过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1680

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2075-2080.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1680

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达

弓贺炜¹，刘承伟¹，梁炳生²，李刚²

¹贵州省骨科医院骨外三病区，贵州省贵阳市 550007；²山西医科大学第二医院骨科显微手外科组，山西省太原市 030001

修回日期:2019-01-12 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 刘承伟，硕士，主任医师，贵州省骨科医院骨外三病区，贵州省贵阳市 550007
作者简介:弓贺炜，男，1986年生，山西省晋中市人，汉族，硕士，主要从事骨科手显微外科研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81171722)，项目负责人：梁炳生；国家自然科学基金青年科学基金项目(81101365)，项目负责人：李刚

Lentiviral vector-mediated overexpression of miRNA-1 in L6 myoblasts: cell proliferation, differentiation and histone deacetylase expression

Gong Hewei¹, Liu Chengwei¹, Liang Bingsheng², Li Gang²

¹Third Ward of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550007, Guizhou Province, China; ²Department of Orthopaedics (Micro-Hand Surgery), Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Revised:2019-01-12 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Liu Chengwei, Master, Chief physician, Third Ward of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550007, Guizhou Province, China
About author:Gong Hewei, Master, Third Ward of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550007, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81171722 (to LBS); the National Natural Science Foundation of China (Youth Science Foundation), No. 81101365 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
miR-1：微小RNA(MicroRNA，miRNA，miR)是一类长度约为22 个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA，在正常细胞中普遍存在，其在基因转录后水平抑制mRNA的翻译或直接降解mRNA，实现基因调控。miRNA在正常心肌与骨骼肌中均有表达，在骨骼肌中还存在组织特异性miRNA，如miR-1、miR-133及miR-206。
组蛋白去乙酰化酶：是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要作用，一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。

摘要
背景：有研究认为组蛋白去乙酰化酶能够影响肌肉的分化和增殖，且其与miR-1关联紧密，但其具体调控机制尚不明确。
目的：分析miR-1过表达对L6成肌细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶表达水平的影响。
方法：构建表达含miR-1的重组慢病毒载体，进行测序和酶切鉴定，稳定转染L6成肌细胞，采用RT-PCR检测miR-1的表达水平。取稳定转染miR-1重组慢病毒载体的L6成肌细胞(miR-1组)、转染空质粒重组慢病毒载体的L6成肌细胞(空载组)及未转染的L6成肌细胞(空白组)，培养24，48，72，96 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖，荧光显微镜下观察细胞形态变化，Western blot检测培养72 h后的α肌动蛋白表达；培养24，72，120 h后，Western blot与RT-PCR检测miR-1组、空载组组蛋白去乙酰化酶蛋白及基因的表达。
结果与结论：①miR-1慢病毒载体经酶切和测序鉴定正确，转染48 h后，miR-1组L6成肌细胞miR-1基因表达显著高于空载组、空白组(P < 0.01)，实现了miR-1在L6成肌细胞中过表达；②培养24，48，72，96 h后，3组细胞增殖能力比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③培养24，48 h时，miR-1组与空白组、空载组细胞形态无明显差异；72 h以后，miR-1组呈梭形的成熟肌细胞显著增多，且细胞α肌动蛋白表达明显高于空载组、空白组，证实miR-1过表达促进了L6成肌细胞的分化；④随着时间推移，miR-1组的组蛋白去乙酰化酶蛋白条带较空载组明显变淡、变细；miR-1组培养不同时间点的组蛋白去乙酰化酶基因表达均低于空载组(P < 0.01)；⑤结果表明，miR-1过表达可促进L6成肌细胞的分化能力，其机制与抑制组蛋白去乙酰化酶4的表达相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3625-9132(弓贺炜)

关键词: 慢病毒载体, L6细胞, miR-1, 细胞分化, 细胞增殖, α肌动蛋白, 组蛋白去乙酰化酶4, 成肌细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Some studies suggest that histone deacetylase is closely related to miRNA-1 and moreover influences muscle differentiation and proliferation. However, its specific regulatory mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To analyze the effect of miRNA-1 overexpression on the proliferation and differentiation of L6 myoblasts as well as histone deacetylase expression.
METHODS: A recombinant lentiviral vector expressing miRNA-1 was constructed, sequenced and enzymatically identified, by which L6 myoblasts were stably transfected. The expression level of miRNA-1 was detected by RT-PCR. L6 myoblasts stably transfected with miRNA-1 recombinant lentiviral vector (miRNA-1 group), L6 myoblasts transfected with empty plasmid recombinant lentiviral vector (empty vector group) and L6 myoblasts non-transfected with empty plasmid recombinant lentiviral vector (blank group) were cultured for 24, 48, 72, and 96 hours. We then detected cell proliferation by cell counting kit-8 method, observed cell morphological changes under fluorescence microscope, and detected skeletalα-actin expression by western blot after 72 hours of culture. After 24, 72, and 120 hours of culture, western blot and RT-PCR were used to detect histone deacetylase protein and gene expression in the miRNA-1 group and empty vector group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) miRNA-1 lentivirus vector was correctly identified by enzyme digestion and sequencing. After 48 hours of transfection, miRNA-1 gene expression in L6 myoblasts was significantly higher than that in the empty vector and blank groups (P < 0.01 ), thus realizing miRNA-1 overexpression in L6 myoblasts. (2)After 24, 48, 72, and 96 hours of culture, there was no difference in cell proliferation ability among the three groups (P > 0.05). (3) There was no significant difference in cell morphology between miRNA-1, blank and empty vector groups when cultured for 24 and 48 hours, whereas after 72 hours, mature muscle cells with spindle shape in the miRNA-1 group increased significantly in number, and the expression of skeletal α-actin in the cells was significantly higher than that in the empty vector and blank groups, confirming that miRNA-1 overexpression promotes the differentiation of L6 myoblasts. (4) Histone deacetylase bands in the miRNA-1 group were faded over time and became thinner than those in the empty vector group. The expression of histone deacetylase gene in the miRNA-1 group was lower than that in the empty vector group at different time points of culture (P < 0.01). To conclude, the over-expression of miRNA-1 can improve the differentiation ability of L6 myoblasts, and its mechanism is related to the inhibition of histone deacetylase expression.

Key words: Transfection, Myoblasts, MicroRNAs, Cell Differentiation, Actins, Tissue Engineering

中图分类号:

弓贺炜，刘承伟，梁炳生，李刚. 过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2075-2080.

Gong Hewei, Liu Chengwei, Liang Bingsheng, Li Gang. Lentiviral vector-mediated overexpression of miRNA-1 in L6 myoblasts: cell proliferation, differentiation and histone deacetylase expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2075-2080.

图/表（结果） 5

2.1 miR-1重组慢病毒载体构建及鉴定 PCR产物被mulⅠ和BamHⅠ酶切并电泳，结果呈现明显的特异性目的条带，见图2。对筛选出的含miR-1的慢病毒表达载体酶切并测序鉴定，见图3，可见插入的miR-1基因序列符合GenBank的报道。

2.2 慢病毒包装 miR-1慢病毒表达质粒与空载病毒质粒共同转染293T细胞，90%以上细胞表达清晰绿色荧光，见图4，转染成功。

2.3 miR-1慢病毒载体感染结果 miR-1慢病毒载体感染L6成肌细胞后呈现清晰绿色荧光，见图5。RT-PCR (Taqman探针法, AB Assay ID:002046)检测显示，miR-1组较空载组、空白组miR-1基因表达量比显著升高，见图6，说明miR-1重组慢病毒载体实现了miR-1在L6成肌细胞中的过表达。

2.4 细胞增殖实验结果 CCK-8检测显示，实验组与空白组、空载组的细胞增殖能力比较差异无显著性意义(t=-1.010，P=0.342；t=-1.378，P=0.205)，空载组与空白组细胞增殖能力比较差异无显著性意义(t=-1.250，P=0.247)，见表1。

2.5 细胞分化实验结果 培养24，48 h时，miR-1组与空载组、空白组细胞形态无明显差异；72 h以后，miR-1组中呈梭形的成熟肌细胞显著增多，见图7。

Western blot检测结果示，miR-1组α肌动蛋白表达明显升高，见图8，证实miR-1的过表达促进了L6成肌细胞的分化。

Western blot条带显示随着时间推移，miR-1组组蛋白去乙酰化酶蛋白条带与空载组相比明显变淡、变细，见图9，表明miR-1过表达后能显著减弱L6成肌细胞中组蛋白去乙酰化酶的表达。培养24，72，120 h的taqman探针检测结果显示，miR-1组培养不同时间点的组蛋白去乙酰化酶基因相对表达量明显低于空载组(t_{24 h}=1.318，P=0.224；t_{72 h}= 7.527，P < 0.001；t_{120 h}=14.276，P < 0.001)，见表2。

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引言

随着生产发展尤其是手工制造业的发展，周围神经损伤患者逐年增多，这些患者的部分骨骼肌因失去神经营养作用而发生失用性萎缩^[1]，尤其是手内在肌，一旦萎缩，往往难以恢复，对患者手功能造成严重影响，成为手外科临床面临的难题^[2]。近年来，微小RNA(MicroRNA，miRNA，miR)的研究成为学术界的热点，miR是一类长度约为22个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA，在正常细胞中普遍存在，其在基因转录后水平抑制mRNA的翻译或直接降解mRNA，实现基因调控^[3-4]。miRNA在正常心肌与骨骼肌中均有表达，在骨骼肌中还存在组织特异性miRNA(miR-1、miR-133、miR-206)^[5]。对1型肌强直性营养不良患者miRNA表达的研究表明，miRNA可作为肌肉重塑的潜在生物标记^[6]。miR-1参与调控细胞各种正常生理功能，如分化、增殖、凋亡及其代谢等。Fujii等^[7]研究证实miR-1可通过p53独立通路抑制骨肉瘤细胞的增殖。有研究表明，miR-1能够调节心肌的再生和心肌疾病^[8]，能够抑制心肌细胞肥大及细胞外基质沉积，减缓心肌重塑^[9]，可作为早期治疗心肌梗死的靶点^[10]。而在骨骼肌细胞中，miR-1有何作用呢，其发挥作用的机制如何？有研究认为组蛋白去乙酰化酶能够影响肌肉的分化和增殖，且其与miR-1关联紧密，但其具体调控机制尚不明确。实验运用重组慢病毒载体转染的方法，制备稳定转染miR-1慢病毒载体的L6成肌细胞株，使miR-1在L6成肌细胞株中过表达，通过体外细胞实验观察细胞增殖、分化及组蛋白去乙酰化酶表达水平的变化，进一步阐明骨骼肌增殖分化机制，明确miR-1与组蛋白去乙酰化酶在骨骼肌细胞增殖分化过程中的相互作用，为治疗失神经肌萎缩提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外观察性细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年6月至2014年3月在山西医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料 L6成肌细胞株、293T细胞(中国科学院上海细胞所)；大鼠基因组DNA(北京康为公司)；PrimeSTAR HS DNA polymerase kit(日本Takara公司)；pwpI载体、pMD载体、PsPAX2载体(德国Promega公司)；QIAquick PCR产物纯化试剂盒、QIAquick Gel Extraction Kit(德国Qiagen公司)；限制性内切酶(加拿大Fermentas公司)；NEB buffer1/2(美国NEB公司)；100 bp/1 kb DNA ladder、感受态细胞DH5α(北京天根公司)；TRIzol reagent(Invitrogen公司，美国)；琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、溴化乙锭(美国Sigma公司)；氨苄青霉素(Gibco BRL公司，美国)；Taqman探针(00197，001043，ABI公司，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、马血清、PBS、胰蛋白酶(GIBCO公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 miR-1引物设计及鉴定 根据miRBase数据库中miR-1的前体序列设计前体扩增引物(F：5-CCA GGT AAA TCT GTT GTA-3，R：5-ATA TGA ATT CCC TTT TCG-3)，进行PCR扩增，在前体两端引入mulⅠ和BamHⅠ酶切位点(F：5-TTG GAT CCC TGC ACA TGG TCC ATT ACT G-3，R：5-GGA CGC GTA CTG TCA AGA AAA TGG CCA C-3)后再次PCR扩增。分离、离心回收其产物，进行凝胶电泳并测序。

1.4.2 miR-1重组质粒构建及扩增 PCR扩增产物及pwpI载体，见图1，被mulⅠ和BamHⅠ酶切。酶切产物进行电泳、纯化后，在连接反应体系中反应。连接反应产物转化感受态细胞DH5α后，在氨苄青霉抗性(100 µg/L)的LB固体培养基中培养24 h，以未加质粒的DH5α细胞为对照，取阳性克隆菌落进行菌液PCR和质粒测序鉴定，并扩增抽提质粒。

1.4.3 miR-1基因慢病毒包装 胰酶消化对数生长期的293T细胞，培养至融合度达90%-95%。使用慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液(psPAX2 7.5 μg、pMD 2.5 μg、目的质粒10 μg)共同转染。约48 h后，收集细胞上清液，经2次离心过滤后获得浓缩的病毒。

1.4.4 稳定转染L6细胞并检测miR-1表达量 接种并于6 cm培养皿中培养L6成肌细胞，待其融合度达30%-45%，转移至含体积分数10%胎牛血清的培养基并加入病毒上清，加入聚凝胺至终质量浓度4-8 mg/L，培养24 h，转移至正常培养基继续培养24 h，荧光显微镜观察并评估细胞感染效果，采集图像。

流式细胞仪荧光计数分选出目的细胞和相应阴性对照细胞，继续培养收集细胞，抽取细胞总RNA，反转录，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR，Taqman探针，AB Assay ID:002046)法检测miR-1的表达，同时判断转染效果。

1.4.5 增殖实验 以新鲜的DMEM培养液重悬稳定转染的L6成肌细胞，调整细胞浓度至10⁷L^-1，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板内(100 µL/孔)，设为miR-1组，同时设置空载组(转染空质粒重组慢病毒载体的L6成肌细胞)及空白组(未转染的L6成肌细胞)。培养24，48，72，96 h，分别取出96孔板，加入CCK-8液，37 ℃温箱内避光培养1.5 h。以450 nm激发波长测定A值，记录并分析。

1.4.6 分化实验 以新鲜的DMEM培养液重悬稳定转染的L6成肌细胞，调整细胞浓度至10⁷ L^-1，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板内(100 µL/孔)，设为miR-1组，同时设置空载组(转染空质粒重组慢病毒载体的L6成肌细胞)及空白组(未转染的L6成肌细胞)。培养24，48，72，96 h，分别取出96孔板，荧光显微镜下观察细胞分化情况并采集图像。

α肌动蛋白表达：取培养72 h的3组细胞，采用Western blot法检测α肌动蛋白表达(以β-tubulin作内参)。提取细胞中总蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白质分离；用湿转膜法将蛋白条带电转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭；结合一抗，待一抗孵育结束后，洗膜3次，每次5-10 min；结合二抗，洗涤；对PVDF膜进发光前处理后放在Luminescent Image Analyzer中发光，并采集图像分析。

组蛋白去乙酰化酶表达检测：①蛋白表达：培养24，72，120 h，取miR-1组、空载组细胞，裂解液裂解，取上清液，进行Western blot检测，方法参照α肌动蛋白表达检测；②基因表达：培养24，72，120 h，取miR-1组、空载组细胞，采用实时定量RT-PCR(taqman基因探针)法，以TBP(Accession number：Hs00427620)为内参基因，检测组蛋白去乙酰化酶基因的相对表达量。简要步骤如下：提取样品中RNA并反转录，将RNA样品及相关试剂解冻后短暂震荡，离心混匀。将以上实时定量PCR反应混合液混匀，加入实时定量PCR反应体系，用384孔板，注意不要有气泡产生，用Optical Adhesive Cover 将板密封好，短暂离心；将384孔PCR反应板放入Applied Biosystems 7900HT 实时定量PCR仪中，设置程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，反应结束后，显示反应结果图，以Applied Biosystems 7900HT实时定量PCR仪默认阈值为标准，可得到目的基因在该样本中扩增的Ct值。每个样本重复检测3次，取平均值。

1.5 主要观察指标 过表达miR-1后，L6成肌细胞的增殖、分化、形态及组蛋白去乙酰化酶表达变化。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件分析，采用重复测量的方差分析，计量数据以x(_)±s表示。

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讨论

周围神经损伤后，骨骼肌失去神经支配，会发生一系列迅速而显著的病理生理改变，如肌节破坏、肌原纤维降解及收缩速度下降、肌管形成困难、纤维化等^[11-13]。骨骼肌是周围神经系统的效应感受器官，其功能和结构的维持都受到神经系统支配和调节及各种细胞因子的营养。周围神经轴突再生缓慢，在受损神经接受修复后到神经再支配前的这一段时间内，骨骼肌得不到来自于中枢神经、周围神经的各种刺激与营养，在组织结构和生理功能上会发生巨大改变，甚至最终成为一块萎缩的纤维化肌肉，即使周围神经通过再生进入骨骼肌，也无法将其唤醒，永远丧失收缩功能，严重影响周围神经手术预后。因此阐明骨骼肌失神经萎缩机制，有效延缓失神经骨骼肌萎缩的速度和程度，是解决周围神经修复后肌肉能否恢复有效功能的重要环节。

miRNA作为另一种小RNA，是一类普遍正常存在于细胞中长度约为22个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA，在物种进化中相当保守，其在细胞内的表达具有组织特异性和时序性。目前认为，miRNA在基因转录后水平通过与靶mRNA完全或不完全互补结合，进而抑制mRNA的翻译或直接降解mRNA，以达到调控基因表达的目的^[14]。最新研究表明，许多miRNA参与到骨骼肌的生长发育及损伤修复过程中，如将小鼠的Dicer酶(miRNA成熟的关键酶)基因敲除，则胚胎和出生后的小鼠骨骼肌发育发生紊乱、发育不良^[15]。Worton等^[16]通过肌肉注射A型肉毒杆菌毒素构建肌萎缩模型后发现，肌肉miR-1和miR-133a/b水平下降，Hdac4蛋白水平升高。有越来越多的证据表明，miR-1作为肌肉特异性miRNA，在肌细胞增强因子2和其他的肌源性转录因子调控下，控制肌肉细胞的增殖与分化^[17]，是骨骼肌生理及病理过程中起关键作用的调控因子之一。

有研究将miR-1、miR-133和miR-206注射入大鼠受伤骨骼肌内，发现注射miR后骨骼肌再生修复明显加快，同时骨骼肌纤维化明显减少，说明miR-1参与了损伤骨骼肌细胞增殖与分化失调的过程。Wu等^[18]实验证明miR-1可促进鸭成肌细胞的分化，其作用与组蛋白去乙酰化酶相关，miRNA-133可能通过影响血清反应因子和转化生长因子β受体1表达而促进鸭成肌细胞增殖，miR-1和miR-133在骨骼肌发育中发挥不同的重要作用。刘泽远等^[19]通过动物实验证明，被动运动可能通过促进miR-1的表达来促进肌细胞分化，发挥防止失神经骨骼肌萎缩的作用。对miR-1的调控，可能为人类延缓骨骼肌萎缩带来希望，然而在这一修复过程中miR-1具体是发挥了什么样的生物学作用仍需深入研究。课题组前期实验证实，失神经肌萎缩的发生与miR-1的表达下降密切相关^[20]。此次实验成功构建了miR-1重组慢病毒载体，并实现了L6成肌细胞的稳定转染，细胞计数实验表明，过表达miR-1对L6成肌细胞增殖无明显影响，但诱导稳定转染的L6成肌细胞分化72 h后，荧光显微镜下观察呈梭形的成熟肌细胞明显增多，此时检测α-肌动蛋白表达亦增多。作为肌细胞分化成熟的标志物，α肌动蛋白表达增多表明L6成肌细胞分化加快，而在骨骼肌发育及损伤修复过程中，肌肉细胞进行恰当的分化调控，是实现肌肉增殖和成熟的必要生物学过程。

作为促进肌肉生长发育的重要转录子^[17]，MEF2与MRF家族成员或其他肌因素相互作用，促进骨骼肌的分化^[21-22]。组蛋白去乙酰化酶家族在基因转录中起重要作用，能够增强带正电荷组蛋白与带负电荷DNA之间的相互作用，抑制基因转录的功能^[23]。其中组蛋白去乙酰化酶与肌细胞增强因子MEF2有关，能够抑制其表达^[24-26]，从而能够抑制肌肉分化。实验构建过表达miR-1的L6成肌细胞，不同时相检测组蛋白去乙酰化酶的表达，发现组蛋白去乙酰化酶的表达量随细胞的分化逐渐降低，说明miR-1过表达至少可通过抑制组蛋白去乙酰化酶的合成，减弱组蛋白去乙酰化酶抑制肌细胞增强因子2蛋白表达的作用，进而促进L6成肌细胞向骨骼肌细胞分化，进一步表明miR-1生物学功能的发挥与组蛋白去乙酰化酶有着紧密关联。

综上所述，课题组成功构建miR-1重组慢病毒载体并稳定转染L6成肌细胞，实现miR-1的过表达，通过体外实验证实，miR-1可通过抑制组蛋白去乙酰化酶的表达而明显增强L6成肌细胞的分化能力，二者可作为防治失神经肌萎缩的重要靶点，为基因水平治疗骨骼肌萎缩提供了良好的解决策略。同时，该实验也为体内实验探究miR-1的作用提供了必要依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达

Lentiviral vector-mediated overexpression of miRNA-1 in L6 myoblasts: cell proliferation, differentiation and histone deacetylase expression

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