miR-142-3p通过调控S1PR3影响膀胱癌干细胞的干性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1675

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞：是从肿瘤细胞中分离出的具有自我更新能力和多能性，类似于干细胞样的一小群细胞，这类细胞被认为是肿瘤起始、复发、转移和耐药的主要原因，在肿瘤的恶性进展中具有重要作用，是阻碍肿瘤治疗导致患者预后不良重的要因素。
微小RNA(miRNA)：是一类长度19-25个核苷酸的小分子单链RNA，不具备编码蛋白质的功能，其通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区，调控基因转录后表达水平，在癌症的细胞增殖、凋亡及其他生物过程中起关键作用，近年来miRNA在肿瘤干细胞中的重要作用受到关注。

摘要
背景：研究发现miR-142-3p低表达于多种肿瘤组织和细胞系中，并且有研究发现TUG1/miR-142/ZEB2轴可抑制膀胱癌增殖并诱导其凋亡。
目的：观察miR-142-3p在膀胱癌干细胞中的表达水平，探讨其对S1PR3的靶向调控作用及对膀胱癌干细胞干性的影响。
方法：从新鲜人膀胱癌组织中分离培养原代膀胱癌细胞，采用流式细胞仪筛选出CD44+细胞与CD44-细胞，Western-blot检测2种细胞中Nanog、Oct4蛋白的表达，qRT-PCR检测2种细胞中miR-142-3p基因的表达。将miR-142-3p mimic(实验组)、miR对照质粒(对照组)分别转染至CD44+细胞，48 h后，采用MTS实验检测细胞增殖能力，软琼脂克隆实验检测细胞克隆形成能力，Transwell小室实验检测各组细胞转移能力，Western-blot检测细胞中pPi3k和pAkt蛋白表达，qRT-PCR检测细胞中S1PR3基因表达。将稳定转染的2种细胞分别注射至裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)右侧腋下，4周后检测肿瘤体积。将S1PR3-突变型+miR-142-3p mimic、S1PR3-突变型+miR对照质粒、S1PR3-野生型+miR-142-3p mimic、S1PR3-野生型+miR对照质粒分别转染至CD44+细胞，48h后检测各组荧光素酶活性。
结果与结论：①CD44+细胞中miR-142-3p基因表达显著低于CD44-细胞(P < 0.05)；CD44+细胞中Nanog、Oct4蛋白表达显著高于CD44-细胞，证实CD44+细胞为膀胱癌干细胞；②实验组膀胱癌干细胞的增殖能力、克隆形成能力及转移能力明显低于对照组(P < 0.05)；③实验组膀胱癌干细胞中pPi3k和pAkt蛋白表达弱于对照组，S1PR3基因表达低于对照组(P < 0.05)；④实验组裸鼠体内肿瘤体积小于对照组(P < 0.05)；⑤与相比，S1PR3-突变型+miR-142-3p mimic组荧光素酶活性显著低于S1PR3-突变型+miR对照质粒组(P < 0.05)，S1PR3-野生型+miR对照质粒组和S1PR3-野生型+miR-142-3p mimic组荧光素酶活性无差异(P > 0.05)；⑥结果表明，miR-142-3p在膀胱癌干细胞中低表达，其可能通过负调控S1PR3下调PI3K/AKT信号通路来抑制膀胱癌干细胞的干性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5393-9466(戚敏俊)

关键词: 膀胱癌干细胞, 干细胞, miR-142-3p, miRNA, S1PR3, 膀胱癌, 细胞转移能力

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that miR-142-3p is underexpressed in a variety of tumor tissues and cell lines, and the TUG1/miR-142/ ZEB2 axis can inhibit proliferation and induce apoptosis in bladder cancer.
OBJECTIVE: To observe the expression level of miR-142-3p in bladder cancer stem cells, and to explore its effects on targeted regulation of S1PR3 and the stemness of bladder cancer stem cells.
METHODS: Primary bladder cancer cells were isolated and cultured from fresh human bladder cancer tissues. CD44⁺ and CD44^- cells were screened by flow cytometry. The expressions of stemness-related molecular markers Nanog and Oct4 in CD44⁺ and CD44^- cells were detected by western blot. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-142-3p in CD44⁺ and CD44^- cells. miR-142-3p mimic (experimental group) and empty plasmid vector (control group) were transfected into CD44⁺ cells. At 48 hours after transfection, MTS was used to detect the cell proliferation ability of bladder cancer stem cells in each group; soft agar cloning assay was used to detect the tumor formation ability; Transwell assay was used to detect the cell migration ability; western blot assay was used to detect the expression of pPi3k and pAkt; and qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of S1PR3. The cells transfected with miR-142-3p mimic or empty plasmid vector were injected into the right armpit of nude mice (provided by the Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.), and the tumor volume was detected at 4 weeks after injection. S1PR3-mutant+miR-142-3p mimic, S1PR3-mutant+empty plasmid vector, S1PR3-wild type+miR-142-3p mimic, S1PR3-wild type+empty plasmid vector were transfected into the CD44⁺ cells. And then luciferase activity in each group was detected at 48 hours after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of miR-142-3p was significantly decreased in the CD44⁺ cells as compared with the CD44^- cells (P < 0.05), and the expression of Nanog and Oct4 in CD44⁺ cells was significantly higher than that in CD44^- cells (P < 0.05), indicating that the CD44⁺ cells are identified as bladder cancer stem cells. (2) The miR-142-3p mimic group showed a significant reduction in the proliferation ability, the tumor formation ability, and the migration ability as compared with the control group (P < 0.05). (3) In the miR-142-3p mimic group, pPi3k and pAkt protein expression was significantly reduced, and the mRNA expression of S1PR3 was also decreased as compared with the control group (P < 0.05). (4) The tumor volume in the miR-142-3p nude mice was significantly smaller than that in the control mice (P < 0.05). (5) The luciferase activity in the S1PR3-mutant+miR-142-3p mimic group was significantly lower than that in the S1PR3-wild type+empty plasmid vector group (P < 0.05), whereas there was no significant difference between the S1PR3-wild type+miR-142-3p mimic and S1PR3-wild type+empty plasmid vector groups (P > 0.05). To conclude, expression of miR-142-3p is down-regulated in bladder cancer stem cells, which may inhibit the stemness of bladder cancer stem cells by negatively regulating S1PR3 and suppressing PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: Urinary Bladder Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9
R365

戚敏俊，吴小鹏，周忠兴，蒋晓东. miR-142-3p通过调控S1PR3影响膀胱癌干细胞的干性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2028-2034.

Qi Minjun, Wu Xiaopeng, Zhou Zhongxing, Jiang Xiaodong. miR-142-3p effect on the stemness of bladder cancer stem cells via regulation of S1PR3[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2028-2034.

图/表（结果） 3

2.1 膀胱癌干细胞的分选 将新鲜膀胱癌组织原代分离培养的原代细胞，采用无血清培养的方法培养出肿瘤球，并利用流式进行分选，结果筛选出CD44⁺细胞约占全部细胞的2.54%。将CD44⁺细胞扩大培养后提取细胞总蛋白，Western-blot检测检测发现，CD44⁺细胞维持肿瘤干细胞干性必须转录因子Nanog、Oct4蛋白的表达显著高于CD44^-细胞，见表1，图1。qRT-PCR结果显示，CD44⁺细胞中miR-142-3p基因表达显著低于CD44^-细胞(0.21±0.03，1.00±0.06，P <0.05)。

2.2 MTS检测膀胱癌干细胞增殖 与对照组相比，实验组细胞增殖能力明显下降(P < 0.05)，见图2。

2.3 软琼脂克隆实验膀胱癌干细胞的克隆形成能力 实验组肿瘤克隆球形成数目为(1.95±0.97)个，显著少于对照的(5.11±1.02)个(P < 0.05)，且体积较小，见图3。

2.4 Transwell小室检测膀胱癌干细胞转移能力 对照组和实验组穿膜细胞数目分别为(78.52±10.27)，(30.12±7.58)个，实验组膀胱癌干细胞转移能力明显低于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.5 Western-blot检测pPi3k、pAkt蛋白表达 Western- blot结果显示与对照组相比，实验组细胞中pPi3k、pAkt蛋白表达水平均明显降低(P < 0.05)，见表2，图5。

2.6 miR-142-3p对膀胱癌干细胞体内成瘤能力的影响 实验组裸鼠肿瘤体积显著小于对照组(P < 0.05)，见图6。

2.7 miR-142-3p对S1PR3的调控 TargetScan7.2软件在线预测显示S1PR3启动子区有miR-142-3p的结合位点，见图7A。进一步的双荧光素酶报告基因实验显示：与S1PR3-突变型+miR对照质粒组相比，S1PR3-突变型+ miR-142-3p mimics组荧光素酶活性显著降低(P < 0.05)；S1PR3-野生型+miR对照质粒组和S1PR3-野生型+ miR-142-3p mimics组间荧光素酶活性无差异(P > 0.05)，见图7B。qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，实验组细胞中S1PR3 mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)，见图7C。

参考文献

[1] Yan M,Jing X,Liu Y.Screening and identification of key biomarkers in bladder carcinoma: Evidence from bioinformatics analysis.Oncol Lett.2018;16(3):3092-3100.

[2] Siegel RL,Miller KD.Cancer statistics, 2018.CA Cancer J Clin. 2018;68(1):7-30.

[3] Liu M,Tu J,Gingold JA,et al.Cancer in a dish: progress using stem cells as a platform for cancer research.Am J Cancer Res. 2018;8(6):944-954.

[4] Naik PP,Panda PK.Oral Cancer Stem Cells Microenvironment. Adv Exp Med Biol.2017;1041(1):207-233.

[5] Akbarzadeh M,Movassaghpour AA,Ghanbari H,et al.The potential therapeutic effect of melatonin on human ovarian cancer by inhibition of invasion and migration of cancer stem cells. Sci Rep,2017;7(1):17062.

[6] Li Y,Lin K,Yang Z,et al.Bladder cancer stem cells: clonal origin and therapeutic perspectives.Oncotarget. 2017;8(39): 66668-66679.

[7] Zhu F,Qian W,Zhang H,et al.SOX2 Is a Marker for Stem-like Tumor Cells in Bladder Cancer.Stem Cell Reports. 2017;9(2): 429-437.

[8] Pan JH,Zhou H,Zhao XX,et al.Role of exosomes and exosomal microRNAs in hepatocellular carcinoma: Potential in diagnosis and antitumour treatments(Review).Int J Mol Med.2018;41(4):1809-1816.

[9] 王明阳,王光磊,陈新亮,等.MicroRNA的生物学功能及其与肿瘤诊断和治疗的研究进展[J].动物医学进展,2018,39(1):95-98.

[10] Zhang Y,Xu B.Effects of miRNAs on functions of breast cancer stem cells and treatment of breast cancer.Onco Targets Ther.2018;11(1):4263-4270.

[11] Lv M,Zhong Z,Huang M,et al.lncRNA H19 regulates epithelial-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA.Biochim Biophys Acta.2017;1864(10):1887-1899.

[12] Xu R,Zhu X,Chen F,et al.LncRNA XIST/miR-200c regulates the stemness properties and tumourigenicity of human bladder cancer stem cell-like cells.Cancer Cell Int. 2018; 18(2):41-53.

[13] Hua S,Liu C,Liu L.miR-142-3p inhibits aerobic glycolysis and cell proliferation in hepatocellular carcinoma via targeting LDHA.Biochem Biophys Res Commun.2018;496(3):947-954.

[14] Chen Y,Zhou X,Qiao J.MiR-142-3p Overexpression Increases Chemo-Sensitivity of NSCLC by Inhibiting HMGB1-Mediated Autophagy.Cell Physiol Biochem.2017;41(4):1370-1382.

[15] Liu Q,Liu H,Cheng H,et al.Downregulation of long noncoding RNA TUG1 inhibits proliferation and induces apoptosis through the TUG1/miR-142/ZEB2 axis in bladder cancer cells.Onco Targets Ther.2017;10(1):2461-2471.

[16] Antoni S,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Bladder Cancer Incidence and Mortality: A Global Overview and Recent Trends.Eur Urol.2017;71(1):96-108.

[17] 朱峰宇,梁瑜,李洋.膀胱癌肿瘤干细胞研究进展[J].转化医学电子杂志,2017,4(5):4-10.

[18] 杨德林,霍倩,王乙水,等.基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响[J].医学研究生学报, 2014,27(10):1028-1032.

[19] Prieto-Vila M,Takahashi RU,Usuba W,et al.Drug Resistance Driven by Cancer Stem Cells and Their Niche.Int J Mol Sci. 2017;18(12):98-106.

[20] Ayob AZ.Cancer stem cells as key drivers of tumour progression. J Biomed Sci.2018;25(1):20.

[21] Zhang Q,Zhuang J,Deng Y,et al.miR34a/GOLPH3 Axis abrogates Urothelial Bladder Cancer Chemoresistance via Reduced Cancer Stemness.Theranostics. 2017;7(19): 4777-4790.

[22] Luo H,Yang R,Li C,et al.MicroRNA-139-5p inhibits bladder cancer proliferation and self-renewal by targeting the Bmi1 oncogene.Tumour Biol.2017;39(7):1010428317718414.

[23] Troschel FM,Böhly N,Borrmann K,et al.miR-142-3p attenuates breast cancer stem cell characteristics and decreases radioresistance in vitro.Tumour Biol. 2018;40(8): 1010428318791887.

[24] Li H,Li F.Exosomes from BM-MSCs increase the population of CSCs via transfer of miR-142-3p. Br J Cancer. 2018;119(6): 744-755.

[25] 尹彦斌,王建杰,刘祎,等.肿瘤干细胞分离研究进展[J].现代生物医学进展,2016,16(2):382-385.

[26] Hatina J,Parmar HS,Kripnerova M,et al.Urothelial Carcinoma Stem Cells: Current Concepts, Controversies, and Methods. Methods Mol Biol.2018;1655(2):121-136.

[27] Tomiyama N,Ikeda R,Nishizawa Y,et al.S100A16 up-regulates Oct4 and Nanog expression in cancer stem-like cells of Yumoto human cervical carcinoma cells.Oncol Lett. 2018; 15(6):9929-9933.

[28] Adada MM,Canals D,Jeong N,et al.Intracellular sphingosine kinase 2-derived sphingosine-1-phosphate mediates epidermal growth factor-induced ezrin-radixin-moesin phosphorylation and cancer cell invasion.FASEB J. 2015; 29(11):4654-4669.

[29] Patmanathan SN,Wang W,Yap LF,et al.Mechanisms of sphingosine 1-phosphate receptor signalling in cancer.Cell Signal.2017;34(2):66-75.

[30] Zhao J,Liu J,Lee JF,et al.TGF-β/SMAD3 Pathway Stimulates Sphingosine-1 Phosphate Receptor 3 Expression: implication of sphingosine-1 phosphate receptor 3 in lung adenocarcinoma progression. J Biol Chem. 2016;291(53): 27343-27353.

[31] Wang S,Liang Y,Chang W,et al.Triple Negative Breast Cancer Depends on Sphingosine Kinase 1 (SphK1)/ Sphingosine-1-Phosphate (S1P)/Sphingosine 1-Phosphate Receptor 3 (S1PR3)/Notch Signaling for Metastasis.Med Sci Monit.2018;24(1):1912-1923.

[32] Wang H,Huang H.Sphingosine-1-phosphate promotes the proliferation and attenuates apoptosis of Endothelial progenitor cells via S1PR1/S1PR3/PI3K/Akt pathway.Cell Biol Int.2018;(1):169-175.

[33] 张保豫,侯博,何海勇,等.内质网应激通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导多形性胶质母细胞瘤干细胞凋亡的机制[J].中山大学学报(医学科学版),2016,37(2):183-189.

引言

膀胱癌为中国及全球常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，原发性膀胱癌90%以上为移行性细胞癌，其治疗为膀胱癌根治性切除术，治疗效果较好，但60%左右的患者会在5年内出现复发，30%的患者可能发展为浸润性膀胱癌，目前复发和浸润性膀胱癌治疗比较棘手，手术及放化疗等联合治疗的疗效有限，使得膀胱癌患者预后不良，5年生存率低于50%，同时患者的生活质量较差^[1-2]。越来越多的研究发现，在多种肿瘤中存在一小部分与肿瘤发生相关的祖细胞，称为肿瘤干细胞^[3]，同时肿瘤干细胞与肿瘤的复发转移紧密相关^[4-5]。近年来的研究发现，膀胱癌中也存在肿瘤干细胞，膀胱癌干细胞与其他肿瘤干细胞一样具有体外增殖、侵袭转移及体内成瘤的能力，可诱导肿瘤复发和耐药，因此研究膀胱癌干细胞的调控机制是改善患者不良预后的关键^[6-7]。

微小RNA(miRNA)作为在转录后水平调控肿瘤增殖、侵袭和转移等恶性行为的重要因子^[8-9]，在肿瘤干细胞的调控方面也发挥了重大作用^[10]，已有文献证实miRNA充当促癌因子和抑癌因子调控膀胱癌干细胞的干性，以促进膀胱癌的恶性进展^[11-12]。研究报道miR-142-3p低表达于多种肿瘤组织和细胞系中^[13-14]，Liu等^[15]研究发现TUG1/miR-142/ ZEB2轴抑制膀胱癌增殖并诱导其凋亡。而miR-142-3p调控膀胱癌干细胞的干性及作用机制未见有报道。因此，实验以原代细胞分离培养的膀胱癌干细胞为研究对象，研究miR-142-3p调控的下游靶基因及对膀胱癌干细胞干性表达的影响，阐明miR-142-3p调控膀胱癌干细胞促进膀胱癌发生发展的潜在机制，为发掘膀胱癌治疗新靶点和新的研究方向提供实验数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察，体内外实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1月至2018年2月在常州市第二人民医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：4周龄雌性裸鼠，体质量28 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验用试剂：Ⅳ型胶原酶、组织蛋白水解酶购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基和体积分数10%胎牛血清均购自美国gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和表皮生长因子、兔抗人Nanog抗体(14295-1-AP)购自美国Peprotech公司；RIPA裂解液、蛋白浓度检测BCA试剂盒、TRIzol裂解液、反转录及qRT-PCR试剂盒等均购自美国Thermo公司；MTS试剂盒购自凯基生物技术有限公司；miR-142-3p mimic、突变型和野生型S1PR3的3’-非翻译区(3’-UTR)荧光素酶报告载体(S1PR3-wt、S1PR3-mut)及miR-142-3p过表达质粒购自上海生工公司；兔抗人Oct4抗体(ab19857)、兔抗人pPi3k抗体(182651)、鼠抗人pAkt抗体(ab81283)、鼠抗人GAPDH抗体(ab9484)购自美国abcam公司。

1.4 实验方法

1.4.1 膀胱癌干细胞的培养与鉴定 取膀胱癌的新鲜组织标本1例，经2位病理医师诊断为膀胱癌，术前未经任何形式的治疗。患者对实验知情同意，手术标本处理符合赫尔辛基宣言和常州市第二人民医院伦理指南要求。在无菌条件下去除新鲜肿瘤组织中的正常组织，用含有抗生素的缓冲液冲洗干净，并用眼科剪将组织剪碎，放入含有1 g/L Ⅳ型胶原酶和组织蛋白水解酶的无血清RPMI-1640培养基中，37 ℃摇床上消化2 h；无菌微米孔径细胞过滤器过滤组织碎块，2 000 r/min离心5 min后，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基终止消化；将细胞重悬在含有20 µg/L白血病抑制因子、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的RPMI-1640无血清培养基中培养；将对数生长期的细胞重悬于FACS缓冲液中，实验组加入CD44 FITC 10 μL，对照组加入10 μL同型对照抗体，于4 ℃避光孵育30 min，每10 min混悬细胞1次，流式细胞仪上机分选出CD44⁺细胞(膀胱癌干细胞)，扩大培养。

qRT-PCR检测检测miR-142-3p基因表达：取CD44⁺细胞与CD44^-细胞，PBS洗涤2次，完全去除PBS，加入适当的TRIzol裂解液，冰上裂解10 min，吹打细胞充分裂解后移至EP管中，每1 mL细胞裂解液加入200 μL氯仿，震荡混合后静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，吸取上层水相层溶液与等体积的异丙醇混匀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，体积分数75%的乙醇洗涤沉淀，晾干后加入适量的DEPC水溶解RNA。设计合成miR-142-3p引物，F：5'-ACA CTC CAG CTG GGT GTA GTG TTT CCT ACT T-3'，R：5'-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG TCC ATA AA-3'；内参GAPDH引物，F：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，R：5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。以总RNA反转为cDNA作为模板按照说明书进行qRT-PCR。分析各样品的循环阈值Ct，2^–??Ct法分析各组实验数据。

Western-blot检测Nanog、Oct4蛋白表达：取CD44⁺细胞与CD44^-细胞，PBS洗1次，各皿吸去PBS后，加入适当含蛋白酶抑制剂的RIPA，冰上裂解10 min，刮刀刮至EP管中，震荡裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min。将上清移至新的EP管中，BCA液测蛋白浓度，加入5×的Loading buffer煮沸变性，上样进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜上，5%BSA液室温封闭1 h，按抗体说明书加入稀释好的一抗室温孵育2 h或4 ℃过夜，TBST洗3次后，二抗室温孵育1 h，采用ELC化学发光法曝光条带。

1.4.2 细胞转染 按说明书将miR-142-3p mimics、对照质粒vector各组转染试剂与脂质体2000转染至膀胱癌干细胞中，分为命名为实验组与对照组。miR-142-3p mimics质粒及其对照质粒vector，均以复感染指数MOI(病毒/细胞数量)20感染膀胱癌干细胞，96 h后更换含1.0 mg/L G418 (遗传霉素)的新鲜培养基培养，隔天更换1次，直至所有细胞均可观察到荧光。

1.4.3 转染后的细胞增殖与转移能力

MTS实验：取转染48 h的各组细胞，细胞计数后以每孔2×10³的密度接种于96孔培养板中，每孔加150 μL培养基培养，每组设置6个复孔，在铺板后第0，24，48，72，96小时，更换150 μL新鲜培养基，加入30 μL MTS试剂，37 ℃细胞培养箱中孵育2 h后，酶标仪检测各孔细胞490 nm处的吸光度值，以时间为横座标、吸光度值为纵坐标，绘制细胞存活曲线。

软琼脂克隆形成实验：将20%无血清RPMI-1640培养基与1.2%灭菌后的软琼脂按1∶1充分混匀后，取1 mL均匀铺至6 cm培养皿中，冷却为固态，作为下层胶；同时取1 mL 20%无血清培养基与0.6%灭菌的软琼脂(1∶1)混合物作为上层胶。将各组1×10⁵个细胞与上层胶混匀后，铺至固态下层胶上，放至培养箱中培养，每天在显微镜下观察并拍照，培养1周左右。

Transwell小室检测细胞转移能力：取转染48 h后的各组细胞，以无血清培养基洗3次，以每孔1×10⁵的细胞密度接种于PBS提前湿润的Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜上，每孔加100 μL无血清培养基；将500 μL完全培养基加入下室，作为趋化因子，放至培养箱中培养，显微镜下观察穿过掉入下室5个细胞时终止培养，PBS洗3次，中性甲醛固定5 min，苏木精染色，晾干后取出聚碳酸酯微孔膜。显微镜下随机计数5个视野膜上的细胞数目，取其均值，代表细胞转移能力。

qRT-PCR检测S1PR3基因表达：取转染48 h后的各组细胞，检测S1PR3基因表达，方法同1.4.1。S1PR3引物，F：5'-CGG CAT CGC TTA CAA GGT CAA-3'，R：5'-GCC ACG AAC ATA CTG CCC T-3'。

Western-blot检测pPi3k和pAkt蛋白表达：取转染后的两组细胞，检测pPi3k和pAkt蛋白表达，方法同1.4.1。

1.4.4 miR-142-3p靶基因的验证 采用TargetScan7.2软件(http://www.targetscan.org/)预测miR-142-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验分4组共转染膀胱癌干细胞： S1PR3-突变型+miR-142-3p mimics组、S1PR3-突变型+ miR对照质粒组、S1PR3-野生型+miR-142-3p mimics组、S1PR3-野生型+miR对照质粒组，收集转染48 h的细胞，根据双荧光素酶报道基因检测试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性。

1.4.5 裸鼠移植瘤模型的构建 将稳转miR-142-3p mimics质粒(实验组)及其对照质粒vector(对照组)的膀胱癌干细胞悬液分别注射到裸鼠右侧腋下，每只注射1×10¹¹L^-1，每组5只。每3 d用游标卡尺测量肿瘤体积，4周后处死裸鼠。

1.5 主要观察指标 转染miR-142-3p mimics后，膀胱癌干细胞的增殖、转移能力及体内成瘤能力变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，数据以x(_)±s表示，采用配对t 检验比较两组间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率为全球恶性肿瘤的第9位^[16]，且男性和老年人发病率相对较高^[17]。由于膀胱癌具有较早发生局部浸润、远处转移及术后反复发作等特性，使得膀胱癌的治疗严重受阻，膀胱癌患者生存时间和生活质量大打折扣^[18]。研究发现，肿瘤细胞中可分离出具有自我更新能力和多能性类似于干细胞的肿瘤干细胞样细胞，这类细胞被认为是肿瘤发生发展、复发、转移和耐药的主要原因^[4-5]，而肿瘤干细胞的这些生物学行为由癌基因及抑癌基因等相关关键因子调控^[19-20]。miRNA因其在肿瘤细胞各种生命活动中的具有重要调控作用，已在肿瘤领域中得到广泛研究^[8-9]。近年来的研究报道发现，miRNA在肿瘤干细胞的调控中同样发挥不可忽视的重要作用^[10]，在膀胱癌干细胞的研究中同样有报道：Zhang等^[21]研究发现，miR34a通过下调GOLPH3抑制化疗耐药尿路上皮膀胱癌UBC细胞株的干性，而miR34a/GOLPH3轴涉及UBC细胞株耐药和复发，可作为治疗耐药性UBC的希望；Luo等^[22]研究数据表明，miR-139-5p表达通过抑制Bmi1阻断膀胱癌干细胞的自我更新。miR-142-3p 位于17q22染色体，为造血系统中细胞命运决定的主要调节因子，在多种类型肿瘤中表达被下调，包括肝癌和肺癌等，与肿瘤迁移、增殖和凋亡等恶性行为有关^[13-14]。miR-142-3p通过下调β-catenin蛋白的表达抑制乳腺癌干细胞的特征和放射抗性^[23]。骨髓来源间充质干细胞分泌的miR-142-3p，可明显抑制结直肠癌肿瘤干细胞的增殖^[24]。而miR-142-3p是否调控膀胱癌干细胞未见有报道，实验致力于研究miR-142-3p对膀胱癌干细胞的影响及调控机制，以期发现治疗膀胱癌新的药物靶点。

肿瘤细胞中肿瘤干细胞的含量非常低，从肿瘤细胞中将肿瘤干细胞分离出来较困难，目前分离肿瘤干细胞的主要方法为无血清悬浮培养法和基于流式细胞仪分选表面免疫学分子标志物法^[25]。在膀胱癌中，CD44已被证实为肿瘤干细胞表面免疫学分子标志物之一^[26]，因此实验以此2种方法筛选出2.54%的CD44⁺细胞。肿瘤干细胞具备的自我更新能力、多向分化潜能，以及高增殖活性、高侵袭转移能力，统称为“干性”^[3]。研究报道肿瘤干细胞有多种标记物，其中维持胚胎干细胞自我更新和多能性的关键转录因子Nanog和Oct4同样是维持肿瘤干细胞干性所必须的^[27]。因此实验采用Western-blot检测Nanog和Oct4蛋白，发现在CD44⁺细胞中的Nanog和Oct4蛋白表达显著高于CD44^-细胞，表明CD44⁺细胞群为膀胱癌肿瘤干细胞，将其扩大培养进行后续实验。qRT-PCR检测发现，miR-142-3p低表达于CD44⁺细胞中。为进一步研究miR-142-3p低表达是否与膀胱癌干细胞干性相关，体外采用MTS、软琼脂克隆形成实验及Transwell小室实验分别检测转染miR-142-3p mimic对膀胱癌干细胞增殖、克隆形成和转移能力的影响，结果发现过表达miR-142-3p可显著抑制膀胱癌干细胞的增殖、克隆形成和转移能力。肿瘤干细胞虽然是肿瘤细胞中极小的一部分，但其致瘤能力极强，是检测肿瘤干细胞干性的金标准^[25]。实验成功构建了过表达miR-142-3p的膀胱癌干细胞系，注射到裸鼠体内，结果显示注射过表达miR-142-3p膀胱癌干细胞组裸鼠的成瘤体积较小，说明miR-142-3p可显著抑制膀胱癌干细胞的体内成瘤能力。体内和体外实验均表明miR-142-3p具有抑制膀胱癌干细胞干性的生物学功能，但其作用机制仍需进一步探讨。

miRNA通常与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，抑制RNA的翻译或增加 miRNA的不稳定性，在基因转录后水平负调控蛋白的表达，但每个miRNA有保守的和非保守的数百个靶基因，通过调控不同的靶基因发挥不同的生物学功能^[8-9]，因此miR-142-3p同样可能通过负调控其靶基因抑制膀胱癌干细胞的干性。TargetScan7.2在线软件预测S1PR3基因3’非翻译区有miR-142-3p的结合位点，同时双荧光素酶报告基因实验证实S1PR3为miR-142-3p直接调控的靶基因，同时miR-142-3p mimic转染的膀胱癌干细胞中S1PR3 mRNA表达下降，表明miR-142-3p负调控S1PR3表达。S1PR3为G蛋白偶联受体家族成员S1PR的亚型，S1PR与鞘磷脂产生的细胞内第二信使鞘特异性结合，调节细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移^[28-29]。研究发现S1PR3在肺腺癌中高表达，其敲低可显著抑制肿瘤的生长和肺转移，而过表达可促进动物中人肺腺癌细胞的生长^[30]。Wang等^[31]报道S1PR3敲低有效减少了小鼠体内乳腺癌细胞的生长和肺转移，SPHK1/S1P/S1PR3信号传导促进起始和转移相关乳腺癌肿瘤干细胞的形成。同时S1PR3可通过激活PI3K/AKT信号促进内皮祖细胞增殖，减少H₂O₂诱导的内皮祖细胞凋亡^[32]。而PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤干细胞干性的重要信号通路之一^[33]。综上提示，miR-142-3p负靶向S1PR3抑制膀胱癌干细胞干性可能是通过PI3K/AKT信号通路，因此实验采用Western Blot检测miR-142-3p mimic转染膀胱癌干细胞中PI3K/AKT信号通路关键蛋白pPi3k和pAkt的表达，发现过表达miR-142-3p可抑制pPi3k和pAkt蛋白的表达，表明miR-142-3p通过负靶向调控S1PR3基因下调PI3K/AKT通路抑制膀胱癌干细胞的干性。

综上所述，miR-142-3p在膀胱癌干细胞中的表达下调，过表达miR-142-3p可显著抑制膀胱癌干细胞的增殖、转移及体内成瘤能力。该过程可能是miR-142-3p通过负靶向调控S1PR3下调PI3K/AKT信号通路，实现对膀胱癌干细胞干性的抑制作用。研究揭示了miR-142-3p调控膀胱癌干细胞的干性功能与作用机制，具有治疗膀胱癌的应用前景。