红细胞生成素预处理脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病肾病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1601

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1370-1376.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1601

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红细胞生成素预处理脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病肾病

王迪生，孔刘莎，王佳，李霞

徐州医科大学附属医院肾脏内科，江苏省徐州市 221002

修回日期:2018-11-04 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 李霞，主任医师，徐州医科大学附属医院肾脏内科，江苏省徐州市 221002
作者简介:王迪生，男，1979 年生，江苏省徐州市人，汉族，2011年徐州医学院毕业，硕士，主要从事干细胞增殖和分化方面的研究。
基金资助:
徐州市科技计划项目基金(KC15SH091)，项目负责人：李霞

Erythropoietin preconditioned adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treating diabetic nephropathy in rats

Wang Disheng, Kong Liusha, Wang Jia, Li Xia

Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Revised:2018-11-04 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Li Xia, Chief physician, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Wang Disheng, Master, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan Foundation of Xuzhou, No. KC15SH091 (to LX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪间充质干细胞定向趋化：脂肪间充质干细胞在炎症和损伤因子的诱导下具有靶向归巢的能力，能够优先归巢到损伤的组织器官或者炎症位点，参与治疗修复受损组织器官。正是基于脂肪间充质干细胞以上特性，使其在临床上具有广泛的应用前景。
红细胞生成素：是一种糖蛋白激素，通过红细胞生成素受体控制骨髓中的红细胞生成，神经元、内皮细胞、心肌细胞和肾小管细胞均能表达红细胞生成素受体并对红细胞生成素处理作出反应。与其他旨在提高干细胞治疗效果的预处理或改进策略相比，红细胞生成素的体外预处理在临床可行性方面具有显著优势，但其具体机制仍需探究。

摘要
背景：研究证实，糖尿病肾病的发生、发展与肾小管上皮细胞转分化及肾间质纤维化密切相关。
目的：探讨红细胞生成素干预的脂肪间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制。
方法：获取和培养人脂肪间充质干细胞并进行多向分化能力鉴定；采用Transwell体外迁移体系，观察不同浓度红细胞生成素(0，5，20，50 IU/mL)对脂肪间充质干细胞向高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞系迁移的影响；将48只SD大鼠(徐州医学院动物实验中心提供)随机分为正常对照组、糖尿病模型组、脂肪间充质干细胞组、脂肪间充质干细胞+20 IU/mL红细胞生成素组，每组12只。经尾静脉注射150 μL细胞总数为3.5×10⁵个脂肪间充质干细胞或20 IU/mL红细胞生成素干预的脂肪间充质干细胞，14周后采用Western blot检测肾组织中转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白、基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂1的表达。
结果与结论：①红细胞生成素干预使脂肪间充质干细胞的迁移数量明显增加且呈浓度依赖性(P < 0.05)，以20 IU/mL浓度最为显著；NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1蛋白表达趋势与脂肪间充质干细胞迁移趋势基本一致；②与糖尿病模型组比较，脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞+20 IU/mL红细胞生成素组转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白及基质金属蛋白酶抑制剂1蛋白表达均显著下降(P < 0.05)，E-钙黏蛋白、基质金属蛋白酶9蛋白表达显著上升(P < 0.05)，且脂肪间充质干细胞+红细胞生成素组变化更明显(P < 0.05)；③结果表明，红细胞生成素可以促进脂肪间充质干细胞的定向趋化，且在红细胞生成素作用下脂肪间充质干细胞可以更好地抑制肾小管上皮细胞转分化，减轻细胞外基质沉积，延缓糖尿病肾纤维化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1563-6813(李霞)

关键词: 糖尿病肾病, 脂肪间充质干细胞, 红细胞生成素, 糖尿病模型, 肾小管, 肾间质纤维化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that the occurrence and development of diabetic nephropathy are related to tubular epithelial cell transdifferentiation and renal interstitial fibrosis.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of erythropoietin preconditioned adipose-derived mesenchymal stem cells on diabetic nephropathy rat’s kidney and to evaluate its potential mechanisms.
METHODS: Human adipose-derived mesenchymal stem cells were harvested and identified for cell multilineage differentiation. TranswelI migration system was used to observe the effects of erythropoietin of different concentrations (0, 5, 20, 50 IU/mL) on the migration of adipose-derived mesenchymal stem cells to high glucose-induced rat renal tubular epithelial cell lines. Forty-eight Sprague-Dawley rats (provided by the Animal Experimental Center of Xuzhou Medical University in China) were randomly divided into normal control, diabetic model group, cell transplantation group and erythropoietin preconditioning group (n=12 per group). Adipose-derived mesenchymal stem cells (3.5×10⁵, 150 μL) alone or erythropoietin (20 IU/mL) preconditioned adipose-derived mesenchymal stem cells were injected into the tail vein of rats in the latter two groups, respectively. The protein levels of transforming growth β1, α-smooth muscle actin, E-cadherin, matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase inhibitor-1 in the renal tissues were detected by western blot assay at 14 weeks after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Erythropoietin preconditioning markedly increased the number of migrated adipose-derived mesenchymal stem cells in a concentration-dependent manner (P < 0.05), and the ability peaked at a concentration of 20 IU/ml. The expression of stromal cell-derived factor-1 protein in NRK-52E cells was consistent with the migration trend of adipose-derived mesenchymal stem cells. Compared with the diabetic model group, the levels of transforming growth β1, α-smooth muscle actin, and matrix metalloproteinase inhibitor-1 were increased dramatically, while the levels of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 decreased remarkably in the other groups (P < 0.05), especially in erythropoietin preconditioning group (P < 0.05). In conclusion, erythropoietin could promote the directional chemotaxis of adipose-derived mesenchymal stem cells, and moreover, adipose-derived mesenchymal stem cells could inhibit the transdifferentiation of renal tubular epithelial cells, reduce the deposition of extracellular matrix and delay the progression of diabetic renal fibrosis under the action of erythropoietin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Diabetic Nephropathies, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Erythropoietin, Tissue Engineering

中图分类号:

王迪生，孔刘莎，王佳，李霞. 红细胞生成素预处理脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病肾病[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1370-1376.

Wang Disheng, Kong Liusha, Wang Jia, Li Xia. Erythropoietin preconditioned adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treating diabetic nephropathy in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1370-1376.

图/表（结果） 2

2.1 ADMSCs的形态及多向分化能力 体外培养的第3代ADMSCs为贴壁细胞，呈成纤维细胞样梭形，见图1A；成骨诱导培养基诱导21 d，茜素红染色后倒置相差显微镜下可见红色钙盐沉积颗粒，见图1B；成脂诱导培养基诱导21 d，油红O染色后倒置相差显微镜下可见红色脂滴，见图1C。

2.2 ADMSCs体外趋化及NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1表达水平 显微镜下紫色为迁移的ADMSCs，模拟的高糖环境对ADMSCs有趋化效应，EPO干预使ADMSCs的迁移数量明显增加且呈浓度依赖性(P < 0.05)，以20 IU/mL浓度最为显著，但进一步增加EPO浓度(50 IU/mL)，则对ADMSCs迁移数无明显影响(P > 0.05)，见图2；NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1蛋白表达趋势与ADMSCs迁移趋势基本一致，见图3。

2.3 免疫印迹法检测肾组织中相关蛋白的表达 正常对照组的转化生长因子β1蛋白表达微弱；糖尿病肾病组转化生长因子β1的蛋白表达明显增加(P < 0.05)，ADMSCs组和ADMSCs+EPO组与糖尿病肾病组相比，转化生长因子β1蛋白表达下降(P < 0.05)，且ADMSC+EPO组下降更为显著(P < 0.05)。α-平滑肌肌动蛋白表达趋势与转化生长因子β1蛋白表达趋势相似。正常对照组表达一定量的E-钙黏蛋白，糖尿病肾病组E-钙黏蛋白表达水平明显下降(P < 0.05)，而在ADMSCs和ADMSCs+EPO干预下E-钙黏蛋白表达上调(P < 0.05)，且ADMSCs+EPO组上调更为明显(P < 0.05)，见图4。

基质金属蛋白酶抑制剂1在糖尿病肾病组表达较正常对照组明显增多(P < 0.05)，而在ADMSCs组及ADMSCs+ EPO组表达较糖尿病肾病组显著减少(P < 0.05)，且在ADMSCs+EPO组减少更为明显(P < 0.05)。糖尿病肾病组基质金属蛋白酶9表达较正常对照组显著下降(P < 0.05)，ADMSCs组及ADMSCs+EPO组基质金属蛋白酶9表达有所上调(P < 0.05)，且ADMSCs+EPO组上调更明显(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 对比观察细胞及动物实验。

1.2 时间及地点 2016年10月至2017年7月在徐州医科大学中心实验室完成。

1.3 材料 脂肪取自徐州医科大学附属医整形外科、甲乳外科。经医院伦理委员会批准，入选供者年龄23-45岁，排除传染性、皮肤病，供者对实验过程完全知情同意。

实验动物：8周龄健康、雄性、无特定病原体(SPF)级SD大鼠48只，体质量200-250 g，购自徐州医科大学动物实验中心。

细胞与试剂：大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)株(美国ATCC公司)；Transwell小室(孔径8 μm，美国Constar公司)；胎牛血清、低糖DMEM培养基、无糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；链脲素(美国Sigma公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)；兔抗大鼠基质细胞衍生因子1单抗、兔抗大鼠基质金属蛋白酶9多克隆抗体、兔抗大鼠基质金属蛋白酶抑制剂1抗体(美国Abcam公司)；兔抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体、兔抗大鼠转化生长因子β1抗体、兔抗大鼠E-钙黏蛋白多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；β-actin、GAPDH(北京中杉金桥生物技术有限公司)；NBT/NCIP显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 ADMSCs的分离与培养 经患者同意后取择期手术患者皮下脂肪组织，无钙镁磷酸盐缓冲液冲洗3次，眼科剪和眼科镊除去脂肪组织膜和血管并剪成碎块，0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰酶37 ℃消化40 min后加入完全培养基，1 500 r/min离心20 min，弃上清去悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，24 h后换液除去未贴壁细胞，之后每3 d换液，细胞融合后用0.25%胰酶和1 mmol/L EDTA 37 ℃消化3-5 min，加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1∶2的比例传代。

1.4.2 ADMSCs的诱导分化 培养第3代ADMSCs达到70%-80%融合后，更换为成骨或成脂诱导培养基，每3 d或4 d换液1次，诱导3周后应用茜素红S染色法检测成骨分化后钙沉积情况，油红O染色法检测成脂分化后脂肪囊泡存在情况。

1.4.3 Transwell小室建立细胞共培养体系 ADMSCs于上层Transwell小室中以DMEM/F12培养基培养，接种密度为1.5×10⁵/室，NRK-52E细胞于下室6孔板中以DMEM高糖培养基培养，接种密度为4×10⁵/室。实验分为6组：①对照组：上室内为ADMSCs，下室内为单纯含体积分数为20%胎牛血清的低糖DMEM培养基；②ADMSCs+NRK-52E共培养组：上室内为ADMSCs，下室内为未经葡萄糖处理的NRK-52E细胞；③-⑥ADMSCs+30 mmol/L葡萄糖处理的NRK-52E细胞+不同浓度EPO干预组：上室内为ADMSCs，下室内为30 mmol/L葡萄糖处理的NRK-52E细胞，加入不同浓度的EPO(0，5，20，50 IU/mL)^[13]，各组共培养72 h。

1.4.4 ADMSCs迁移数量 共培养结束后，取出Transwell小室，棉签轻拭Transwell微孔膜上层细胞，微孔膜下细胞进行染色：PBS清洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，1%结晶紫染色30 min，PBS清洗至无紫色为止，显微镜下观察每张滤膜并随机计数5个视野下细胞数，取均值。每组设定6个复孔。

1.4.5 免疫印迹法检测NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1蛋白表达水平 各组细胞共培养结束后移去Transwell小室，提取各组下室NRK-52E细胞的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，将各组配平成相同浓度后，经电泳、转膜、封闭后，进行抗体孵育，以NBT/BCIP碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，结果扫描。用Image J医学图文分析系统分析图像，测定其吸光度值。以GAPDH为参照，测定基质细胞衍生因子1蛋白的相对表达量。

1.4.6 动物模型建立与分组 采用随机数字表法将48只SD大鼠分为正常对照组12只和造模组36只。适应性喂养1周后，禁食12 h，采用链脲佐菌素55 mg/kg一次性腹腔注射，正常对照组予以腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。72 h后尾静脉采血，测随机血糖，数值大于16.7 mmol/L证明糖尿病模型成功^[14]。将造模成功4周末的大鼠随机分为糖尿病肾病对照组、ADMSCs组、ADMSCs+EPO组，每组12只，经尾静脉一次性注射150 μL细胞总数为3.5×10⁵个的ADMSCs或EPO干预ADMSCs(EPO浓度为20 IU/mL，促进ADMSCs迁移的最佳浓度)，正常对照组及糖尿病肾病组尾静脉注射等量生理盐水，治疗14周后断颈处死大鼠，取肾组织。

1.4.7 免疫印迹法检测肾组织中相关蛋白的表达 将-80 ℃保存的肾组织取出研磨至碎末状，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测总蛋白浓度，将各组配平为相同浓度后，经电泳、转膜、封闭后，进行抗体孵育，以NBT/BCIP碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，结果扫描。用 Image J 医学图文分析系统分析图像，测定其吸光度值。以β-actin为参照，检测转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白、基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂1蛋白的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①ADMSCs多向分化能力鉴定结果；②ADMSCs体外趋化能力及NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1表达水平；③Western blot检测转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白、基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂1的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以x(_)±s表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

糖尿病肾病是发生终末期肾脏病的最重要原因之一，肾小管间质纤维化是糖尿病肾病的主要病理特征，实验旨在探究EPO干预ADMSCs对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制。实验通过建立Transwell共培养模型，体外模拟高糖诱导的肾损伤微环境，并以不同浓度的EPO促进ADMSCs定向趋化并测定最佳浓度为20 IU/mL，将20 IU/mL EPO预处理的ADMSCs尾静脉注射入糖尿病大鼠模型，实验结果提示，EPO预处理的ADMSCs较单纯的ADMSCs可以更好地发挥抑制肾小管上皮细胞转分化，减少细胞外基质沉积，延缓糖尿病肾纤维化进展的能力，为干细胞更高效的应用于临床提供了新思路。

转化生长因子β1是糖尿病肾病发病机制中最重要的细胞因子之一，它不仅可以减少瞬时受体电位阳离子通道蛋白6的表达，加速肾小球纤维化的发展，还能促进肾小管上皮-间充质转分化^[15-16]，转化而来的间充质细胞表达成纤维细胞特异蛋白，进而加重细胞外基质沉积，导致肾间质纤维化^[17]。上皮-间充质转分化过程的特征是E-钙黏蛋白的丢失和α-平滑肌肌动蛋白的升高^[18-19]。该实验中正常的肾组织高度表达上皮细胞标志物E-钙黏蛋白，而作为血管平滑肌细胞的骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白几乎不表达，但在链脲素作用下，细胞上皮-间充质转分化启动，E-钙黏蛋白表达明显减少，α-平滑肌肌动蛋白及转化生长因子β1表达显著增加，标志着糖尿病肾病纤维化的发生。在ADMSCs和ADMSCs+EPO干预后，E-钙黏蛋白表达上调，α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1表达下调，且ADMSCs+EPO的作用更为显著。

基质金属蛋白酶是一组调节细胞外基质动态平衡的最重要锌依赖性蛋白酶，对细胞外基质有广泛的降解作用。器官纤维化时，基质金属蛋白酶会异常表达，以基质金属蛋白酶9最为重要，它通过降解肾脏组织明胶和基底膜胶原并激活其他基质金属蛋白酶，形成瀑布效应，从而减少细胞外基质积聚，发挥抗纤维化的作用^[20]。作为基质金属蛋白酶9抑制剂的促纤维化分子基质金属蛋白酶抑制剂1，其主要功能是调节基质金属蛋白酶9的分泌及活性。实验发现链脲佐菌素导致大鼠肾组织基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶抑制剂1的平衡紊乱，而ADMSCs+EPO有效调节了这一失衡现象。研究表明，高糖诱导的基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶抑制剂1比例失调不仅能上调肾小管上皮细胞Snaill蛋白水平，还可以增加转化生长因子β1表达^[21]，从而加速糖尿病肾病的进展。

ADMSCs凭其取材方便、丰富多量、多向分化及自我填充的生物学特性具有着非常广阔的应用前景。近年来的研究发现，ADMSCs 具有抗氧化应激、炎症作用，可以改善微血管损伤^[22-23]，对肾动脉狭窄的狭窄侧肾脏有保护作用。同时，ADMSCs在免疫调节、营养组织及改善肾小管细胞凋亡等方面拥有巨大的优势^[24-26]，能够促进组织修复，保护肾脏功能，改善纤维化^[27]。但是，ADMSCs作为移植细胞可以存留于各个血供丰富的脏器，包括肺、心、脑等，因而向损伤部位的迁移效率变得有限，无法发挥最佳的修复效能，因此，寻求有效促进ADMSCs归巢能力的方法是干细胞移植重建生理功能的关键着手点。近来的研究发现，部分的生长因子及细胞因子，如表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子，均可诱导干细胞迁移^[5^，^28]。此外，低氧或者缺氧环境也具有一定的促迁移作用^[29]。

EPO是一种由缺氧诱导因子家族诱导产生的多功能细胞因子超家族成员，可以通过降低组织的活性氧水平减轻心脏、肾脏及脑的缺血再灌注损伤^[30-32]，在抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化、氧化应激及细胞凋亡方面发挥一定作用^[33-35]。研究证实，低剂量的EPO可减轻肾切除后残余部分的肾脏及内皮损伤，促进血管重塑^[36]。此外，体外实验证明，EPO干预可增强急性肾损伤微环境下骨髓间充质干细胞的趋化效应^[37]，其机制可能与CXCR4轴下游MAPK磷酸化增强有关^[38]。

实验在高糖诱导的NRK-52E培养上清中加入不同浓度EPO干预，可观察到NRK-52E细胞内基质细胞衍生因子1水平有所上升，以20 IU/mL浓度最为显著，推测EPO是通过NRK-52E表面的EPO受体发挥作用^[39]，但存在一定的浓度限制性。同时，在EPO的干预下，ADMSCs向培养室的迁移数量进一步增加且趋势与基质细胞衍生因子1水平变化趋势一致。这一现象表明EPO对ADMSCs迁移能力的调控与增加基质细胞衍生因子1水平有关^[40]，虽然具体机制尚不明确有待进一步探究，但既往研究发现，EPO对间充质干细胞、内皮组细胞和神经干细胞迁移能力的调控与其激活PI3K、MAPK途径^[41-42]，提高基质金属蛋白酶的活性有关^[10]。

综上所述，通过体外实验发现EPO干预能够增强ADMSCs的趋化效应，可能与基质细胞衍生因子1水平增加相关，同时，在糖尿病肾病大鼠模型中证明EPO干预的ADMSCs可以更好地抑制肾小管上皮细胞转分化，减轻细胞外基质沉积，延缓肾纤维化进展的作用，为EPO联合干细胞治疗糖尿病肾病提供了实验基础与理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

红细胞生成素预处理脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病肾病

Erythropoietin preconditioned adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treating diabetic nephropathy in rats

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