超高效液相色谱-串联质谱法测定辅助生殖用培养液中谷氨酰胺的含量

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1617

摘要/Abstract

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文题释义：

人类辅助生殖技术：指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精和体外受精-胚胎移植及其衍生技术2大类。

辅助生殖用培养液：是含有能量成分、渗透压调节成分、酸碱度调节成分、氨基酸、生长因子等，保证生殖细胞在体外可以存活并成长的一种培养液。不同的体外生殖细胞使用不同的培养液，在不同的生长阶段也会使用不同的培养液，因此体外生殖培养液的成分对最终体外生殖手术的成功率有很大影响。

背景：应用高效液相色谱-串联质谱法检测生物样本中氨基酸含量具有样品处理简单、分析时间短、高选择性、高灵敏度等优势，但目前该方法主要用于脑透析液、尿液及血清中谷氨酰胺含量的测试。

目的：采用超高效液相色谱-串联质谱法测定辅助生殖用培养液中的谷氨酰胺含量。

方法：采用超高效液相色谱-串联质谱仪，色谱柱为SUPELCO Discovery HS F5-3(15 cm×2.1 mm，3 μm)，柱温40 ℃，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.35 mL/min；电喷雾离子化源负离子模式扫描，采用多反应监测模式检测谷氨酰胺含量。

结果与结论：谷氨酰胺在0.123 7-24.74 mg/L范围内线性关系良好(r=0.999 7)，平均回收率为102.9%-108.2%，相对标准偏差RSD为2.3%-4.9%，谷氨酰胺定量限为9.76 µg/L。将受精培养液(含谷氨酰胺)在37 ℃下放置24，96 h的谷氨酰胺含量较原液分别下降了6%和15%。结果说明采用高效液相色谱-串联质谱法检测辅助生殖用培养液中的谷氨酰胺含量，操作简单，不需要对样品进行衍生化处理，方法专属性、准确性及灵敏度良好，且测试时间短，可用于辅助生殖用培养液的质量控制，研究添加成分谷氨酰胺的降解而产生的临床风险。

ORCID: 0000-0002-3817-6445(柯林楠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 辅助生殖用培养液, 谷氨酰胺, 氨, 超高效液相色谱-串联质谱, 质量控制, 降解, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for analyzing amino acids in biological samples is simple in sample preparation with a short analysis time, and has high sensitivity and specificity. Until now, it is only applied in analyzing glutamine contents in dialysate, urine and plasma.

OBJECTIVE: To establish a method for determining glutamine concentration in human assisted reproductive media by UPLC-MS/MS.

METHODS: The UPLC separation was performed on a SUPELCO Discovery HS F5-3 column (15 cm×2.1 mm, 3 μm) at 40 ^oC. The mobile phase was acetonitrile and water (both containing 0.1% formic acid) in a gradient elute mode. The flow rate was 0.35 mL/min. Electrospray ionization with a negative-ion and multiple reaction monitoring mode was used.

RESULTS AND CONCLUSION: The linearity was achieved in the range of 0.123 7-24.74 mg/L for glutamine (r=0.999 7). The recoveries were 102.9%-108.2% with the range 2.3%-4.9% for the relative standard deviation. The limit of qualification was 9.76 µg/L. The fertilization culture medium containing glutamine was incubated at 37 ^oC for 96 hours, in which the glutamine content declined 6% at 24 hours and 15% at 96 hours respectively compared with initial content. Therefore, the method is simple, specific, accurate and sensitive without sample derivation, and the test time is short. It is suitable for the quality control of human assisted reproductive media and useful for the risk study related to the degradation of glutamine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Reproductive Techniques, Assisted, Glutamine, High Pressure Liquid, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318.6

柯林楠，黄元礼，方玉，王春仁. 超高效液相色谱-串联质谱法测定辅助生殖用培养液中谷氨酰胺的含量[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(10): 1594-1598.

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图/表（结果） 2

2.1 专属性实验分别取空白溶液(不含谷氨酰胺)、对照品溶液和供试液各1 μL注入高效液相色谱-质谱联用仪器，依上述仪器条件进行检测，记录总离子流图，见图1。谷氨酰胺的保留时间为1.302 min，结果表明供试液中谷氨酰胺没有受到其他成分的干扰。

2.2 线性范围谷氨酰胺在0.123 7-24.74 mg/L范围具有良好的线性关系，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y = 4×10^-6x+0.133 6，相关系数为0.999 7。

2.3 定量限谷氨酰胺主峰与噪音峰面积之比为10∶1时，记录谷氨酰胺浓度，确定定量限为9.76 µg/L。

2.4 精密度实验谷氨酰胺峰面积相对标准偏差RSD为2.8%，结果表明该方法重复性良好。

2.5 回收率实验谷氨酰胺回收率实验结果，见表1。根据文献报道，培养液中谷氨酰胺常用量在0.5-1 mmol/L之间(即73.08-146.15 mg/L)^[24]，回收率实验结果显示该方法能够满足培养液中谷氨酰胺测定的需要。

2.6 样品测试取样品，制备供试液，取供试液按方法中仪器条件进行测试，结果显示：受精培养液(Lot：20170703)中谷氨酰胺的质量浓度为129.01 mg/L，囊胚培养液(Lot：20170703) 中谷氨酰胺的质量浓度为11.67 mg/L，一步培养液(Lot：20171016) 中谷氨酰胺的质量浓度为 87.74 mg/L，卵裂培养液(Lot：20171016) 中谷氨酰胺的质量浓度为141.46 mg/L。

将受精培养液(Lot：20170703)在37 ℃下放置24， 96 h分别取样品，按照1.4.4方法处理后，采用高效液相色谱-质谱联用法对样品进行测试。结果发现，24 h后谷氨酰胺质量浓度为120.9 mg/L，96 h后谷氨酰胺质量浓度为109.1 mg/L，较之原液含量分别下降了6%和15%。

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引言

作为直接接触、保存并培养配子、胚胎的介质，辅助生殖用培养液不仅可以为细胞提供保护和营养，还可以保证细胞活力，提高术后胚胎成活率^[1]。目前商品化的辅助生殖用培养液配方中大都含有无机盐、碳水化合物、氨基酸、蛋白质、抗生素等^[2-5]。在体外受精-胚胎移植的不同阶段会接触不同种类的辅助生殖用培养液，它的质量不仅直接决定胚胎的健康，而且影响后代的健康^[6-8]，因此辅助生殖用培养液的安全性、有效性和稳定性受到越来越多的关注^[9]。目前很多国家监管部门都出台了相关的文件，比如国家食品药品监督管理总局医疗器械审评中心发布了《人类体外辅助生殖技术用液注册技术审查指导原则》^[10]，欧盟有《Guidelines for conformity assessment of In Vitro Fertilisation(IVF) and Assisted Reproduction Technologies (ART) products》^[11]，这些文件都关注到了辅助生殖用培养液中成分的质量控制。一些氨基酸，例如谷氨酰胺，作为细胞培养的能量和氮来源常被加入培养液中，但是它在溶液中很不稳定，辅助生殖用培养液在37 ℃下放置一段时间，谷氨酰胺会逐渐降解成氨，过多的氨会对囊胚形成、胚胎存活和发育不利，产生毒害^[12-14]。研究谷氨酰胺降解规律，减少氨的积累，控制辅助生殖用培养液的质量，对于保证该类产品的安全有效至关重要，因此有必要建立辅助生殖用培养液中谷氨酰胺含量的测定方法。

目前氨基酸测定方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氨基酸分析法(amino acid analyzer，AAA)及超高效液相色谱-质谱联用法(ultrahigh performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等^[14-19]。前2种方法都需要对样品进行衍生化处理，分析时间较长，每个样本测试时间约为1 h，分析效率较低，而且辅助生殖用培养液中其他氨基酸容易影响谷氨酰胺的分离，造成很难准确定量。有研究报道用酸水解样品，使样品中的谷氨酰胺转化成谷氨酸，对谷氨酸定量，然后换算成谷氨酰胺，但酸水解操作不仅增加了处理时间，而且还会带来定量误差。采用高效液相色谱-质谱联用法检测氨基酸时，充分整合液相色谱对复杂样品的分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度等，在生物样本中应用具有优势。目前该方法主要用于脑透析液、尿液及血清中谷氨酰胺含量测试^[20-22]，还没有用于辅助生殖用培养液中谷氨酰胺含量测试的报道。培养液与脑透析液、尿液及血清相比，在组成成分及含量上存在着较大差别。研究采用超高效液相色谱-质谱联用法对辅助生殖用培养液中谷氨酰胺含量进行测定，并对其方法学进行验证，为该类产品质量控制和安全性评价提供方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计建立评价测试方法。

1.2 时间及地点实验于2018年3月在中国食品药品检定研究院完成。

1.3 材料

实验仪器：岛津公司LCMS-8050三重四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源；岛津公司LC-30A超高效液相色谱仪，包括LC-30AD×2输液泵、DGU-20A5在线脱气机、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A系统控制器；Sartorius公司 CP225D 电子天平；Sigma公司1-14离心机；密理博公司纯水仪。

实验试剂及试样：谷氨酰胺对照品(中国食品药品检定研究院，批号：140705-201403，含量99.7%)；乙腈(Fisher Scientific公司，色谱纯)；甲酸(MERCK公司，色谱纯)；含谷氨酰胺的辅助生殖用培养液：囊胚培养液(Lot：20170703)、受精培养液(Lot：20170703)、一步培养液(Lot：20171016)、卵裂培养液(Lot：20171016)；不含谷氨酰胺的辅助生殖用培养液：受精培养液(Lot：20180315)。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件色谱柱：SUPELCO Discovery HS F5-3 (15 cm×2.1 mm，3 μm)；流动相：体积分数为0.1%甲酸水溶液(A)-体积分数为0.1%甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序：0-1.4 min，0%B；1.4-3.5 min，0%-25%B；3.5- 6.0 min，25%-95%B；6.0-8.0 min，95%B；8.0-8.1 min，95%-0%B；8.1-12.0 min，0%B；流速：0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量：1 μL。

1.4.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源；离子检测方式：多反应监测；离子极性：负离子；离子源接口电压：-3.0 kV；雾化气：氮气，3.0 L/min；干燥气：氮气，10 L/min；加热气：空气，10 L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃，接口温度：300 ℃；谷氨酰胺的质谱分析条件参数：成分，谷氨酰胺；定量离子(m/z)，145.20>127.15；Q1电压，27 V；碰撞能量，14.0 eV；Q3电压，30 V。

1.4.3 对照品系列溶液制备将谷氨酰胺对照品储备液用水依次稀释，配制成质量浓度为0.1237，1.237，4.950，12.37，19.79，24.74 mg/L的对照品系列溶液。

1.4.4 供试品溶液制备取样品300 μL，加600 μL乙腈沉淀样品中的蛋白，混匀后，15 000 r/min离心15 min，取上清液作为供试液。如上清液中谷氨酰胺浓度过高，将溶液加水稀释至浓度在对照品系列溶液浓度范围内。

1.4.5 专属性实验分别取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液(不含谷氨酰胺的辅助生殖用培养液)进行测试，得到总离子流图，分析样品的专属性。

1.4.6 线性范围精密吸取谷氨酰胺对照品系列溶液，分别进样，记录峰面积。以对照品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

1.4.7 定量限取谷氨酰胺对照品溶液逐级稀释，至主峰与噪音峰面积之比为10∶1(即信噪比S/N=10/1)时，得到谷氨酰胺的最低定量限(LOD)。

1.4.8 精密度实验分别取受精培养液(Lot：20170703)6份，按1.4.4项下方法操作制备供试液，按上述仪器条件进样测定，根据谷氨酰胺峰面积，计算峰面积相对标准偏差。

1.4.9 回收率实验取受精培养液(不含谷氨酰胺的辅助生殖用培养液，Lot：20180315)，分别加入不同量的谷氨酰胺对照品，配成高、中、低3种谷氨酰胺浓度的溶液，每种浓度配制3份。按1.4.4项下方法操作制备供试液，取供试液按上述仪器条件进行测定，计算回收率。

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讨论

在体外受精胚胎移植过程中，胚胎在不同阶段会接触不同种类的培养液，辅助生殖用培养液作为体外受精胚胎移植技术所需的医疗器械，其安全有效性必须得到控制。辅助生殖用培养液的配方研究及配制是一项非常复杂的工作，一方面要模拟人体的自然生理环境，为生殖细胞提供最优的生存环境；另一方面还要保证对胚胎、婴儿无不良影响。氨基酸作为胚胎培养过程中重要的调控因子，不仅是胚胎生物合成生长所需的重要成分，同时还参与碳水化合物代谢、渗透压及细胞内pH值的调节等。胚胎代谢氨基酸程度的不同，以及代谢种类的不同，都会导致不同的妊娠结局。

作者采用超高效液相色谱-串联质谱法分析辅助生殖用培养液中的谷氨酰胺含量，分离时间短，专属性强，即使在色谱柱中谷氨酰胺与其他氨基酸无法完全分离，在质谱检测器中，谷氨酰胺也不会受到其他氨基酸的干扰；同时，不需要对氨基酸衍生化处理，简化了操作过程，在提高了定量准确性的同时，也大幅缩短了检测时间。同时，由于其兼顾了液相的特点，测试范围宽，样品稀释倍数较少，在提高了定量准确性的同时，也大幅缩短了检测时间。该方法取样量仅为1 μL，取样量小，适合胚胎培养过程中实时监测，为配方筛选及改进提供帮助，更适合于在胚胎培养中连续取样分析。

辅助生殖用培养液中成分比较复杂，有的含有蛋白质，如果不预先除掉蛋白质，直接进样，容易堵塞系统，降低柱效，影响分离。实验室曾经考察了磺基水杨酸和乙腈对蛋白的处理效果，分别采用磺基水杨酸、乙腈对样品中蛋白进行沉淀分离，取上清液测试。结果发现样品经磺基水杨酸处理后，回收率低，分析原因可能是谷氨酰胺在水溶液中不稳定，磺基水杨酸在沉淀蛋白质的过程中加速了谷氨酰胺的降解。实验最终选定乙腈沉淀蛋白质。

研究将受精培养液在37 ℃下放置，按照建立的方法测试了辅助生殖用培养液中的谷氨酰胺含量，结果发现，随着时间的延长，谷氨酰胺含量下降，文献报道谷氨酰胺和蛋白质的降解都会造成氨的积累^[23]。实验结果提示，在辅助生殖用培养液中添加谷氨酰胺要慎重。有必要对谷氨酰胺的降解规律、氨对胚胎植入前各生长阶段的影响，以及辅助生殖用培养液中氨的允许限量等方面进行深入研究，用以辅助生殖用培养液中配方设计，产品的效期、保存条件的确定，从而确保辅助生殖用培养液的安全。

辅助生殖用培养液中还含有蛋白质、抗生素、抗凝剂、维生素及无机盐类，各种物质联合起到促进细胞和胚胎发育、保持活力等多种作用。此次实验仅检测辅助生殖用培养液配方中的谷氨酰胺，主要为控制其降解产生氨带来的潜在风险。目前国内外辅助生殖培养液质量技术标准中对成分含量的指标及检测方法未进行明确要求，今后有必要在后续工作中逐步建立辅助生殖用培养液中其他物质的含量测定方法，并尽早建立相关的质量技术标准，从而对辅助生殖用培养液进行有效质量控制，提高辅助生殖技术的成功率。

研究所建立的辅助生殖用培养液中谷氨酰胺含量测定方法，方法学验证结果表明该方法的专属性、准确性良好，灵敏度高，操作简便，不需对氨基酸衍生化处理。样品中如含有蛋白质，只需简单的蛋白沉淀处理，即可上机测试。由于该方法测试时间短且样品用量少，可用于辅助生殖用培养液的质量控制，还可用于胚胎培养过程中连续、实时监测，考察胚胎培养过程中参数动态变化情况，研究谷氨酰胺降解规律，减少辅助生殖用培养液中氨积累带来的潜在临床风险。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程