2.1  人羊膜间充质干细胞的形态  倒置显微镜下观察显示：生长良好的第3代人羊膜间充质干细胞在40倍镜下呈现明显的长梭形、漩涡形，见图1A；100倍镜下细胞接触更紧密，形状接近于三角形，见图1B；200倍镜下细胞呈更明显的长梭状生长，细胞与细胞之间相互黏附，见图1C。

2.2  慢病毒感染人羊膜间充质干细胞  课题组前期实验发现6.5 μL Scleraxis慢病毒原液感染人羊膜间充质干细胞效果最好，96 h后荧光表达量最强，见图2。

2.3  CCK-8法检测各组人羊膜间充质干细胞增殖活性  各组细胞生长曲线均呈S型。空白对照组、空载质粒组、Scleraxis基因慢病毒感染组之间的细胞增殖能力无明显差异(P > 0.05)，说明Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后对其增殖无影响，见图3。

2.4  实时荧光定量PCR检测慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的表达及韧带相关基因的表达  携带有Scleraxis基因的慢病毒能够成功感染人羊膜间充质干细胞，感染后其mRNA表达量成倍的增加，Scleraxis基因慢病毒感染组韧带相关基因的mRNA表达量高于空白对照组和空载质粒组，差异有显著性意义(P < 0.05)，空白对照组和空载质粒组的韧带相关基因mRNA表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5  免疫荧光检测人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒转染后其韧带相关蛋白的表达  Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞组韧带相关蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C均有表达，主要在胞浆及细胞周围表达，空白对照组和空载质粒组均未观察到Ⅰ、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C的表达，见图5。

2.6  体内动物实验过程  动物体内实验步骤，见图6。

2.7  胫骨-移植物切片染色  术后3个月取胫骨-移植物标本，Scleraxis基因慢病毒感染组苏木精-伊红染色显示腱-骨交界面胶原排列整齐，交界面逐渐变窄；番红固绿染色  显示腱-骨交界面愈合良好，见图7，8。

前交叉韧带对膝关节的稳定起着至关重要的作用，因高能量及剧烈运动所致的前交叉韧带损伤是最常见的运动损伤之一。关节镜下韧带重建术是目前治疗前交叉韧带损伤的主流术式^[1]。重建后的韧带需要形成腱-骨愈合才能完成韧带功能重建，未能达到牢固的腱-骨愈合是韧带重建失败的主要原因^[2]。前交叉韧带重建术后的腱-骨愈合是一个复杂、逐渐演化的生物学过程，移植物需要经历血肿免疫期、坏死再血管化期和结构重塑3个阶段，才能形成正常韧带末端4层结构：肌腱韧带、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织，从而实现腱-骨愈合^[2-4]。腱-骨愈合过程中，多种细胞及细胞因子介导的炎症反应、细胞增殖、纤维软骨或骨组织形成、血管再生等发挥着关键的作用^[5]。任何影响移植物的再血管化、细胞增殖和基质重塑的因素都可能导致腱-骨愈合失败。因此，促进前交叉韧带重建术后腱-骨界面的愈合能力，重建正常腱-骨界面的解剖结构是前交叉韧带重建术亟待解决的科学问题，也是目前运动医学领域研究的热点。

Scleraxis是bHLH家族中关键的成员之一，是肌腱/韧带细胞的特异性标志分子，参与了肌腱和韧带细胞的发育和分化；此外，其还能够诱导并促进干细胞向肌腱/韧带分化^[6-9]。近些年，基因转染技术发展迅速，通过各种病毒(腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等)手段将需要的目的基因转染到种子细胞，从而让该基因发挥相应的生物学效应来治疗临床相关疾病已经取得了不错的效果^[10-13]。慢病毒由于其独特的性质和优势，在基因操作手段中扮演着重要的角色，它能够整合到宿主细胞并长期稳定表达，因此常作为体内实验的首选基因操作工具，相关的研究也很多^[14]。通过慢病毒将Scleraxis基因导入目的细胞然后应用于动物体内，促进动物腱-骨愈合成为一种新的思路和方向。

种子细胞是实验研究的一大关键因素，目前常用的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞等。人羊膜间充质干细胞由于具有来源广泛、免疫原性低下、多向分化潜能以及无伦理争议等优势，目前已经应用于多项研究中^[15-18]。课题组长期从事于人羊膜间充干细胞的分离培养和相关诱导分化研究，具有一套完整成熟的培养鉴定细胞的方法，已发表很多相关文章^[19-21]。因此，该实验仍然采用人羊膜间充质干细胞作为种子细胞，通过慢病毒转染技术将Scleraxis基因导入人羊膜间充质干细胞，观察其向韧带成纤维细胞的分化效果及体内实验探讨其能否促进新西兰大白兔关节外腱-骨模型的愈合。

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1.1  设计  体外细胞学实验，体内动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年12月至2019年5月在遵义医科大学附属医院细胞工程实验室完成。

1.3  材料  实验所使用的胎盘来自于遵义医科大学附属医院产科足月的健康产妇，无其他疾病，术前均签署知情同意书，符合遵义医科大学附属医院伦理委员会要求。

实验用主要试剂和仪器：血清(美国Gibco公司)；DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；双抗(索莱宝试剂公司)；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；CCK-8试剂盒(索莱宝试剂公司)；CO₂恒温箱(美国Thermo Scientific公司)；超净工作台(北京冠鹏净化设备公司)；冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

实验动物：新西兰大白兔15只，两三个月龄，体质量2 kg左右，雌雄不限，动物饲养在遵义医科大学新浦校区动物实验中心。

1.4  实验方法

1.4.1  人羊膜间充质干细胞的分离与培养  在严格无菌的条件下将羊膜从产妇胎盘上剥离，在低温条件下快速转移至实验室，在超净台上用含1%青霉素、1%链霉素的无菌PBS多次冲洗，放在干净的玻璃皿中用刀片多次清刮，去除多余的结缔组织和血渍。用组织剪将羊膜剪成大小为 1 mm×1 mm×1 mm的小碎片，加入羊膜体积1.5倍的0.05%EDTA-胰蛋白酶，在恒温水浴摇床上消化2次，每次约30 min，加入含血清的DMEM/F12培养基终止消化，PBS冲洗，加入等体积的0.75 g/LⅡ型胶原酶再次消化，直到肉眼观察到羊膜碎片完全消失，300目滤网过滤，收集细胞滤液，以1 800 r/min的转速离心8 min，弃上清，加入1 mL含1%青霉素、1%链霉素、1%谷氨酰胺、1%非必须氨基酸、体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，以(1.0-2.0)×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于75 cm²培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，每两三天更换1次培养基，在倒置显微镜下观察细胞的生长情况、形态并拍照记录。

1.4.2  人羊膜间充质干细胞的传代  镜下观察细胞融合率为90%时进行传代培养，加入3 mL 0.125%胰酶置于37 ℃孵箱中消化2.0-3.0 min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM/ F12培养基终止消化，以1 200 r/min的转速离心5 min，弃掉上清液，加入1 mL低糖DMEM/F12培养基均匀吹打并重悬细胞，然后进行细胞计数，细胞数(/mL)=(4个大格的总数/4)×10⁴，以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，人羊膜间充质干细胞传至第3代后将细胞种板进行后续的相关实验。

1.4.3  实验分组  实验分为3组：空白对照组、空载质粒组、Scleraxis慢病毒感染组。

1.4.4  慢病毒感染人羊膜间充质干细胞  慢病毒的滴度已经在课题组前期实验中测定并反复验证过^[22]，实验也以前期摸索好的病毒感染滴度来感染人羊膜间充质干细胞。取第3代人羊膜间充质干细胞以密度为(3.0-4.0)×10⁵/孔接种于6孔板，当细胞汇合率为50%-60%时(约24 h)加入  6.5 μL病毒原液和1.2 μL聚凝胺(5 mg/L)，感染24 h后将病毒吸出更换培养基，感染48 h后将细胞转移至培养皿中，当细胞汇合至60%时，用3.5×10^-3 mg/L的嘌呤霉素对感染的人羊膜间充质干细胞进行筛选，从而获得稳定表达Scleraxis基因的人羊膜间充质干细胞，以便后续的实验。

1.4.5  CCK-8检测细胞活性  转染Scleraxis慢病毒后第2天开始检测细胞增殖情况，连续检测7 d。具体检测方法：将贴壁的细胞消化制备成1×10⁷ L^-1的细胞悬液，取100 μL加入无菌的96孔板中，每组设置3个副孔，96孔板4个边缘的孔(共计36孔)加100 μL无菌PBS，然后将96孔板放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于孵箱中孵育2 h，取出后用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值，每天测定1次，连续测7 d，记录数据后绘制增殖曲线。

1.4.6  实时荧光定量PCR检测慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的表达及韧带成纤维细胞相关基因的表达  将3组细胞取出用PBS冲洗，采用Trizol法提取细胞RNA，用紫外分光光度计测定RNA的质量。用反转录试剂盒反转录得到cDNA，然后以反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。内参选用GAPDH，目标基因相对表达量通过2^-∆∆Ct法计算。各基因引物序列，见表1。

1.4.7  免疫荧光检测人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒转染后Scleraxis蛋白及其韧带相关蛋白的表达  将细胞配置成细胞浓度为1.5×10⁸ L^-1的细胞悬液，加入6孔板内(含有直径为25 mm的细胞爬片)，转染Scleraxis慢病毒后 7 d按照改良Coons细胞免疫荧光染色步骤操作。一抗4 ℃孵育过夜后，加入抗兔FITC检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C，倒置荧光显微镜观察细胞蛋白分泌情况。

1.4.8  体内动物实验过程  将成年新西兰大白兔用戊巴比妥麻醉后备皮，仰卧位固定在手术台上，沿右侧后肢切开皮肤，暴露跟腱，取长约2 cm的跟腱作为移植物。在左侧膝关节内侧切开皮肤，充分暴露胫骨近端并在胫骨近端用克氏针做一个直径约2 mm的骨隧道，然后将跟腱从骨隧道中穿过，两端缝合固定。采用随机分组的原则将15只兔随机分为3组，每组5只。Scleraxis基因慢病毒感染组：将转染Scleraxis的人羊膜间充质干细胞注射到骨隧道，然后用基质胶将骨隧道两端封闭；空载质粒组：将转染空载质粒的人羊膜间充质干细胞注射到骨隧道，两端用基质胶封闭；空白对照组：将人羊膜间充质干细胞注射到骨隧道，两端用基质胶封闭。然后逐层缝合伤口，待动物麻醉苏醒后放回笼中，术后3 d连续每天肌肉注射1×10⁵ U/kg青霉素。术后3个月将动物处死并取胫骨-移植物复合体进行各项测试。

1.4.9  动物标本切片染色  将标本取下后用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后用EDTA脱钙液脱钙2周，待骨组织变软，用刀片可以轻轻划破时进行切片。首先将标本脱水处理，然后石蜡包埋后切片；切片成功后进行苏木精-伊红染色、番红固绿染色，观察腱-骨愈合情况。

1.5  主要观察指标  转染慢病毒和未转染病毒组人羊膜间充质干细胞的增殖能力、体外向人韧带成纤维细胞定向分化的效果、体内促进腱-骨愈合的效果。

1.6  统计学分析  采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

前交叉韧带损伤是目前骨科的常见疾病，虽然有一些研究证实其损伤后有一定的自我修复能力^[23-25]，但是目前主流的观点和治疗方案还是需要手术重建。重建术后腱-骨愈合情况直接决定着手术效果的好坏，腱-骨愈合一直又是一大难点，很难达到理想的愈合，因此，需要新的手段和方法来进一步加速重建术后的腱-骨愈合。研究表明，间充质干细胞能够在一定程度上促进重建术后的腱-骨愈合，但是目前用于研究的间充质干细胞不计其数，主要有脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等，各种间充质干细胞都有其独特的优点，但是同样具有一些不足之处。人羊膜间充质干细胞增殖能力较其他间充质干细胞更强，并且来源广泛、提取方便、无伦理争议，因此目前得到了广泛的应用和推广。课题组长期以来都从事人羊膜间充质干细胞的分离培养、鉴定和相关研究，基于以上各大优势该实验仍然采取人羊膜间充质干细胞作为种子细胞来进行研究。通过分离培养细胞后发现人羊膜间充质细胞具有干细胞的特性，原代细胞呈圆形和不规则生长，经过几次传代后呈规则的长梭形和涡旋状生长，与之前实验分离培养的细胞结果一致，证明这次实验提取的细胞仍然是人羊膜间充质干细胞。

Scleraxis是韧带/肌腱的特异性基因已是公认的观点，其在韧带/肌腱细胞发育和分化的各个阶段发挥不同的作用^[26-28]。Scleraxis在韧带/肌腱发育早期即能检测到，并且在以后的成熟阶段进一步持续高表达。使用基因敲除技术将小鼠的Scleraxis基因敲除后，可以明显观察到小鼠的肌腱和韧带发育缺陷，证明Scleraxis基因对肌腱/韧带细胞的发育确实起到很重要的作用^[29-30]。Scleraxis基因修饰后的骨髓间充质干细胞高表达韧带相关蛋白，胶原的表达量也明显上调，但是向骨和软骨分化的潜能减弱，证明Scleraxis确实能够促进间充质干细胞向韧带方向分化^[31]。同样的研究也发现，经Scleraxis修饰后的骨髓间充质干细胞能够促进腱-骨交界面的愈合，进一步加速腱-骨愈合^[32-33]。以上实验结果均证实了Scleraxis能够促进间充质干细胞向韧带分化，为此实验提供了理论根据。

实验首先在体外用携带有Scleraxis基因的慢病毒转染人羊膜间充质干细胞，转染后24 h能够观察到绿色荧光，96 h荧光表达量最强，证明Scleraxis基因成功转染到人羊膜间充质干细胞内。通过实时荧光定量PCR检测慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis及韧带相关基因的表达量明显增加，免疫荧光检测韧带相关蛋白的表达也明显增加，验证了转染后的人羊膜间充质干细胞能够向韧带方向分化。然后进行动物体内实验，将转染后的细胞移植到兔跟腱和骨隧道的交界处，观察其对腱-骨愈合的影响。实验采用关节外腱-骨模型，广泛应用于腱-骨愈合研究^[34-37]。首先将兔的跟腱取出，然后在胫骨平台下缘从外侧向内侧做一直径为2 mm的骨隧道，将跟腱从隧道中穿出，两端固定在周围的软组织上。术后3个月取胫骨-移植物复合体，然后将标本进行固定、脱钙、脱水、石蜡包埋、切片并做苏木精-伊红染色和番红固绿染色，空白对照组和空载质粒组腱-骨交界面的宽度仍然比较大，愈合情况较差，胶原排列紊乱；Scleraxis基因慢病毒感染组腱-骨交界面之间的宽度较其他两组明显变窄，且胶原排列规则，说明Scleraxis基因慢病毒感染组对加速腱-骨之间的愈合有一定的促进作用。该实验不仅在体外证实了Scleraxis基因能够促进人羊膜间充质干细胞向韧带分化，体内实验也证实了其能够促进兔关节外腱-骨模型的愈合，但是其具体机制尚不清楚，还需要进一步的研究证实。

实验还存在一些不足之处：①所采用的腱-骨愈合模型是关节外造模，虽然能够观察到移植物与骨之间的愈合情况，但是与临床上前交叉韧带重建术后的腱-骨愈合还存在着一定的差异，缺乏机械应力的刺激作用，可能对指导临床工作还存在一定的缺陷；②实验观察腱-骨愈合的时间点是3个月，其愈合情况与最终的结果可能有一定的差异，所以后续还需要进一步观察，看其最终的愈合情况。

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文题释义：

Scleraxis：是韧带和肌腱的特异性基因，其在韧带、肌腱的发育和分化过程中起着重要的作用，参与细胞外基质的形成。当韧带和肌腱损伤后，Scleraxis也能发挥相应的生物学效应来参与韧带和肌腱的修复，加速损伤修复的进程。

腱-骨交界区：正常的肌腱与骨之间由4层结构构成：肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织，肌腱和骨之间这一过渡结构被称为腱-骨交界面，当其受损时修复效果较差。

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韧带和肌腱损伤是临床比较常见的疾病，由于其缺乏神经和血管，损伤后愈合能力很差，常需要通过手术来治疗。目前常用的手术方式是取自体肌腱移植来重建受损部位，但是目前遇到的最大问题就是移植物与宿主的交界区域愈合能力很差，即腱-骨愈合能力差。目前已经采取各种手段来加速腱-骨愈合，其中通过基因治疗取得了不错的效果。该实验通过查阅相关文献筛选出Scleraxis这个与韧带/肌腱发育和损伤修复相关的基因，然后通过构建慢病毒的手段将该基因成功导入到人羊膜间充质干细胞，在体外证实其能够促进人羊膜间充质干细胞向韧带分化，进一步的体内实验证实了其能够促进兔腱-骨愈合，该实验为腱-骨愈合的研究提供了新的思路。

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