱毛，碘伏、乙醇消毒，铺巾。在大鼠背部正中线左右两侧分别设计2个对称的超长宽比例随意皮瓣模型(8 cm×2 cm)，皮瓣模型蒂部位于髂棘水平，见图1。

将30只SD大鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组10只，其背部皮瓣按左右位置分成Ⅰ-left，Ⅰ-right，Ⅱ-left、Ⅱ-right，Ⅲ-left、Ⅲ-right，其中Ⅰ-left、Ⅱ-left注射LG-DMEM培养基划分为对照组，Ⅰ-right、Ⅲ-left注射人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组1，Ⅱ-right、Ⅲ-right注射转染血管内皮生长因子基因的人羊膜间充质干细胞悬液划分为实验组2，见表1。实验选择在皮瓣纵向中心轴线距离皮瓣蒂部3，4，5，6，7 cm的中远位置作为注射点，顺应了皮瓣模型的术后病理生理学变化。皮瓣掀起后立即分别用1 mL注射器抽取实验溶液，在皮瓣中、远部位，从筋膜面向肉膜层和真皮层内注射，一个皮瓣共5点(每点注射0.1 mL，细胞浓度为1×10⁷ L^-1)，见图2。

1.5 主要观察指标 ①人羊膜间充质干细胞形态及表型特征；②荧光显微镜观察pCMV-VEGF165-eGFP转染效率；③荧光显微镜体外观察人羊膜间充质干细胞的CM-Dil标记效果；④大体观察皮瓣成活率；⑤移植后即刻、24，48 h以及4，7 d，采用激光多普勒血流监测仪监测皮瓣模型蒂部及中部灌注单位(PU)变化；⑥移植后7 d在皮瓣成活区域(距成活与坏死交界0.5 cm)切取标本组织，包括皮肤、皮下肉膜层和部分肌膜，行组织学观察皮瓣模型的微血管断面密度；⑦移植后7 d在皮瓣成活区域(距成活与坏死交界0.5 cm)切取标本组织，荧光显微镜下观察人羊膜间充质干细胞移植体内后的存活和增殖情况；⑧移植后7 d在皮瓣成活区域(距成活与坏死交界0.5 cm)切取标本组织，Western blot检测皮瓣组织中血管内皮生长因子表达。

1.6 统计学分析 使用SPSS 22.0统计软件进行分析，实验数据均以x(_)±s表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

皮瓣外科技术是临床解决骨、肌腱等外露创面的关键技术之一。在四肢及躯干等部位的随意皮瓣长宽比一般不能超过1∶1.5^[12-13]。皮瓣缺血坏死主要发生在中、远端，皮瓣移植后血管新生速度和血供重建质量直接关系到皮瓣成活比例与成活质量^[14-15]。血管内皮生长因子和新生血管的关系密切^[16-17]，是潜在的血管形成激活物^[18]，是目前发现的最有效的促血管化因子^[19-22]，其在皮瓣外科领域的应用相对较晚，但已显示出有广阔的应用前景。血管内皮生长因子可以通过特异性作用于血管内皮细胞来维持血管正常状态及完整性、舒张血管、提高血管通透性及诱导微血管新生，进而发挥促组织血管化作用^[23-25]。有实验研究显示，局部和静脉注射血管内皮生长因子蛋白均可改善皮瓣的存活情况^[26-28]；也有研究者认为，血管内皮生长因子蛋白半衰期较短，在转运到术区之前可很快被机体分解，无法达到有效促血管生成浓度，发挥作用甚微，需连续重复给药^[29-31]，而且价格也十分昂贵，如何持续有效发挥其效果是个难题。人羊膜间充质干细胞是间充质干细胞一种，来源于胎儿分娩后的“废弃物”胎盘，研究证实人羊膜间充质干细胞能表达和旁分泌血管内皮生长因子、色素上皮衍生因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子β、白细胞介素6、表皮生长因子、促红细胞生成素和血管生成素1等促血管生成的细胞因子或蛋白，促进血管内皮细胞增殖、创面血管新生，增加血管密度^[32]。该实验通过模型建立后当即移植人羊膜间充质干细胞和血管内皮生长因子基因修饰的人羊膜间充质干细胞来解决皮瓣术后局部血管内皮生长因子生物学浓度不足的问题，借此方法来改善随意皮瓣中远部位的缺血耐受力及成活能力，促进随意皮瓣在临床上的扩展应用。

实验设计大鼠背侧比例明显大于1∶1.5的两个随意皮瓣，必将导致皮瓣中远端缺血坏死。通过皮瓣下注射人羊膜间充质干细胞及转染血管内皮生长因子的人羊膜间充质干细胞观察到皮瓣成活率有明显提高，并且转染了血管内皮生长因子的人羊膜间充质干细胞要高于单存注射人羊膜间充质干细胞，通过激光多普勒探查皮瓣蒂部及中点处氧分压灌注单位值、组织学观察皮瓣模型的微血管断面密度均得出相同结论。Western blot检测实验组2血管内皮生长因子表达明显要高于其他两组，可能是人羊膜间充质干细胞在缺血缺氧环境下通过自身及旁分泌等作用发挥促进血管再生及上皮化等作用，转染的血管内皮生长因子可以稳定持续表达发挥其血管再生作用。

综上所述，可认为血管内皮生长因子基因的促进血管新生作用与人羊膜间充质干细胞的促进血管生成作用相结合可有效促进术后皮瓣组织的血供重建，两者的促血管化有协同作用，但其协同作用的方式和机制需进一步研究，联合应用的最佳方式、使用剂量、使用时间及不良反应等方面也需要更多的探索研究，该实验为探索一种更有效、安全、简单、经济及灵活的促皮瓣成活方法提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血管内皮生长因子基因修饰人羊膜间充质干细胞利于超长随意皮瓣的成活

Vascular endothelial growth factor gene modified human amnion-derived mesenchymal stem cells promote the survival of ultra-long random skin flap

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