2.1  培养的成纤维细胞的形态  细胞大多呈长梭形、扁平星形，部分呈三角形，生长旺盛时代谢物增多，在倒置显微镜下细胞排列成簇状，见图2。

2.2  机械应力对于成纤维细胞增殖的影响  结果显示，牵拉力为15%时对成纤维细胞的增殖促进作用最明显；而  24 h的应力作用时间对成纤维细胞是更合适的，见图3。因此后续实验使用15%的静态拉伸作用于成纤维细胞24 h时。

2.3  纳米粒子追踪分析技术检测分离的外泌体直径分布和数量  结果显示，2组外泌体的粒径分布范围相近，见图4，但15%的静态拉伸会促进成纤维细胞分泌外泌体，使得外泌体的浓度增高。

2.4  成纤维细胞来源外泌体表面标志蛋白的表达情况  Western blot结果显示，对照组及加载15%静态拉伸组的成纤维细胞外泌体中均表达CD9及CD81，见图5，而CD9和CD81是外泌体标志性蛋白^[18]，表明外泌体提取成功。

成纤维细胞又称纤维母细胞，是人体组织对应力作用的主要感受细胞之一，也是组织创伤修复过程中的主要效应细胞，其对组织的重建和修复有着不可或缺的作用^[1-2]，但机械应力对成纤维细胞外泌体具有何种调控机制，相关研究尚为空白。

中西医结合微创治疗拇外翻后通过使用趾蹼间夹垫及“8”字绷带的弹性外固定，可为截骨端愈合提供适宜的力学环境^[3-4]。实验拟建立机械应力对成纤维细胞体外刺激培养模型，以确定机械应力对成纤维细胞及其来源外泌体的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学研究。

1.2  时间及地点  于2018年10月在中国中医科学院望京医院骨关节二科手术室及生物实验室完成。


1.3  材料  选取在中国中医科学院望京医院接受拇外翻微创截骨手法整复治疗的患者12例，取手术中截取的第1跖骨头内侧骨组织留作标本，见图1。整个研究方案于2013-03-21经中国中医科学院望京医院伦理委员会批准(批准编号为2013-03-21)，标本采集前患者签署知情同意书。患者均为女性，年龄21-45岁，身高150-175 cm，体质量40-80 kg，右足拇外翻角< 35°，第1，2跖骨间角< 16°^[5-7]，无足部畸形及足部外伤史及手术史。

试验用主要仪器和试剂：气体恒温培养箱购自美国Forma公司；离心机购自美国Falcon公司；H·SWX-600BS电热恒温水浴箱购自上海圣科公司；超净工作台购自无锡易纯公司；TE2000-S型倒置相差显微镜购自日本NIKON公司；液氮罐购自河南天驰公司；FX-5000柔性基底细胞牵张拉伸应力加载系统购自美国Tension System公司；自动CO₂培养箱购自德国HERA Cell公司；扫描电镜购自日本Hitachi公司；酶联免疫检测仪购自美国Bio-TEK Instruments公司；培养瓶、6孔培养板购自美国Falcon公司；DMEM低糖培养液、活性炭处理胎牛血清购自GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购自美国Solarbio公司；PBS、生理盐水、苏木精及伊红染液购自杭州化学试剂厂；青-链霉素双抗购自上海复申公司；ExoQuick Precipitation购自美国SBI公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司；CD9、CD81 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自美国System Biosciences公司；透射电镜购自日本Hitachi公司。

1.4  方法

1.4.2  成纤维细胞加载机械应力的培养  实验采用FX-5000柔性基底细胞牵张拉伸应力加载系统，该系统采用的负压交换原理，在培养基底膜和基底座之间密闭的腔体中注入气体而产生的负压从而达到基底的形变^[13]，效应细胞可受到来自各个方向的应力刺激，其可通过计算机精准控制气压的大小从而控制细胞受力的大小，系可使基底变形类及较为先进的细胞力学干预加载系统^[14-15]。对生长在三维状态下的细胞进行静态的牵拉应力刺激加载和弧矩形加载平台对生长在三维环境下的第3代成纤维细胞(图2)进行单轴向的静态的应力加载刺激培养(使用弹性基底6孔板培养细胞)，加载应变0%，5%，10%，15%及20%的静态拉伸，作用24或48 h后，选择合适的静态拉伸参数，分为2组进行对照，采用CCK-8检测成纤维细胞的增殖情   况^[16-17]。选择合适的应力参数K进行后续实验。

1.4.3  成纤维细胞外泌体的提取  在限制性培养基(离心去除细胞后的纯培养基)中将无应力刺激和有应力刺激的2组细胞置入CO₂培养箱中继续培养24 h，更换培养液后继续培养48 h，90 000×g 4 ℃离心30 min，留上清液，按照500∶120加入Exoquick试剂充分混匀，4 ℃静置过夜后  2 000×g离心30 min，取沉淀后，即为外泌体，-80 ℃保存备用。

1.4.4  成纤维细胞外泌体及蛋白的鉴定  取骨组织的第3代细胞，按1×10⁴/孔的密度将其接种在6孔培养板内的3个盖玻片上，细胞接种完成后继续置入5%CO₂、37 ℃培养箱内过夜，待细胞贴壁。次日取出玻片，用苏木精染色     2 min，水洗，盐酸乙醇分色，水中返蓝5 min，用伊红染色30 s，水洗后放在倒置相差显微镜下观察其形态学特点，并拍照记录。使用透射电镜观察外泌体的形态。将成纤维细胞外泌体加入体积分数4%戊二醛固定，3 500×g 4 ℃离心30 min，1×PBS清洗3或4次，固定3 h后，梯度乙醇脱水。采用Western blot检测成纤维细胞来源外泌体表面标志蛋白。取培养的成纤维细胞，PBS洗3次，加入适量裂解液置于冰上裂解30 min，12 000×g 4 ℃离心15 min，取上清。使用BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度。电泳， 转膜，5%脱脂奶粉抗原封闭2 h，TBST缓冲液洗5次，每次5 min。加入CD9和CD81抗体(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG培育50 min，TBST缓冲液洗5次，每次5 min。显影液显色，Image Lab成像系统分析图像。

1.5  主要观察指标  机械应力刺激下成纤维细胞及其来源外泌体的变化。

       中西医结合微创截骨手法整复术治疗拇外翻，截骨后需采用中医正骨手法纠正拇外翻畸形及第一跖趾关节半脱位，遵循中医正骨理论基础筋束骨、骨张筋、筋归槽、骨合缝的原理，使偏离的肌腱(筋)与错位的骨节得以矫正。术后采用“8”字绷带结合分趾垫的方式对截骨端进行外固定，采用第1、第2趾蹼间放置分趾垫、“8”字绷带及宽胶布弹性外固定的方法代替传统的石膏固定和内固定，以维持截骨端的弹性稳定^[19-21]。包扎固定的截骨端形成骨折二期愈合模型。

成纤维细胞作为骨折创伤修复过程中主要的应力感受及效应细胞，在其截骨端的愈合过程中起到重要作用。近些年大量研究表明，骨愈合的过程中都有外泌体参与，并发挥了必不可少的积极作用^[22-24]。

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，能够被细胞分泌到细胞，可运输RNA(主要是微小RNA)，携带蛋白，进行细胞间的物质与信息传递，调控细胞功能，从而参与机体的免疫反应、组织损伤及骨组织损伤修复过程^[25-26]。尽管外泌体参与细胞间通讯的方式还未完全清楚，但现有研究表明配体-受体的相互作用在这一过程中起到重要的作用^[27-31]。

文章表明，对拇外翻足截骨块培养出成纤维细胞加载15%的静态拉伸力刺激后，会促进成纤维细胞分泌外泌体。其对照组和实验组提取成纤维细胞外泌体中均有CD9、CD81外泌体标志性蛋白的表达。两组外泌体的电镜及纳米粒径追踪分析检测结果与外泌体粒径分布范围相符，且15%的静态拉伸作用使得外泌体的浓度增高。实验结果，这证实了成纤维细胞来源外泌体在一定阈值的应力刺激下而增殖。研究成纤维细胞来源外泌体在骨折愈合应力环境下的生长和分化机制，对于探索更有利于截骨端愈合的力学环境具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

拇外翻微创截骨：利用削磨钻对拇外翻患者第一跖骨头颈部进行楔形截骨后行整复手法矫正畸形，后使用“8”字绷带外固定并配合康复锻炼达到治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

拇外翻是指拇趾在第一跖趾关节处向外侧偏斜移位，是一种复杂的解剖畸形，多见于中老年妇女，最常发生在有遗传倾向加上长时间穿不合适的鞋子的人，不合适的鞋子会对拇趾施加异常压力。

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