2.4  Western-Blot检测结果  Western-Blot检测结果显示，椎体凸侧的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的表达水平显著高于凹侧。Image Plus计算积分吸光度值(IA)，凸侧的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的IA值显著高于凹侧，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3及表2。

脊柱侧凸是一种发生于脊柱的三维复杂畸形，涉及前凸、后凸侧弯和旋转^[1-2]，特发性脊柱侧凸是其最常见的表现形式，青少年多发。脊柱侧凸既会对患者生存质量造成消极影响，严重时还会损害心肺功能^[3-4]。一般认为，脊髓相对缩短或脊柱生长过快是导致脊柱侧凸的主要病因。越来越多的研究发现，褪黑素、聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白等分子机制也参与了脊柱侧凸病程，并可能发挥着与力学机制相似的不良作用^[5-6]。但目前特发性脊柱侧凸的大多数研究均局限于回顾性分析，缺少对其发生发展机制的实验性研究。因此文章以SD大鼠为实验对象，从整体水平出发，探讨力学机制与分子生物学机制对脊柱侧凸发生发展的影响。 

1.1  设计  对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年10月至2019年1月在四川省人民医院骨科完成。

1.3  材料  

1.3.1  实验动物  6只SPF级3周龄断乳前SD大鼠购于南方医科大学实验动物中心，雌雄各半，180-220 g，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。单笼饲养，自然光照及饮水，环境温度20-24 ℃，空气湿度50%-55%。适应性喂养1周后诱导模型。

1.3.2  试剂  聚集蛋白聚糖抗体、Ⅱ型胶原蛋白抗体、Sox9抗体和血管内皮生长因子抗体，BOSTER公司；PVDF膜，PALL公司；SDS-PAGE凝胶、电泳液缓冲液、转移缓冲液、TBST、洗脱抗体缓冲液，深圳中洪博元生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒，Pierce公司。

1.3.3  仪器  Brilliance 16螺旋CT机，荷兰Phillips公司； Micro-CT机，瑞士SCANCO Medical AG公司；蛋白垂直电泳仪、超高灵敏度化学发光成像系统，上海伯乐生命医学产品有限公司；恒温摇床，上海领成生物科技有限公司。

1.4  方法

1.4.1  造模方案  大鼠予以10 mL/kg氯胺酮及地西泮混合液腹腔注射麻醉，固定于动物实验台。采用双腋下切口入路，钝性分离肱骨周围神经，结扎动静脉后，在尽可能靠近肩关节处离断肱骨，并切断鼠尾，缝合时将断端皮肤埋入切口内，避免大鼠舔舐伤口^[7]。手术结束后单笼喂养，24-48 h内密切观察有无渗出、出血等。采用专用的诱导侧凸鼠笼，高笼喂养，大鼠以悬空方式进食至少3个月。

1.4.2  X射线检查及不对称张力分布检测

(1)X射线检查：术后3个月，将大鼠固定于水平斜面40°的硬板，进行正位X射线摄片，参照脊柱侧凸研究协会指南的相关标准^[8]，以Cobb角>10°为诊断标准。由2位医师独立重复测量；

(2)不对称张力检测：对全脊柱进行CT扫描，利用Mimics软件重建脊柱三维模型，导入Abaqus后进行有限元分析，记录凹侧及凸侧的应力分布^[9-10]。其中X轴为上向，Y轴为从右至左向，Z轴为前向。

1.4.3  椎体骺板相关蛋白表达  大鼠麻醉后处死，提取凹侧及凸侧椎体骺软骨，低温保存于盐水纱布中。检测时从骺软骨中萃取约50 μg蛋白样品后进行分级分离，将分离后的蛋白印迹转移至NC膜，室温下，缓冲盐水用0.1%Tween20及5%脱乳脂液阻断约1 h，将膜与抗体放置在4 ℃过夜。以β肌动蛋白(β-actin)为内参蛋白，将膜与第二抗体(1∶2 000)孵育1 h，采用ECL和Western-blot系统进行检测。

1.4.4  骨小梁结构检测  将样本按照生理方向摆放，用分辨率μCT进行扫描。采用Minmics系统，将2D图像信号源转换为3D图像。以脊柱中轴线为参照，分为凸侧及凹侧椎体，提取松质骨小梁进行映射。设置μCT扫描参数，计算以下数据：①骨体积分数：相对骨体积或骨体积分数；②骨小梁数目：骨组织内与非骨组织交点数量；③骨小梁厚度：骨小梁的平局厚度；④骨小梁分离：骨小梁之间髓腔的平均宽度；⑤结构模型指数：骨小梁板状与杆状的程度。

1.5  主要观察指标  术后3个月，行X射线检查；采用Mimics软件分析不对称张力分布。处死大鼠后，提取凹侧及凸侧椎体骺软骨，ECL和Western-blot系统检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的表达；并采用μCT扫描检测骨小梁结构，计算骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁分离和结构模型指数。

1.6  统计学分析  所有数据均采用SPSS 20.0软件包进行统计。数据由2人重复录入、核查、纠错。计量资料采用x(_)±s表示，均已验证呈正态分布，统计推断采用t 检验。检验水准α=0.05，P < 0.05认为差异有显著性意义。

目前约80%的特发性脊柱侧凸病源机制不明，但多发于青少年，主要特征是脊柱侧向弯曲^[11-12]。过去20年里动物模型在脊柱侧凸研究中扮演了重要的角色，利用动物模型研究脊柱侧凸力学特点，对揭示人类脊柱侧凸的发生机制具有重要意义^[13]。由于人类的直立行走的特点，获取与人体相似的脊柱生物力学动物模型具有较大的困难。目前用于构建脊柱侧凸模型的动物主要包括双足鼠、猪、犬、羊等，构建方式也从简单的药物致畸发展为内分泌干预、手术干预等^[14-15]。与其他模型相比，双足大鼠具有成本低、与人类解剖相似、造模成功率高等突出优点。Cobb角作为脊柱侧凸角度的评价指标，Cobb≥10°常被当做临床上脊柱侧凸的诊断标准。当患者的脊柱侧凸角度达到30°时，会明显增加健康问题的风险及降低生活质量^[11]。当患者的Cobb角20°-45°时，主要以运动疗法和支具治疗为主，当Cobb角大于45°时，则需进行手术治疗。在此次研究中，6只SD大鼠均成功造模成功，均出现明显的后凸及左侧胸廓畸形。Cobb角度分别为37.4°，33.6°，39.50°，28.23°，33.70°，49.12°。这表明双足大鼠脊柱侧凸模型是一个成功率较为理想的模型，对微观结构及分子水平变化研究有一定的价值。

有限元模型的基本思想是把连续的机构离散成有限个单元，并在每一个单元中设定有限个节点，从而将连续体看作仅在节点处相连接的一组单元的集合体，可被用来分析结构下的力学特点^[16]。由于脊柱侧凸畸形结构复杂，所以建立相应的模型具有较大的困难。目前基于CT图像建立三维脊柱图像与人体实际结构相符，且CT图像通过导入计算机处理可以减少人为误差，精确度较高。采用脊柱CT横断图像构建的有限元模型不但保留了留脊柱的解剖结构，且模拟出的模型更加真实^[17]。此次研究对脊柱侧凸大鼠全脊柱进行CT扫描，建立脊柱三维模型并进行有限元分析发现，凸侧的应力分别为-171.15 MPa，-374.19 MPa，    -3 833.42 MPa，凹侧分别为362.98 MPa，606.45 MPa，3 662.78 MPa，结果表明椎体承受的应力不对称，凸侧垂直方向的应力显著高于凹侧椎体承受的应力，凸侧垂直方向的应力显著高于凹侧，这说明在骨骺软骨的垂直方向存在着显著的不对称应力。根据Huter-Volkmann定律，侧凸一旦发生，凹侧生长板受到的压应力大于凸侧，则会出现凸侧部分生长板活性更高，成骨能力更强，使侧凸进行性加重，这种力可能与脊柱侧凸发展形成恶性循环。

脊柱生长依赖于骨骺软骨板的纵向分化，而骨分化受到多种分子信号的协调调控^[18]。同时，不同于其他部位，蛋白质的合成代谢在骨骺软骨板的生长中往往呈正反馈效应^[19]，多个蛋白分子在椎体发育中发挥着重要作用。Sox9在软骨内成骨的初始阶段中发挥重要的作用，其能刺激激活一系列如Ⅱ型胶原蛋白a1、Ⅱ型胶原蛋白a2和聚集蛋白聚糖软骨基质基因的转录，表达于整个软骨形成过程^[20-21]。Sox9作为软骨内化骨对脊椎发育具有重要作用，研究表明Sox9在脊柱侧弯凸侧生长板软骨的表达水平明显较凹侧高^[22]。软骨细胞外基质主要由胶原和蛋白聚糖组成，蛋白聚糖研究最多的是聚集蛋白聚糖、神经蛋白聚糖和多能蛋白聚糖。Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，并以三螺旋结构形式存在于骨骼、肌腱等运动组织，是软骨和关节的主要有机成分，提供骨架和弹性，可作为评估软骨细胞增殖情况的良好指标^[23-24]。聚集蛋白聚糖由于具有很多亲水性的支链，能覆盖在网状结构Ⅱ型胶原的表面，吸收大量自由的金属离子和水，保护Ⅱ型胶原的作用^[25]。研究发现，血管内皮生长因子是软骨内化骨过程中对于软骨细胞死亡、细胞外基质重塑、骨骼形成和血管生成的基本调节物质，具有刺激内皮细胞生长和血管再生的作用，血管内皮生长因子则可通过多种生长因子代谢路径，参与骨代谢和骨形成过程^[26-27]。此次研究通过Western-Blot检测发现，凸侧的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的表达水平及相应的IA值均显著高于凹侧，这样将进一步加重侧凸的不平衡生长，此次实验结果也均符合Huter-Volkmann定律。这也说明聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的表达在脊柱侧凸的发生、发以及病情恶化中可能扮演重要角色。

骨小梁是机体的股骨及椎骨等长骨端内的网状结构，由骨小梁及表面附着的矿物质构成^[28]。骨小梁对骨的支撑及保证血液等物质流通起着重要的作用，其外部所载荷的大小和方向形成特定排列的结构，研究发现，当骨小梁结构产生一定程度的损坏时，整体骨结构的性能明显降低^[29]。Wolff定律认为，在出现解剖学意义上的侧弯之前，微观的骨结构就已经发生了显著改变，但在解剖结构变化的过程中，骨小梁等微观结构会根据外界力负荷的变化而动态调整^[30-31]。由于骨小梁的微观结构尺寸很小，所以得到清晰可辨的骨小梁结构图像较为困难。基于组织切片技术，拍摄每一切片的组织形态，重建出组织的整体结构是传统获取骨小梁图像的方法^[32]。但传统切片方法容易破坏组织结构，并且具有检测分析难度大、错误多且耗时长的缺点。随着影像学技术在医学领域的广泛应用以及计算机技术的迅速发展，Micro-CT的空间分辨率已达到微米级别，可以将生物骨组织的细微结构一览无余，因此使用 Micro-CT获取骨小梁图像已成了目前最主要的方法^[33]。采用 Micro-CT 技术获得清晰可分割的骨小梁图像进行二维图像分析或三维模型分析，便于观测骨小梁的变化，分析骨组织的状态。基于不同的实验目的，可以选择适当的Micro-CT分辨率采集并分析图像，以减少数据处理的复杂度和误差率，从而得到最佳的实验结果。骨小梁结构复杂微小、变化不易观察，利用形态学参数定量描述骨小梁结构，有利于分析骨小梁的结构特点。在此次研究中，通过的Micro-CT扫描发现，凸凹两侧的骨小梁微结构存在显著的不对称性。与凹侧相比，凸侧的骨体积分数、骨小梁数目显著较高，而骨小梁分离、结构模型指数明显降低。我们推测，非对称张力可能通过分子机制诱导软骨板发生不对称的解剖变化，而青少年的生长发育时间较长较快，不对称张力与脊柱侧凸之间存在的恶性循环会导致脊柱侧凸加剧。

综上所述，此次研究发现，不对称张力可能通过影响相关蛋白及骨小梁结构的变化，促进脊柱侧凸的发生发展。基于此研究，在以后的研究和脊柱矫正治疗中，不仅要考虑遗传因素和体内蛋白的变化因素，也要注意脊柱不对称应力带来的损伤。

文章通过SD大鼠脊柱侧凸模型构建，检测检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox9、血管内皮生长因子蛋白的表的指标。研究发现，不对称张力可能通过影响相关蛋白及骨小梁结构的变化，促进脊柱侧凸的发生发展。基于此研究，在以后的研究和脊柱矫正治疗中，不仅要考虑遗传因素和体内蛋白的变化因素，也要注意脊柱不对称应力带来的损伤。