长链非编码RNA H19促进胃癌干细胞的增殖和转移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1647

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2022-2027.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1647

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长链非编码RNA H19促进胃癌干细胞的增殖和转移

夏荣钧¹，欧英富¹，邢维山²，郑琳琳¹，于生金¹，林黎娟¹

¹辽东学院分子医学研究室，辽宁省丹东市 118000；²丹东市第一医院肿瘤内科，辽宁省丹东市 118000

修回日期:2018-12-20 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 林黎娟，博士，教授，辽东学院分子医学研究室，辽宁省丹东市 118000
作者简介:夏荣钧，男，1978年生，汉族，2008年大连医科大学毕业，实验师，主要从事基础医学研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金项目(201402081)，项目负责人：夏荣钧

Long non-coding RNA H19 promotes proliferation and invasion of gastric cancer stem cells

Xia Rongjun¹, Ou Yingfu¹, Xing Weishan², Zheng Linlin¹, Yu Shengjin¹, Lin Lijuan¹

¹Department of Molecular Medicine, Eastern Liaoning University, Dandong 118000, Liaoning Province, China; ²Department of Medical Oncology, Dandong First Hospital, Dandong 118000, Liaoning Province, China

Revised:2018-12-20 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Lin Lijuan, MD, Professor, Department of Molecular Medicine, Eastern Liaoning University, Dandong 118000, Liaoning Province, China
About author:Xia Rongjun, Experimentalist, Department of Molecular Medicine, Eastern Liaoning University, Dandong 118000, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 201402081 (to XRJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
长链非编码RNAs：是一类长度约为200个核苷酸分子的非编码RNA，不具有编码蛋白质的功能，在转录、转录后水平及表观遗传学等多种层面上调控蛋白的表达，参与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移等各种恶性生物学行为，近年来在肿瘤领域中为研究热点。
肿瘤干细胞标志基因Sox2：是胚胎发育的关键转录因子，在干细胞形成过程中起着关键的作用，其处于肿瘤干细胞信号调控网络的中心，不仅可调控肿瘤干细胞相关基因Nanog、Oct-3/4、Utf1、Fgf-4及Lefty1的表达，还对维持肿瘤干细胞自我更新、多向分化等干性发挥重要作用，其被确定为致癌基因，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

摘要
背景：研究发现，干扰长链非编码RNA H19的表达，可以降低胃癌细胞系MGC-803肿瘤球细胞的成瘤能力、增殖和克隆形成能力，而H19在胃癌中是否能通过影响肿瘤干细胞关键标志物Sox2的表达进而调控胃癌干细胞尚不清楚。
目的：研究长链非编码RNA H19在胃癌组织及胃癌干细胞中的表达水平，并探讨其对胃癌干细胞增殖和转移的影响及作用机制。
方法：qRT-PCR检测H19在38例胃癌组织、癌旁组织、胃癌干细胞CSC-G、人永生化正常胃上皮细胞GES-1中的表达；经脂质体分别转染H19 siRNA(si-H19)和阴性对照siRNA(si-NC)48 h后，软琼脂克隆形成实验、MTS实验、Transwell实验检测CSC-G细胞干性、增殖和转移能力，Western blot检测CSC-G细胞中Sox2蛋白的表达。
结果与结论：①qRT-PCR结果显示H19在胃癌组织中的表达显著高于其配对的癌旁组织，且在肿瘤T分期高及有淋巴结转移的组织中高表达(P均< 0.05)，同时H19在CSC-G细胞中的表达显著高于GES-1细胞(P < 0.05)；②转染H19 siRNA后，CSC-G细胞软琼脂克隆球形成的数目显著减少，细胞增殖能力抑制、细胞侵袭能力减弱、Sox2蛋白表达减少(P均< 0.05)；③结果表明，H19在胃癌组织和胃癌干细胞中高表达，H19可能通过作用于干细胞相关蛋白Sox2促进胃癌干细胞的增殖和转移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6274-4772(夏荣钧)

关键词: 胃癌, 肿瘤干细胞, 长链非编码RNA H19, 细胞增殖, 细胞转移, 细胞侵袭, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that long non-coding RNA H19 can reduce the tumorigenic ability, proliferation and clonality of gastric cancer cell line MGC-803, and it is unclear whether H19 can regulate gastric cancer stem cells through changing the expression of Sox2, a key marker of tumor stem cells.
OBJECTIVE: To study the expression levels of long non-coding RNA H19 in gastric cancer tissues and gastric cancer stem cells, and to explore its effect on the proliferation and invasion of gastric cancer stem cells and its mechanism of action.
METHODS: qRT-PCR was used to detect the expression of H19 in lung cancer tissues and paracancerous tissues in 38 cases as well as in gastric cancer stem cells CSC-G and human immortalized normal gastric epithelial cells GES-1. After transfection of H19 siRNA (si-H19) and control (si-NC) for 48 hours by liposome, soft agar cloning assay was used to detect the effect of H19 expression on the stemness of CSC-G cells, MTS assay used to detect the effect of H19 downregulation on CSC-G cell proliferation, and Transwell assay used to detect the effect of H19 downregulation on CSC-G cell metastasis, and western blot assay used to detect the effect of H19 downregulation on Sox2 protein in CSC-G cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of qRT-PCR showed that the expression of H19 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in the matched paracancerous tissues, and it was highly expressed in tissues with high tumor T stage and lymph node metastasis (P < 0.05), while the expression of H19 in CSC-G cells was significantly higher than that in GES-1 cells (P < 0.05). (2) After transfection of H19 siRNA, the number of soft agar cloned spheres in CSC-G cells was significantly decreased, the cell proliferation and invasion abilities were inhibited and the expression of Sox2 protein was decreased (P < 0.05). In conclusion, H19 is highly expressed in gastric cancer tissues and gastric cancer stem cells. H19 may promote the proliferation and metastasis of gastric cancer stem cells by acting on the stem cell-associated protein Sox2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stomach Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Cell Proliferation, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

夏荣钧，欧英富，邢维山，郑琳琳，于生金，林黎娟. 长链非编码RNA H19促进胃癌干细胞的增殖和转移[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2022-2027.

Xia Rongjun, Ou Yingfu, Xing Weishan, Zheng Linlin, Yu Shengjin, Lin Lijuan. Long non-coding RNA H19 promotes proliferation and invasion of gastric cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2022-2027.

图/表（结果） 1

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引言

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，为全球癌症相关死亡率的第三大常见原因^[1]。尽管胃癌的治疗方法取得了一定进展，但胃癌患者的临床预后仍然很差，5年生存率低于30%^[2]。胃癌的发生与环境因素、遗传学、表观遗传学及关键调控因子的改变有关。研究发现，一些遗传和表观遗传的改变与胃黏膜细胞的恶性转化密切相关^[3]，近年来随着转录组学、表观基因组学及蛋白质组学等先进技术的发展，学者发现胃癌具有较强的异质性^[4]，使肿瘤的治疗更具有挑战性。肿瘤干细胞是一群数量微小，具有自我更新和增殖分化能力的强致瘤性特殊细胞亚群，是肿瘤的起源^[4]，同时也是导致肿瘤异质性和转移的首要原因^[5]。因此研究肿瘤干细胞的调控机制有望改善胃癌患者的预后。

长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs，LncRNAs)是一类长度约为200个核苷酸分子，与miRNA同属于非编码RNA，长链非编码RNAs虽然不具有编码蛋白质的功能，但是其可在转录、转录后水平及表观遗传学等多种层面上调控蛋白的表达，参与各种生物学行为^[6-8]。大量研究表明，异常表达的长链非编码RNAs参与各种疾病的发生，而其功能在肿瘤疾病领域中也成为研究热点^[9-10]。长链非编码RNA H19大量存在于胃癌及乳腺癌等多种肿瘤中，并在肿瘤发生发展中发挥重要作用^[11-12]，而且H19与乳腺癌、胶质瘤等肿瘤的干细胞表型密切相关，并通过调控肿瘤干细胞促进肿瘤的恶性行为^[13-14]。钟李锋^[15]研究发现干扰H19的表达，可以降低胃癌细胞系MGC-803肿瘤球细胞的成瘤能力、增殖和克隆形成能力，而H19在胃癌中是否能通过影响肿瘤干细胞关键标志物Sox2的表达进而调控胃癌干细胞尚不清楚，因此，该研究以胃癌组织样本和胃癌干细胞为研究对象，旨在探讨H19促进胃癌干细胞增殖和转移的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验性研究。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2017年12月在辽东学院分子医学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞 人胃癌干细胞CSC-G(美国ATCC细胞库)；人永生化正常胃上皮细胞GES-1(中国科学院上海细胞库)。

1.3.2 实验试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；H19 siRNA由瑞博公司合成(中国广州)；MTS(美国Promega公司)；蛋白裂解试剂(碧云天生物技术有限公司)；Transwell小室和蛋白浓度检测试剂BCA液(美国Thermo公司)；兔抗人Sox2抗体(ab97959，上海瓦兰生物科技有限公司)；鼠抗人GAPDH抗体(ab9484，南京赛泓瑞生物科技有限公司)。

1.3.3 临床样本 筛选出2014年1月至2017年1月期间入住丹东市第一医院的胃癌患者38例，男20例，女18例，平均年龄(53.58±19.35)岁。

纳入标准：首次手术病理证实为胃癌，具备完整的病历资料，已签署知情同意书。

排除标准：术前接受化疗、放疗、分子靶向等任何抗肿瘤治疗，合并其他肿瘤及严重威胁生命健康的疾病。

术中切除胃癌组织及大于癌组织5 cm以上的癌旁组织，立即冻存于-80 ℃液氮中。该实验遵循赫尔辛基宣言，所有操作由丹东市第一医院伦理委员会审核批准(审批号：20140622)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 人胃癌干细胞CSC-G用无血清培养基悬浮培养，人永生化正常胃上皮细胞GES-1用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。

1.4.2 qRT-PCR检测H19在胃癌组织和胃癌干细胞中的表达 研磨经液氮冻存的组织以及人胃癌干细胞CSC-G、人永生化正常胃上皮细胞GES-1，采用TRIzol法裂解并提取总RNA。设计合成H19引物F：5'-ATC GGT GCC TCA GCG TTC GG- 3'，R：5'-CTG TCC TCG CCG TCA CAC CG-3'。内参GAPDH引物F：5'-AGC CAC ATC GCT CAG ACA C-3'，R：5'-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3'，由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

将总RNA反转录为cDNA，以cDNA作为模板并进行荧光定量PCR。按两步法进行反应，每个样品设置3个反应复孔，分析各样品的循环阈值(Ct)，采用2^–ΔΔCt法分析H19的表达水平。

1.4.3 细胞转染 将对数生长的CSC-G细胞传代至6 cm培养皿中，按说明书将Lipofectamine 2000与H19 siRNA或阴性对照siRNA转染至细胞中，分别为si-H19组和si-NC组，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。

1.4.4 软琼脂克隆形成实验检测CSC-G细胞干性 1.2%软琼脂经高压灭菌后与20% RPMI1640培养基1∶1充分混匀后，每皿2 mL混合液铺至6 cm培养皿中作为底层胶，放置4 ℃冰箱中冷却至固态；同时将高压灭菌后的0.6%软琼脂与20% RPMI1640培养基1∶1充分混匀作为上层胶。取转染48 h后的各组CSC-G细胞以每孔1×10³个细胞、100 μL培养基与37 ℃预热的上层胶充分混匀后，铺至固态的底层胶上，放至培养箱中培养，每隔2 d在皿中加入1 mL培养基，肿瘤克隆球培养2周左右长至较大，显微镜下拍照。

1.4.5 MTS检测CSC-G细胞增殖情况 将转染48 h后的各组CSC-G细胞计数后接种于96孔板中，每孔1 000个细胞、150 μL培养基铺板，每组设置6个平行复孔，放置37 ℃培养箱中培养，分别在铺板后第0，1，2，3天时，每孔更换100 μL新鲜培养基并加入20 μL MTS工作液，在37 ℃细胞培养箱中孵育2 h后，酶标扫描仪490 nm波长处测吸光度值，吸光度值的大小与细胞的增殖能力成正比。

1.4.6 Transwell小室法检测CSC-G细胞转移能力 接种细胞前用50 μL PBS湿润Transwell小室聚碳酸酯微孔膜，无血清培养基清洗转染48 h的各组CSC-G细胞3次，计数，以每孔1×10⁵个细胞、100 μL无血清培养基接种于Transwell小室的上室，下室加500 μL完全培养基作为趋化因子，放至培养箱中培养，显微镜观察下室细胞穿过5个的时候终止培养，取出聚碳酸酯微孔膜，PBS洗3次，甲醇固定10 min，苏木精染色。显微镜下随机选取5个视野计数聚碳酸酯微孔膜下室面穿过的细胞，取其均值代表细胞转移能力。

1.4.7 Western blot检测CSC-G细胞Sox2蛋白表达 取转染48 h后的各组CSC-G细胞，PBS洗3次，每皿加入含有1 μL蛋白酶抑制剂和1 μL磷酸酶抑制剂的100 μL蛋白裂解液，-80 ℃冻存过夜，超声裂解20 min后12 000 r/min、4 ℃离心30 min，BCA试剂盒检测蛋白浓度，煮沸变性冷却后，以每孔50 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，将蛋白湿转至PVDF膜，8%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，加入Sox2一抗(1∶100)、GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，二抗(1∶8 000)室温孵育1 h，ECL化学发光法显示条带。

1.5 主要观察指标 ①qRT-PCR检测H19在胃癌组织和细胞系中的表达；②软琼脂克隆形成实验检测CSC-G细胞干性；③MTS检测CSC-G细胞增殖能力；④Transwell实验检测CSC-G细胞转移能力；⑤Western blot检测CSC-G细胞Sox2蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用统计软件SPSS 17.0进行分析，数据以x(_)±s表示，配对t 检验比较两组间的差异，单因素方差分析比较多组间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胃癌仍然是全球继肺癌、乳腺癌和结肠癌之后的第四大常见恶性肿瘤，预后较差，易发生侵袭和转移，严重影响患者生存质量和生命健康^[16-17]。研究发现多个癌种中均存在一类具有自我更新和分化能力等干细胞特性的细胞亚群，称为肿瘤干细胞，虽然肿瘤干细胞在肿瘤中仅是一小部分，但它被认为是肿瘤异质性、肿瘤发生、复发和转移的初始细胞^[18-19]。迄今为止，在乳腺癌、结肠癌和肝癌等大多数实体瘤中发现了肿瘤干细胞^[20-22]，同样运用一系列方法和表面标志物从胃癌细胞系或肿瘤组织中分离和鉴定出了胃癌干细胞^[23-24]，但对其潜在的调节机制知之甚少。非编码RNA的研究是新兴领域，与miRNA同属于该领域的长链非编码RNAs，因包括大约19 000种具有不同分子机制的RNA分子而备受关注^[25-26]。越来越多的数据表明长链非编码RNAs在肿瘤中表达失调，通过调控生物学信号通路或在基因转录后水平修饰关键基因参与促进肿瘤的增殖、侵袭和转移等恶性行为，具有促癌因子和抑癌因子双重作用^[27-29]，因此长链非编码RNAs是具有应用前景的肿瘤标志物和潜在的肿瘤治疗靶点。

H19是最早鉴定的长链非编码RNAs之一^[30]，编码H19的基因位于胰岛素样生长因子2(IGF2)基因附近的11号染色体的印迹区域，H19在胚胎发育过程中高表达，但出生后其在大多数组织中的表达被抑制^[31]。研究表明，H19在膀胱癌中被上调，并可作为早期癌症复发的预测标志物而引起癌症研究学者的关注^[32]。人们逐渐观察到H19在多种肿瘤包括胃癌中表达升高^[33]，H19在血浆水平的表达随着胃癌的切除而显著下降，可作为胃癌的潜在诊断标志物^[34]。该实验采用qRT-PCR检测H19在38例胃癌和癌旁组织的表达情况，结果显示H19在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，与其他研究结果一致，同时发现H19在胃癌组织中高表达与肿瘤T分期高及淋巴结转移相关，而Liu等^[35]也报道了H19依赖于miR-675促进Akt/mTOR信号通路增强胃癌AGS细胞的增殖和侵袭。肿瘤干细胞与肿瘤增殖转移密切相关，H19可以促进结直肠癌干细胞的干性^[21]，在肝癌中H19通过MAPK/ERK信号通路影响CD133⁺干细胞的氧化应激和化疗耐药能力^[22]。因此，H19是否可以调控胃癌干细胞成为研究热点。

实验首先验证H19在胃癌干细胞CSC-G中的表达显著高于人永生化正常胃上皮细胞GES-1，进一步采用目前公认基因敲减效果较好的小干扰RNA(si-RNA)技术转染CSC-G细胞^[36]，干扰H19表达后，CSC-G细胞软琼脂克隆形成能力、增殖能力、转移能力下降，表明H19参与胃癌干细胞的增殖和转移。为深入研究H19促进胃癌干细胞增殖和转移的机制，查阅文献发现肿瘤干细胞标志基因Sox2是胚胎发育的关键转录因子，在干细胞形成过程中起着关键的作用^[37-38]，其处于肿瘤干细胞信号调控网络的中心，不仅可调控肿瘤干细胞相关基因Nanog、Oct-3/4、Utf1、Fgf-4及Lefty1的表达，对维持肿瘤干细胞自我更新、多向分化等干性发挥重要作用，还被确定为致癌基因，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移^[39-40]。Sox2在舌鳞状细胞癌中表达显著上调，并且与肿瘤大小、细胞分化、淋巴结转移和临床分期显著相关，敲减细胞中Sox2之后，细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力降低，集落形成能力减弱^[41]。该研究中Western blot结果显示干扰H19的表达可降低Sox2蛋白的表达，表明H19可能通过作用于Sox2蛋白促进胃癌干细胞的增殖和转移。

综上所述，H19在胃癌组织和胃癌干细胞中高表达，并与肿瘤大小T分期、淋巴结转移显著相关，干扰H19的表达可能通过作用肿瘤干细胞标志基因Sox2抑制胃癌干细胞的增殖、侵袭和转移，H19可能作为治疗胃癌的干预靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

长链非编码RNA H19促进胃癌干细胞的增殖和转移

Long non-coding RNA H19 promotes proliferation and invasion of gastric cancer stem cells

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