脂肪干细胞移植修复急性挤压伤性肾损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1591

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪干细胞移植治疗肾脏损伤：脂肪干细胞移植后，能靶向性向肾脏损伤部位聚集，可以在肾脏损伤部位分化为肾小管上皮样细胞，还可以旁分泌或者内分泌多种免疫调节因子，具有调节免疫、抗凋亡、抗炎症等作用，从而促进肾小管结构和功能的恢复。
挤压综合征：是指人体四肢或躯干等肌肉丰富的部位遭受重物(如石块、土方等)长时间的挤压，在挤压解除后身体出现一系列的病理生理改变。临床上主要表现为以肢体肿胀、肌红蛋白尿、高血钾为特点的急性肾功能衰竭。

摘要
背景：脂肪干细胞具有易获取、易分离、创伤小、增殖速度快等优点。目前肾损伤的治疗手段较局限，脂肪干细胞可能会为其提供一个新的治疗途径。
目的：探讨脂肪干细胞移植对挤压伤性急性肾损伤大鼠肾功能的影响及其机制。

方法：体外复苏冻存的鼠脂肪干细胞并制备脂肪干细胞悬液，使用PKH-26对脂肪干细胞进行荧光标记。从66只SD大鼠(北京维通利华动物实验技术有限公司提供)中随机选取20只大鼠作为正常对照组；余46只大鼠钳夹双后肢近端建立挤压伤所致急性肾损伤病理模型，最终40只大鼠建模成功，随机分为模型组和脂肪干细胞组，每组20只。造模成功后6 h，模型组大鼠尾静脉注射20 μL生理盐水，脂肪干细胞组大鼠尾静脉注射20 μL PKH-26标记的脂肪干细胞(细胞浓度为3×10⁶ L^-1)，1次/d，连续3 d。移植后第1，3，14，21天检测各组大鼠血清肌酐和尿素氮水平。移植后第3，21天，取各组大鼠左肾组织进行苏木精-伊红染色、TUNEL染色、RT-PCR及Western blot检测。
结果与结论：①细胞移植后第1，3，14，21天，模型组大鼠血清肌酐和尿素氮水平均显著高于正常对照组(P < 0.05)，脂肪干细胞移植组大鼠血清肌酐和尿素氮水平显著低于模型组(P < 0.05)；②细胞移植后第3，21天，脂肪干细胞组和模型组大鼠肾脏损伤评分、肾脏细胞凋亡率显著高于正常对照组(P < 0.05)，脂肪干细胞组肾脏损伤评分、肾脏细胞凋亡率显著低于模型组(P < 0.05)；③细胞移植后第3，21天，模型组及脂肪干细胞组肾组织中bax及Caspase-3基因和蛋白相对表达水平均高于正常对照组(P < 0.01)；脂肪干细胞组肾组织中bax及Caspase-3基因和蛋白相对表达水平显著低于模型组(P < 0.05)；④结果表明，脂肪干细胞移植对挤压伤所致急性肾损伤具有明显的修复作用，其机制可能与脂肪干细胞参与调节bax和Caspase-3表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8025-2894(孙贺元)

关键词: 急性肾损伤, 挤压伤, 脂肪干细胞, 脂肪干细胞移植, 肾功能

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells have the advantages of easy access, easy separation, small trauma, and rapid proliferation. Current treatments for kidney injury are more limited, and adipose-derived stem cells may provide a new treatment route.
OBJECTIVE: To investigate the effects of adipose-derived stem cell transplantation on the kidney function of rats with acute kidney injury induced by crush injury in rats.
METHODS: Cryopreserved adipose-derived stem cells were recovered in vitro and cultured to prepare cell suspension following labeling with PKH-26. Twenty rats were randomly selected from 66 experimental Sprague-Dawley rats (provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) as normal control group. In the 40 of the remaining 46 rats, a pathological model of acute kidney injury caused by compression injury was successfully established by the use of forceps to double the proximal hind limbs. The 40 rat models were divided into model group and cell transplantation group, with 20 rats in each group. After 6 hours of modeling, the rats in the model group were given intravenous injection of normal saline (20 μL), and the rats in the cell group were given intravenous injection of PKH-26-labeled adipose-derived stem cells (20 μL, 3×10⁶/L), once a day for 3 continuous days. The levels of serum creatinine and urea nitrogen were measured in each group at 1, 3, 14 and 21 days after transplantation. The left kidney of the rats in each group was observed using hematoxylin-eosin staining, TUNEL staining, RT-PCR and western blot assay at 3 and 21 days after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The levels of creatinine and urea nitrogen in the serum of rats at 1, 3, 14 and 21 days after cell transplantation were significantly higher in the model group than the normal control group (P < 0.05) and cell transplantation group (P < 0.05). (2) At 3 and 21 days after cell transplantation, the scores on the kidney injury and apoptotic rate of kidney cells were ranked as follows: model group > cell transplantation group > normal control group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). (3) At 3 and 21 days after cell transplantation, the expressions of bax and Caspase-3 in the kidney tissue at mRNA and protein levels were significantly higher in the model group and cell transplantation than the normal control group (P < 0.01) as well as significantly higher in the cell transplantation group than the model group (P < 0.05). To conclude, adipose-derived stem cell transplantation has obvious repairing effect on acute kidney injury caused by crush injury, and its mechanism may be related to the involvement of adipose-derived stem cells in regulating the expression of bax and Caspase-3.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Kidney Diseases, Crush Syndrome, Adipose Tissue, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

孙贺元，闫渭清. 脂肪干细胞移植修复急性挤压伤性肾损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1364-1369.

Sun Heyuan, Yan Weiqing. Adipose-derived stem cell transplantation for acute kidney injury caused by crush injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1364-1369.

图/表（结果） 8

2.1 脂肪干细胞存活率及其PKH-26标记情况 接种24 h后脂肪干细胞开始贴壁并呈现出纤维细胞样外观；在培养48 h后细胞充分伸展为梭形，培养6 d后开始形成细胞集落，见图1A。PKH26标记脂肪干细胞发出红色荧光，标记后细胞生长状态良好，见图1B。脂肪干细胞随着复苏和培养时间的延长，其存活力逐渐增强，培养24，48，72 h及6 d的A₄₉₀值分别为0.59±0.03，0.68±0.03，0.79±0.04以及0.83±0.05。

2.2 造模大鼠挤压前后不同时间点血清肌酐及尿素氮水平 参与造模的40只大鼠血清肌酐和尿素氮水平显著高于挤压前，挤压后36 h大鼠血肌酐> 44 μmol/L，尿素氮> 8.9 mmol/L，由此可知造模成功，见表1。

2.3 脂肪干细胞移植后各组大鼠血清肌酐及尿素氮水平 与正常对照组相比，模型组大鼠血清肌酐和尿素氮水平均显著升高(P < 0.05)；脂肪干细胞组大鼠血清肌酐和尿素氮水平显著低于模型组(P < 0.05)，见表2和表3。

2.4 各组大鼠肾脏病理形态变化 与正常对照组相比，脂肪干细胞组和模型组大鼠肾脏损伤评分显著增高，脂肪干细胞组肾脏损伤评分显著低于模型组，见表4和图2。

2.5 各组大鼠肾脏细胞凋亡情况 与正常对照组相比，脂肪干细胞组与模型组肾脏细胞凋亡率显著升高；而脂肪干细胞组肾脏细胞凋亡率显著低于模型组，见表4和图3。

2.6 PKH-26标记脂肪干细胞存活和分布情况 正常对照组和模型组大鼠肾脏组织中未见有PKH-26标记的脂肪干细胞，脂肪干细胞组大鼠肾脏组织中可见较多的PKH-26标记的脂肪干细胞，见图4。

2.7 各组大鼠肾组织bax和Caspase-3基因相对表达水平 与正常对照组相比，脂肪干细胞组和模型组大鼠肾组织中bax和Caspase-3的基因相对表达水平显著升高；脂肪干细胞组肾组织中bax和Caspase-3基因相对表达水平显著低于模型组，见表5和图5。

2.8 各组大鼠肾组织bax和Caspase-3蛋白相对表达水平 与正常对照组相比，脂肪干细胞组和模型组大鼠肾组织中bax和Caspase-3的蛋白相对表达水平显著升高；脂肪干细胞组肾组织中bax和Caspase-3蛋白相对表达水平显著低于模型组，见表6和图6。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年7月至2018年4月在天津医科大学内分泌研究所实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞 冻存鼠脂肪干细胞购买于中国医学科学院。

1.3.2 实验动物 66只成年SD大鼠，七八周龄，体质量200-250 g，雌雄各半，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(津)2014-0002。所有大鼠饲养于室温25 ℃，湿度60%-70%的SPF环境下，大鼠自由饮水和采食。

1.3.3 实验试剂 胰蛋白酶(美国Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)；细胞培养箱(Heraeus Sepatech公司)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 体外复苏培养脂肪干细胞及PKH-26标记 将购买的液氮冻存的鼠脂肪干细胞迅速放入37 ℃恒温水浴箱中，在30 s内使其快速复苏，待细胞悬液完全融化后进行稀释、离心、弃上清、洗涤细胞等操作，然后用DMEM完全培养液重悬细胞，调整脂肪干细胞浓度为1×10⁹ L^-1，采用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活化能力。具体步骤：从培养箱中取出细胞，更换新的培养液，各孔加入5 g/L MTT试剂20 μL，振荡均匀，放入细胞培养箱培养4 h，然后弃掉各孔上清液，加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度值。对脂肪干细胞进行PKH-26荧光标记，显微镜下观察细胞形态和细胞标记情况。

1.4.2 建立挤压伤性急性肾损伤模型及分组干预 从66只SD大鼠中随机选取20只大鼠作为正常对照组，将剩余的46只大鼠麻醉后，向右侧颈内静脉插入导管用以追加液体和麻醉剂，向左侧颈内静脉插入导管用以采集血样；将大鼠仰卧于温毯上，双侧后肢外展平放并固定，用钳夹压迫大鼠双后肢(压迫质量>3 kg)，维持6.5 h。在此过程中如果有大鼠挣扎或者抬头动作，追加麻醉剂直至压迫解除3 h，整个过程维持大鼠直肠温度在37 ℃，建立大鼠挤压伤所致肾损伤模型。造模后每天监测血肌酐和尿素氮水平评价造模结果(血肌酐>44 μmol/L，尿素氮>8.9 mmol/L)，最终40只大鼠建模成功。将40只大鼠按随机数字表法分为模型组和脂肪干细胞组，每组20只。造模成功后6 h，模型组大鼠尾静脉注射20 μL生理盐水，脂肪干细胞组大鼠尾静脉注射20 μL PKH-26标记的脂肪干细胞(细胞浓度为3×10⁶ L^-1)，1次/d，连续3 d。

1.4.3 血肌酐和尿素氮水平测定 在干预治疗后的第1，3，14，21天，每组随机取3只大鼠，采集下腔静脉血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清肌酐和尿素氮水平。

1.4.4 苏木精-伊红染色观察肾脏组织病理变化 在干预治疗后的第3，21天，每组随机取3只大鼠，麻醉后处死，取出左侧肾脏组织，加入体积分数为10%甲醛溶液固定，以制备肾组织切片，切片厚5-8 μm。将薄片烫平，再贴到载玻片上，放入45 ℃恒温箱烘干，梯度乙醇脱水，二甲苯脱蜡，树胶封固，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察各组大鼠肾脏组织病理形态变化。根据肾小管损伤程度评分，包括肾小管坏死、刷状缘消失、肾小管扩展和管型形成。0分为正常肾脏，1分为小损伤(< 5%肾小管损伤)，2分为中等损伤(5%-25%肾小管损伤)，3分为中重度损伤(26%-75%肾小管损伤)，4分为严重损伤(>75%肾小管损伤)。

1.4.5 TUNEL法检测肾脏细胞凋亡情况 在干预治疗后的第3，21天，取上述各组大鼠肾脏组织制作石蜡切片后脱蜡处理，向切片上滴加复合消化酶进行室温孵化20 min；洗涤后滴加50 μL TUNEL标记反应混合液，在湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加POD2转化液50 μL；湿盒37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色；苏木精-伊红复染后即可在荧光显微镜下观察凋亡细胞数目，并计算凋亡率。

1.4.6 荧光显微镜观察PKH-26标记脂肪干细胞的存活和分布 在脂肪干细胞移植第21天，取上述各组大鼠肾脏组织并制备切片，进行苏木精-伊红染色并在荧光显微镜下观察。在图像中随机选取10个视野，计数每个视野中PKH-26标记的阳性细胞数。

1.4.7 RT-PCR检测肾组织bax、Caspase-3的基因表达 干预治疗第3，21天，每组选取3只大鼠，麻醉后取肾脏组织置于液氮中，RT-PCR检测肾组织中bax、Caspase-3基因相对表达水平。实验重复3次。将肾组织于冰上充分研磨后迅速加入TRIzol试剂裂解细胞抽提总RNA。根据反转录说明书合成相应的cDNA并进行扩增，反应总体系15 μL (SYBR Green 3 μL、DEPC水10 μL、上下引物各0.5 μL、200 μg/L cDNA 1 μL)。扩增条件均为94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环。bax上游引物：5'-ACA CCT GAG CTG ACC TTG GA-3'，下游引物：5'-CCG TGT CCA CGT CAG CAA TC-3'，引物长度为133 bp；Caspase-3上游引物：5'-AGA GCT GGA CTG CGG TAT TGA G-3'，下游引物：5'-GAA CCA TGA CCC GTC CCT TG-3'，引物长度为148 bp；内参β-actin上游引物：5'-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3'，下游引物：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AGG C-3'，引物长度为444 bp。采用2^-ΔΔCt分析法，以β-actin基因作为内参，测定bax、Caspase-3 mRNA相对表达水平。

1.4.8 Western blot检测肾组织bax、Caspase-3的蛋白表达 干预治疗第3，21天，取上述液氮冻存的肾组织，加入裂解液制成匀浆液，离心取上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度。每组取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h(或4 ℃过夜)；一抗(1∶500)室温孵育2 h (或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，PBS洗涤后用化学发光试剂显影，扫描图像并半定量分析，测定各组肾脏组织中bax、Caspase-3蛋白质相对表达水平，以β-actin作为内参。

1.5 主要观察指标 ①大鼠血清肌酐和尿素氮水平；②大鼠肾脏损伤评分、肾脏细胞凋亡率；③大鼠肾组织中bax及Caspase-3基因和蛋白相对表达水平；④大鼠肾脏病理形态变化。

1.6 统计学分析 将所有实验数据输入Excel 2010表格中，然后用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；多组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，两组间比较采用LSD-t 检验，实验数据以x(_)±s形式表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

挤压伤所致肾损伤是指长时间压迫机体肌肉丰富部位，肌肉发生溶解从而释放出肌红蛋白、钾离子等进入血液，引发急性肾损伤^[15-17]，导致肾小管结构和肾脏过滤功能异常，从而引起血液中肌酐、尿素氮等代谢产物含量激增^[18-20]，是一种较为常见的临床综合征，其发病率和死亡率均较高^[21]，传统抗休克、抗感染、碱化尿液、促进有害物质排泄、人工肾脏替代等治疗都各有局限性^[22-24]。近年来，研究表明脂肪干细胞移植可以显著缓解肾脏损伤，并可以改善肾脏的结构和功能^[25-27]。脂肪干细胞移植后，能靶向性向肾脏损伤部位聚集^[28-30]，可以在肾脏损伤部位分化为肾小管上皮样细胞，从而促进肾小管结构和功能的恢复^[31]；脂肪干细胞还可以旁分泌或者内分泌多种免疫调节因子，其具有调节免疫、抗凋亡、抗炎症等作用^[32-34]。实验旨在探讨脂肪干细胞移植对挤压伤所致急性肾损伤的影响，以期为临床治疗提供借鉴和依据。

实验结果显示造模后大鼠血液中肌酐和尿素氮水平显著升高，说明挤压伤所致的急性肾脏损伤病理模型建立成功。脂肪干细胞移植后血清肌酐和尿素氮水平显著降低，说明脂肪干细胞显著改善了肾脏的功能。苏木精-伊红染色显示脂肪干细胞组大鼠肾组织形态显著恢复；与模型组相比，脂肪干细胞组大鼠肾小管损伤评分显著降低，说明脂肪干细胞移植可以显著缓解肾脏结构病变。TUNEL实验结果显示，脂肪干细胞移植明显降低了肾脏细胞凋亡数量。

在调控细胞代谢中，Bax蛋白可激活线粒体通透性转化孔的开放，引起线粒体结构和功能紊乱，Caspase-3激活蛋白外流，细胞凋亡^[35]。模型组肾组织内bax及其下游Caspase-3基因和蛋白相对表达水平显著升高，脂肪干细胞移植显著降低了肾组织内bax和Caspase-3基因和蛋白的相对表达水平，缓解了细胞凋亡。

综上所述，脂肪干细胞移植对挤压伤所致急性肾损伤具有明显的修复作用，其机制可能与脂肪干细胞参与调节bax和Caspase-3表达有关。

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