2.1  脂肪干细胞来源外泌体的提取及鉴定结果 

2.1.1  脂肪干细胞的形态  传至3代后，倒置显微镜下可见脂肪干细胞呈纤维样，排列紧密，呈放射状，见图2。

2.1.2  脂肪干细胞分化能力  脂肪干细胞成脂诱导3周后可以在镜下观察到细胞浆内有大量透亮、折光性好的脂滴，油红O染色呈红色；成骨诱导3周后Vonkossa染色可见细胞内有黑色沉淀物，即沉淀的钙转化为银后，再经紫外线照射后呈现的颜色，见图3。

2.1.3  外泌体标志物Western blot鉴定结果  外泌体表面标志物CD9、CD63、CD81阳性表达；根据抗体说明书，CD63蛋白存在不确定的糖修饰，因此分子质量范围在30-60 kD之间；Western blot检测结果见图4。

2.1.4  外泌体纳米微粒追踪检测结果  样本粒径分布主要集中在30-200 nm，样本的粒子浓度为10¹⁴ L^-1，样本3次重复测定的结果较为一致，说明外泌体的粒径大小整体符合标准，粒径分布较为均一。25例患者之间、10名健康人之间外泌体浓度差异无显著性意义；25例患者外泌体浓度平均值为0.70×10¹⁴ L^-1，10名健康人外泌体浓度为1.14×10¹⁴ L^-1，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。因此得出结论：第一，血糖及软组织缺损面积的差异并不影响脂肪干细胞来源外泌体的浓度；第二，有理由相信两组在蛋白组成等方面具有差异性，此为进一步实验的基础。分别从25例患者样本及10例健康人中各随机抽取3例样本行差异蛋白提取，抽取的样本编号为A7、A11、A23；Z5、Z8、Z9。粒径以及粒子数浓度见表2。粒子的总体分布，见图5。

2.1.5  外泌体透射电镜鉴定结果  外泌体样本视野下均可见清晰的囊泡状结构，且囊泡粒径大小符合外泌体的检测标准，见图6。

2.2  数据质控  通过MaxQuant搜库结果，统计各样本的酶切效率，所有样品的酶切效率都达到了95%以上，因此酶解质控合格，见表3。对MaxQuant软件得到的定量结果(log2转换后的定量值)进行样本间的皮尔森相关性系数分析，见图7，组内、组间样本间的相关性系数绝大多数都达到了0.85及以上，展示了样本间较高的重复性，定量结果可信度很高。

2.3  蛋白定量分析

2.3.1  蛋白定量结果  该研究共检测到406个蛋白，可定量的蛋白有231个。在这些可定量蛋白中试验组/对照组共筛选出31个差异表达的蛋白，其中29个表达下调，2个表达上调。下调水平显著的蛋白包括CAT、CD9、ITGA2B、ITGB3、YWHAZ、MMRN1、S100A9、IGFALS、MPO、FCN2；上调显著的2个蛋白为LBP、IGLV3?1，见图8，9。

2.3.2  蛋白功能注释富集分析结果  与对照组相比，试验组具有较高风险罹患动脉粥样硬化、动脉硬化性心血管疾病、动脉硬化、2型糖尿病、肥胖及营养过剩等疾病，疾病本体富集分析(DO)见图10。

基因注释(gene ontology，GO)选择了3个本体，分别描述差异蛋白的分子功能(molecular function，MF)、所处的细胞位置(cellular component，CC)、参与的生物过程(biological process，BP)。GO分析显示，试验组中差异表达蛋白最重要的分子功能与酶抑制剂活性、肝素结合能力有关；差异表达蛋白所处的细胞位置的主要差别集中在细胞外囊泡及与血小板α颗粒有关；参与的生物过程主要与凝血过程及脂质转运有关，见图11。

KEGG对细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期等涉及的信号通路予以描述。KEGG通路分析显示，差异蛋白主要介入的功能包括PI3K?Akt信号通路、胆固醇代谢通路、黏着斑信号通路，见图12。

利用String数据库及Cytoscape绘制PPI网络，所示蛋白均为下调蛋白，见图13。

脂肪干细胞是成体干细胞的一种，具有分化为其他类型细胞的潜能^[1-2]，这一特性使其在创伤修复、组织工程皮肤及器官等研究领域具有广阔前景及潜力^[3]。随着研究的深入，有学者提出脂肪干细胞的生物学功能与其旁分泌的外泌体有着密切联系，这或可成为研究脂肪干细胞修复损伤、促进创面愈合机制的新的切入点。

脂肪干细胞通过旁分泌功能将与细胞分化、细胞周期调控、趋化有关的细胞因子等物质输送至细胞外环境，这些物质进一步被临近细胞摄取，经过一系列复杂生物学过程，出现细胞增殖加速、定向分化等，最终促进损伤愈合或形成新的细胞类型^[4-6]，而上述过程外泌体均参与其中。

外泌体是直径40-150 nm的囊泡，经“内吞-融合-外泌”后^[7]，由细胞分泌至外环境中，这是一个主动的分泌过程，被分泌至胞外的外泌体可携带多种生物活性物质，参与多种信号通路^[8-9]。绝大多数细胞均有释放外泌体的功能。目前研究证实，生物体几乎所有液体环境中均有外泌体存在，脂质和蛋白质为外泌体膜的主要构成成分^[10-13]。外泌体富含蛋白质、核酸、microRNA(miRNA)和其他非编码RNA^[14]，可调节各种细胞功能及生物学过程，且与肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生发展有关。部分糖尿病患者可合并下肢等部位的软组织缺损或创伤愈合障碍，那么糖尿病患者的脂肪干细胞及其来源外泌体是否仍具有促进损伤修复的能力，以及是否存在差异表达的生物学标志物，仍是需要深入探究的问题。

以此为出发点和基础，该研究采用非标记定量蛋白质谱技术(label free quantification，LFQ)提取糖尿病性下肢溃疡患者和健康成年人的脂肪干细胞来源外泌体，再通过Maxquant 1.5.8.3软件对原始数据进行分析、处理，筛选出具有统计学意义的差异表达蛋白；利用clueGO(version 2.5.4)对差异表达蛋白行GO和Pathway分析；利用数据库String对差异蛋白进行蛋白-蛋白(PPI)间相互作用分析，从而明确差异表达蛋白的功能，探索其在糖尿病下肢溃疡发病过程中所起的作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  非标记定量蛋白质谱技术及生物信息学技术。

1.2  时间及地点  实验于2018年10月至2019年5月在空军军医大学第二附属医院整形烧伤科完成。

1.3  对象  选取年龄40-50周岁(平均年龄45.6岁)、空腹血糖值7.5-8.0 mmol/L、因糖尿病下肢软组织缺损接受手术治疗的患者25例(试验组)，软组织缺损面积在16-23 cm²之间，损伤深度至真皮层，取自创面清创植皮术中切除的创周组织，包含脂肪；选取10名同期接受腹部吸脂手术+腹壁整形手术的健康成年人(对照组)，年龄37-49周岁(平均年龄43.9岁)，取其术中剪除的脂肪组织，患者与健康成年人平均年龄经统计学分析差异无显著性意义。

1.4  材料

实验主要试剂：0.15%胶原酶Ⅰ(Gibco，美国)；DMEM/F12基础培养基(Hyclone，美国)；体积分数为10%胎牛血清(Gibco，美国)；成脂培养基(#HUXMA-90031) (Cyagen Biosciences Inc.，中国)；成骨培养基(#HUXMA-90021) (Cyagen Biosciences Inc.，中国)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)。

实验主要仪器及设备：4 ℃离心机(预冷Fresco 17，Thermo Scientific，USA)；常温离心机(Pico21，Thermo Scientific，USA)；涡旋振荡器(Vortex 5      ，QILINBER，China)；真空干燥离心机(SPD111V，Thermo Scientific，USA)；HPLC液相系统(Easy-nLC 1000，Thermo Scientific，USA)；Q Exactive plus质谱仪(Thermo Scientific，USA)；MaxQuant 1.5.8.3软件(Max-Planck Institute for Biochemistry，Germany)。

1.5  方法

1.5.1  脂肪干细胞的分离、培养  术中收集所需组织，术后即刻将脂肪组织于无菌操作下PBS洗涤3次，除去纤维后将其剪切为1 mm³大小，37 ℃下0.1%Ⅰ型胶原酶处理消化45 min，室温条件下1 000 r/min离心5 min，重悬离心2次，将细胞悬液均匀种植于75 cm²培养瓶，培养于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱，细胞融合率达80%以上时传代。取第3代脂肪干细胞为实验所用。

1.5.2  脂肪干细胞的鉴定  将第3代脂肪干细胞以 5×10³/cm²的密度接种于6孔板，加入DMEM/F12完全培养基，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养至完全贴壁，更换成脂、成骨诱导培养基，21 d后行油红O染色、Vonkossa染色。

1.5.3  外泌体抽提  取第3代脂肪干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养至细胞融合70%以上，更换为无血清培养基于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h；收集细胞上清，在4 ℃下以2 000×g离心30 min，弃沉淀；样本转移至5 mL超高速离心管，在4 ℃下以170 000×g离心2 h，弃沉淀；用相应的1×PBS重悬，0.22 μm滤膜过滤，分装，-80 ℃保存。

1.5.4  外泌体的鉴定

Western blot鉴定：取脂肪干细胞来源外泌体的PBS重悬液10 μL，加入等体积的RIPA(强)裂解液进行裂解以及蛋白提取，之后进行蛋白浓度测定以及Western blot检测外泌体标志物。

纳米微粒追踪检测(NTA)：取冻存外泌体样本，25 ℃水浴解冻，之后冰上放置；取出20 μL置于新的离心管中，加入980 μL已过滤的1×PBS(样本50倍稀释)，反复吹打均匀，然后将混匀液用0.22 μm滤膜过滤至新的离心管；稀释并过滤后的样本可直接进行纳米微粒追踪检测。

1.5.5  外泌体差异蛋白提取  从两组中各抽取3例样本进行后续研究^[15]。使用HPLC去除样本中高丰度蛋白，紫外检测波长为280 nm & 214 nm；对去除高丰度蛋白之后的外泌体差异蛋白进行检测、提取：样本中加入适量lysis buffer(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.1%CHAPS)，涡旋混匀；超声60 s，0.2 s on、2 s off，振幅25%，室温提取      30 min；在4 ℃下15 000 r/min离心10 min，小心取出上清(重复1次)，收集上清分装后冻存于-80 ℃。

采用BCA法测定抽提好的蛋白浓度。①电泳：抽提的外泌体蛋白体积∶2×loading buffer体积=5∶1，将二者混匀，在100 ℃加热8 min以使蛋白质变性；每个电泳道加样20 µg，把电泳装置与电源连接好，将电压调至150-160 V，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5 cm处，关闭电源；从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，考马斯亮蓝染色1 h，然后进行脱色；②脱色：用解剖刀将考马斯亮蓝染色凝胶切成1.0-  2.0 mm²大小放入试管中，加入脱色液200 μL浸泡，振荡10 min，弃去溶液，重复一两次直至蓝色褪尽，加入乙腈200 μL脱水5-10 min；加入100 μL DTT还原液30 min，弃废液，加入200 μL乙腈脱水5-10 min，弃废液；加入100 μL碘乙酰胺烷基化于暗处孵育30 min，加入100 μL脱色液洗5-10 min；加入乙腈100 μL脱水5-10 min，弃废液，用水和乙腈清洗3次；③酶切肽段：加入50 μL胰蛋白酶稀释液(0.01 g/L)，4 ℃放置30 min；胰蛋白酶稀释液完全吸收后补充酶解缓冲液(25 mmol/L NH₄HCO₃) 50-100 μL，使胶完全浸没，37 ℃过夜；④液相分离：加入提取液Ⅰ(5% TFA) 100 μL，40 ℃加热水浴1 h，在30 min时超声3 min左右，将提取液吸到另一干净的试管中，冰冻干燥形成胶块；向上述胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA) 100 μL，30 ℃孵育1 h，在30 min时超声3 min左右；氮气吹干乙腈后冰冻干燥，加入5-10 μL的0.1%FA溶液混匀，取1/2体积进行质谱分析，见图1。

1.5.6  液相质谱参数  该研究使用的液相色谱型号为EASY-nLC1000(thermofisher)，串联的质谱仪为Orbitrap Fusion(thermofisher)。将酶切后的肽段用A相(0.1% formic acid)加载到自制的捕捉柱(100 μm×2 cm，C18填料规格为 3 μm，120 A)，使用不同梯度的B相(99.9%乙腈，0.1%甲酸)洗脱Trap柱，洗脱的肽段经过分析柱(150 μm×15 cm，C18填料规格为1.9 μm，120 A)形成带电喷雾，进入质谱检测。B相梯度为5%(0 min)，7%(2 min)，10%(10 min)，20% (50 min)，30%(70 min)，90%(71 min)，90%(78 min)，流速为600 nL/min。质谱参数：一级检测器类型为轨道阱，分辨率为120 000，质量扫描范围300-1 400 m/z，离子最大的注入时间为100 ms，自动增益控制目标(AGC Target)  500 000，射频透镜(RF Lens)60%，电荷价态范围(include charge state)：2-6，排除时间(exclution duration)：18 s，质量偏差(mass tolerance)：±7 ppm。二级采用四级杆(Quadrupole)的分离模式，分离为1.6，碎裂模式为HCD，碎裂能量32%，检测器类型为离子阱，离子最大的注入时间为35 ms，自动增益控制目标5 000。

1.5.7  数据处理  使用Maxquant软件(版本1.6.1.0)对质谱采集的原始数据进行数据库的搜索。酶切方式：trypsin/P，且最多允许存在2个漏切位点。可变修饰：Oxidation(M)，Acetyl(protein N-term)。固定修饰：Carbamidomethyl(C)，每条肽段最多允许5个可变修饰。一级质量偏差20 ppm，二级质量偏差0.5 Da。数据库为Uniprot人类数据库(含36 130个已注释蛋白，released    2 019.06)。最小肽段长度为6个氨基酸，最大肽段质量     5 000 Da，谱图和蛋白匹配的FDR设置为1%，采用iBAQ算法获得蛋白定量值。搜库参数见表1。

对蛋白表达数据进行统计学分析，筛选可定量蛋白(每组至少有4个样本有定量值的蛋白)。对原始定量值进行log2转换，使其满足正态分布。对每个蛋白表达进行F 检验，对于F 检验P > 0.05的蛋白使用单因素方差分析计算蛋白表达的P 值；对于F 检验P < 0.05的蛋白使用Welch t-test计算蛋白表达的P 值。筛选蛋白表达P < 0.05且Fold change>1.5的蛋白为差异表达的蛋白。使用clueGO (version 2.5.4)对每组的差异蛋白分别进行GO和Pathway分析，P值设置为< 0.05。同时还对差异蛋白进行了蛋白-蛋白间相互作用分析(数据库String，版本11.0)，分析工具：R软件clusterProfiler package，FDR< 0.25。

1.6  主要观察指标  ①脂肪干细胞和外泌体鉴定结果；②脂肪干细胞外泌体纳米微粒追踪检测结果；③差异蛋白提取、鉴定及生物信息学分析结果。

间充质干细胞用于损伤修复、组织工程器官等研究由来已久^[16]。脂肪干细胞因其便于采集、来源充足而逐渐成为近年来的研究热点。此前的多项研究均证实，脂肪干细胞诱导分化潜能的实现与其旁分泌功能有关，而外泌体则是其旁分泌作用的主要承担者与执行者^[17-18]。外泌体在物质交换、细胞周期调控等过程中起着举足轻重的作用，相比较间充质干细胞，干细胞来源外泌体在科研及临床应用中具有显著的优点：①包括脂肪干细胞在内的各型间充质干细胞，由于自身分化潜能，具有形成肿瘤的潜在风险，而其来源外泌体在具有相同生物学功能的同时，无恶变的可能；②外泌体具有较低的免疫排斥性，安全性较高^[19]；③外泌体可作为新型的载体，具有很高的生物效能；④来源广泛，各种体液均可提取外泌体，而不同来源外泌体在功效上也具有一定差异，因此具有多能性。例如脂肪干细胞来源外泌体在修复软组织损伤方面具有显著优势^[20]。因此，利用蛋白组学、基因组学结合生物信息学技术，对不同组织、疾病来源的外泌体进行功能分析、特异性标记物筛选，是目前基础科研的热点之一。

自2014年人类蛋白质组草图公布开始，蛋白质组学的研究日益深入，并广泛应用于基础科研、临床试验等各个领域。蛋白质组学将实验室技术与生物信息学技术相结合，通过绘制被检测样本的蛋白质指纹图谱，可鉴别出大量的与疾病相关的蛋白标记物，同时还可根据检测疾病种类的不同，提供与之匹配的蛋白质图谱，因此在探索疾病的生物学标志物方面具有重要作用及意义。此前，有学者曾对间充质干细胞进行蛋白组学分析，旨在明确其在损伤修复、诱导分化过程中的关键蛋白、主要通路激活情况，并取得了一定成就^[21-23]，这也为干细胞治疗的临床应用奠定了坚实的理论基础。近几年来，随着外泌体研究的升温，很多研究者将注意力转移至干细胞来源外泌体所携带的特异性蛋白等生物标记物，尝试分析其功能特性。这类研究中，研究对象多为骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞来源外泌体，研究内容相对集中于软组织、器官等损伤后修复^[24-25]。鉴于此，该研究尝试通过类似的检测手段，将糖尿病下肢溃疡患者的脂肪干细胞来源外泌体与健康成人相比，筛选差异性标志物，分析其相关的生物学功能及信号通路，并于后续的临床工作中持续验证其诊断的准确性及敏感性，以期得出较为准确的研究结果，从而提前采取有效措施控制由此导致的软组织损伤，加速溃疡愈合，降低截肢(趾)率。

该研究采用的蛋白质提取、分析方法为非标记定量蛋白质谱技术(label free quantification，LFQ)，该技术是蛋白质组学研究的常用技术手段，是利用自下而上/鸟枪法对蛋白质进行酶切得到肽段，并通过质谱分析来研究蛋白的相关功能，在对检测样本进行定量时，依赖于提取的肽段母离子峰面积(extracted-ion chromatogram，XIC)，与其他方法相比，非标记定量蛋白质谱技术免去了昂贵的同位素质量标签做内标，因此更适用于大量样本的检测，具有检测费用低、技术难度相对不高、对样本数量无硬性要求等优点，可作为临床试验的首选研究方法。目前，非标记定量蛋白质谱技术已形成相对成熟的产业体系，并日益规范，被检测方只需提供符合要求的样本，后续过程均可由专业生物公司代为完成，节省了临床医师在科研方面的时间投入。

利用上述技术，首选对试验组和对照组的外泌体进行非标记定量蛋白质谱测序分析，初步筛选出具有表达差异的蛋白231种，其中上下调差异显著者31种(P值< 0.05且Fold change>1.5)，与对照组相比，试验组中29种蛋白下调，2种蛋白发生上调。下调的蛋白包括CAT、CD9、ITGA2B、ITGB3、YWHAZ、MMRN1、S100A9、IGFALS、MPO、FCN2；上调蛋白为LBP、IGLV3−1。

对差异表达蛋白的疾病本体富集分析(DO)结果显示，试验组在动脉粥样硬化、肥胖、营养过剩等相关疾病方面风险较高，这一结果与样本来源的疾病类型吻合度高，印证了试验结果的客观性与准确性。

基因注释(GO)结果显示，试验组中差异表达蛋白最重要的分子功能与酶抑制剂活性、肝素结合能力有关，这2项功能在创面愈合中起重要作用，前者可通过降低多种酶促反应水平，加重组织缺氧、缺血，减免损伤修复速率；后者则已经证实，可降低创面感染概率、减少创周血栓形成，在促进创伤愈合方面具有积极作用^[26-27]；差异表达蛋白所处的细胞位置的主要差别集中在细胞外囊泡及血小板α颗粒。这一结果提示糖尿病下肢溃疡患者脂肪干细胞来源外泌体水平存在部分异常，或可降低干细胞原有的促进损伤修复的能力。血小板α颗粒内容物包括Fg、vWF和β-TG；其中Fg与凝血、血栓形成有关，研究表明糖尿病下肢溃疡多与局部微血栓形成有关^[28-29]，这一差异与前期研究成果相符，vWF为血管内皮细胞标记物，在机体受损情况下血管内皮细胞新生加速，促进创面愈合，而慢性创面患者血管新生速度减慢，由此可推断vWF表达降低或功能改变。β-TG与血小板释放有关，参与的生物过程主要与凝血过程及脂质转运有关，凝血过程异常可导致局部血运障碍、形成栓塞，减少血供，导致组织缺血缺氧，代谢废物堆积；脂质转运可能与外泌体的释放异常有关，相较于其他来源的外泌体，脂肪干细胞来源外泌体与脂质代谢、转运关系更为密切，由此可再次证实糖尿病下肢溃疡患者的脂肪干细胞来源外泌体异于健康成年人。

PPI网络所示蛋白均为下调蛋白，证实在糖尿病下肢溃疡发病过程中，起主要作用的为上述下调蛋白种类，这些蛋白之间具有互作关系，其中CAT在炎性损伤性疾病中均表达异常，主要参与氧化还原过程；CD9为外泌体标记性蛋白。由此可知，糖尿病下肢溃疡患者的外泌体蛋白成分发生了一定改变，这一改变或将影响创面愈合速率。ITGA2B、ITGB3、YWHAZ则参与到多条信号通路中。通过KEGG富集分析可知，上述3个蛋白与PI3K−Akt信号通路、胆固醇代谢通路、黏着斑信号通路有关。PI3-K通路3-K是一种磷脂酰肌醇激酶，能使肌醇环第三位羟基磷酸化；该通路的激活后使细胞膜上的肌醇磷酸化，从而生成PI-3P、PI-3,4-P2及PI3,4,5-P3。PI-3,4-P2与PI3,4,5-P3可与Akt的PH区结合，从而使Akt部分激活；与此同时，还可使Akt转位于细胞膜的内表面。这使得PI3-K通路能参与到细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等众多重要生物学过程。研究表明，在该通路激活的情况下，可抑制炎症反应并稳定动脉粥样硬化斑块、减少血管硬化程度、参与血管新生等^[30-32]；这些主要是通过激活状态的Akt对胰岛素、多种细胞生长因子、凝血酶等的介导作用来实现^[33]。PI3K-AKt信号通路是细胞存活信号通路的一种，对细胞具有保护作用，且对神经的保护作用尤为突出^[34-35]，其作用机制主要有以下几个方面：①通过Forkhead、CREB 、NF-κB三大家族抑制细胞凋亡^[36]；②通过磷酸化Bcl-2家族成员Bad，促进细胞的生长；③磷酸化半胱天冬酶caspase-3和caspase-9使其失活^[37]，这几者均属细胞凋亡因子，失活后促使细胞凋亡的能力丧失；④抑制GSK-3(糖原合成酶激酶-3)活性，抑制细胞凋亡^[38]；⑤AKt可抑制线粒体释放细胞色素C与细胞凋亡诱导因子，抑制细胞凋亡。由此可见，在糖尿病下肢溃疡的愈合过程中PI3K−Akt信号通路同样可发挥重要作用。

上述研究显示，下调蛋白ITGA2B、ITGB3通过参与PI3K−Akt信号通路在创伤的发生、发展过程中起重要作 用^[39]：①抑制PI3K−Akt信号通路激活，使细胞周期改变，加快细胞凋亡，致使参与脂类代谢途径的细胞功能减退，导致脂类代谢异常，加重血栓形成风险；②ITGA2B、ITGB3可诱导巨噬细胞迁移，促使炎性反应加剧，加重组织坏死，导致细胞异常凋亡；③ITGA2B、ITGB3可引起细胞结构异常，主要是改变细胞膜的通透性，进一步促进代谢废物清除机制异常，加重局部缺血缺氧，并在炎性反应的共同作用下降低血管新生速度，从而延迟创面愈合。

综上所述，对脂肪干细胞来源外泌体的差异表达蛋白进行生物信息学分析具有重要意义：①从全新的角度出发，紧跟科研热点，从蛋白水平分析糖尿病下肢溃疡患者的发病机制及主要影响因素，为疾病的诊断研究提供新思路；②根据试验结果，可对检测出的差异表达蛋白功能做深入分析，有望筛选出新的高敏度的诊断指标，为疾病的早期诊断、愈后提供理论支持；③通过对检测到的关键蛋白或其通路重要成员实施药物治疗与干涉，筛选和指导不同病程的临床药物应用，或研发新的治疗药物，有望确定治疗糖尿病下肢溃疡的新靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

非标记定量蛋白质谱技术(label free quantification，LFQ)：即利用液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，该技术优点是免去了高昂的稳定同位素标签做内标，大量样本检测时只需对蛋白质谱数据进行分析对比，检测样本中相应肽段的信号强度，对其相应的蛋白质进行相对定量分析。

外泌体：为新兴的生物学标记物，目前广泛应用于肿瘤、免疫等领域，可作为疾病诊断、治疗的指标，具有较高的诊断敏感度及准确性。外泌体存在于绝大多数体液环境中，具备强大的旁分泌功能，因此具有作为药物载体的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

随着各类生物芯片、质谱技术及数据库的不断丰富及应用，目前对于疾病的研究、诊断已进入分子层面，各类疾病生物学标记物的研究已成为临床研究的一大主流。外泌体及蛋白质谱技术是上述研究的热点及先进手段，将二者结合用于疾病的诊断、治疗效果评估等仍处于起步探索阶段。该研究率先将蛋白质组学与干细胞来源外泌体研究相结合，具有较高的研究水平及创新性；将脂肪干细胞来源外泌体作为研究对象，通过非标记定量蛋白质谱技术对其进行差异分析，从蛋白质层面对促进损伤修复的机制作出诠释及推测，为后续研究提供了数据支持及方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程