胡椒叶提取物干预可减轻急性脊髓损伤模型大鼠的氧化应激及炎症反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1488

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
胡椒叶提取物：胡椒是胡椒科的一种开花藤本植物，具有广谱抑菌性，据报道，胡椒叶的丙酮提取物对薯蓣炭疽菌菌丝生长的抑制率可达83.64%；胡椒提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母菌和黑曲霉均具有抑制作用；胡椒的乙醇提取物对来自口腔中的12种不同属的176个细菌菌株也具有较强的抑制作用。

摘要
背景：研究表明胡椒叶提取物对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠有明确的保护作用，作用机制与抗氧化损伤有关，但其是否能通过抗氧化应激减轻急性脊髓损伤还未见报道。
目的：探究胡椒叶提取物对急性脊髓损伤大鼠氧化应激、炎症反应及神经损伤的影响。
方法：将100只SD大鼠(购自成都达硕实验动物公司)随机分为假手术组、脊髓损伤组及胡椒叶提取物低、中、高剂量组，每组20只。除假手术组外，其余组大鼠采用改良Allen’s法复制大鼠急性脊髓损伤模型，造模后，胡椒叶提取物低、中、高剂量组灌胃给予100，200，400 mg/(kg•d)的胡椒叶提取物，连续给药28 d。给药后3，7，14，28 d后进行BBB评分和斜板实验；给药后28 d，检测血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平，免疫印迹检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、脑源性神经营养因子和神经/胶质细胞抗原、IκBα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达，同时进行脊髓组织苏木精-伊红染色与TUNEL染色。实验方案经海南大学热带农林学院实验动物伦理委员会批准(NR001803)。
结果与结论：①与假手术组比较，脊髓损伤组给药后不同时间点的BBB评分和斜板实验最大倾斜角度降低(P < 0.01)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物中、高剂量组给药后7，14，28 d的BBB评分和斜板实验最大倾斜角度升高(P < 0.05，P < 0.01)；②与假手术组比较，脊髓损伤组脊髓组织损伤严重，细胞凋亡率、Bax、Caspase-3、丙二醛、白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、p-IκBα、NF-κB p65、脑源性神经营养因子和神经/胶质细胞抗原表达升高(P < 0.05，P < 0.01)，Bcl-2、IκBα、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达降低(P < 0.05，P < 0.01)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂量组脊髓组织损伤减轻，细胞凋亡率、Bax、Caspase-3、丙二醛、白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、p-IκBα、NF-κB p65、脑源性神经营养因子和神经/胶质细胞抗原表达降低(P < 0.05，P < 0.01)，Bcl-2、IκBα、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达升高(P < 0.05，P < 0.01)；③结果表明，胡椒叶提取物可通过抑制急性脊髓损伤大鼠炎症反应及氧化应激减轻脊髓损伤并发挥神经保护作用，作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7821-1519(成建平)

关键词: 急性脊髓损伤, 胡椒叶提取物, 炎症反应, 氧化应激, 细胞凋亡, 神经保护, 神经损伤, NF-κB信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Extract of piper auritum plays a protective role in streptozotocin-induced diabetic rats, and the mechanism is associated with anti-oxidative damage. However, whether it can alleviate acute spinal cord injury by anti-oxidative stress is unknown.
OBJECTIVE: To investigate the effects of extract of piper auritum on oxidative stress, inflammation and nerve injury of acute spinal cord injury rats.
METHODS: One hundred rats (provided by Chengdu Dashuo Experimental Animal Company) were randomly divided into sham group, spinal cord injury group, and low-, moderate-, and high-dose extract of piper auritum groups. Except for sham group, the rats in the other groups were used to establish acute spinal cord injury model by Allen’s method. Afterwards, the rats in the extract of piper auritum groups were given 100, 200 and 400 mg/(kg•d) extract of piper auritum via gavage, respectively, for 28 consecutive days. Basso, Beattie Bresnahan scores and tilt board experiment were carried out at 3, 7, 14 and 28 days after administration. The concentrations of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, malondialdehyde, interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in serum were measured by ELISA. The protein levels of Bcl-2, Bax, Caspase-3, brain-derived neurotrophic factor, neuronal/glial cell antigen, IκBα, p-IκBα and NF-κB p65 were detected by western blot assay. Spinal cord tissues underwent hematoxylin-eosin staining and TUNEL staining. The study was approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, approval No. NR001803.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham group, the Basso, Beattie Bresnahan scores and the maximal title angle in tilt board experiment in the spinal cord injury group were significantly decreased at different time points after administration (P < 0.01). Compared with the spinal cord injury group, the Basso, Beattie Bresnahan scores and the maximal title angle in tilt board experiment in the moderate- and high-dose extract of piper auritum groups were significantly at 7, 14 and 28 days after administration (P < 0.05, P < 0.01). (2) Compared with the sham group, the spinal cord injury was more serious in the spinal cord injury group, the apoptosis rate, the levels of Bax, Caspase-3, malondialdehyde, interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α, p-IκBα, NF-κB p65, brain-derived neurotrophic factor, and neuronal/glial cell antigen were significantly increased (P < 0.05, P < 0.01), and the levels of Bcl-2, IκBα, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase were significantly decreased (P < 0.05, P < 0.01). Compared with the spinal cord injury group, the degree of spinal cord injury in each extract of piper auritum group was alleviated, the apoptosis rate, the levels of Bax, Caspase-3, malondialdehyde, interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α, p-IκBα, NF-κB p65, brain-derived neurotrophic factor, and neuronal/glial cell antigen were significantly decreased (P < 0.05, P < 0.01), and the levels of Bcl-2, IκBα, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase were significantly increased (P < 0.05, P < 0.01). (3) These findings imply that extract of piper auritum can attenuate acute spinal cord injury by inhibiting inflammation and oxidative stress and also plays a neuroprotective role in spinal cord injury, and the mechanism may be related to inhibit the activation of NF-κB signaling pathway.

Key words: acute spinal cord injury, extract of piper auritum, inflammation, oxidative stress, apoptosis, neuroprotection, nerve injury, NF-κB signaling pathway

中图分类号:

成建平，李华，李雄杰. 胡椒叶提取物干预可减轻急性脊髓损伤模型大鼠的氧化应激及炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 5010-5016.

Cheng Jianping, Li Hua, Li Xiongjie . Extract of piper auritum can alleviate oxidative stress and inflammation of rat models of acute spinal cord injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 5010-5016.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 100只大鼠均进入结果分析。

2.2 胡椒叶提取物促进急性脊髓损伤模型大鼠后肢功能恢复与假手术组比较，脊髓损伤组BBB评分和斜板实验评分显著降低(P=0.000 76，0.002 8)；给药7，14，28 d后，胡椒叶提取物中、高剂量组BBB评分(7 d：P=0.036, 0.007 1；14 d：P=0.008 2，0.001 9；28 d：P=0.002 2，0.000 89)和斜板实验显著升高，见图1，表明胡椒叶提取物能显著促进急性脊髓损伤模型大鼠后肢功能的恢复。

2.3 胡椒叶提取物减轻急性脊髓损伤模型大鼠脊髓损伤与假手术组比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织细胞核出现明显固缩，组织明显水肿，炎性细胞浸润显著增多；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物中、高剂量组大鼠脊髓组织细胞固缩及水肿情况显著减轻，炎性细胞浸润也显著减少，见图2，表明胡椒叶提取物能减轻急性脊髓损伤模型大鼠脊髓损伤。

2.4 胡椒叶提取物抑制急性脊髓损伤大鼠脊髓组织细胞凋亡与假手术组比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织凋亡细胞明显增多(P=0.000 68)，Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P=0.002 1，0.001 7)，Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P=0.001 9)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂量组大鼠脊髓组织凋亡细胞明显减少(P=0.037，0.008 4，0.003 3)，Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(Bax：P=0.04，0.007 9，0.001 1；Caspase-3：P=0.039，0.008 1，0.001 5)，Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P=0.045，0.008 9，0.000 98)，见图3，4。

2.5 胡椒叶提取物抑制急性脊髓损伤模型大鼠氧化应激与假手术组比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低(P=0.000 34， 0.000 41)，丙二醛浓度明显升高(P=0.001 2)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂量组大鼠脊髓组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高(超氧化物歧化酶：P=0.033，0.006，0；谷胱甘肽过氧化物酶：P=0.037，0.007，0.001)，丙二醛浓度显著降低(P=0.044，0.008，0.001)，见图5。

2.6 胡椒叶提取物减轻急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应与假手术组比较，脊髓损伤组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6质量浓度明显升高(P=0.007 3，0.000 5，0.007 6)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂量组血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6质量浓度明显降低(肿瘤坏死因子α：P=0.042，0.012，0.004；白细胞介素1β：P=0.044，0.009，0.001；白细胞介素6：P=0.047，0.011，0.004)，见图6。

2.7 胡椒叶提取物促进急性脊髓损伤模型大鼠脊髓组织修复与假手术组比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织神经营养因子脑源性神经营养因子和神经/胶质细胞抗原蛋白水平明显降低(P=0.001 6，0.001 1)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂量组脊髓组织脑源性神经营养因子和神经/胶质细胞抗原蛋白水平显著高于脊髓损伤组(脑源性神经营养因子：P=0.038，0.0082，0.001 3；神经/胶质细胞抗原：P=0.031，0.009，0.001)，见图7。

2.8 胡椒叶提取物抑制NF-κB信号通路激活与假手术组比较，脊髓损伤组IκBα蛋白表达水平明显降低(P=0.000 87)，p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P=0.000 79，0.000 72)；与脊髓损伤组比较，胡椒叶提取物低、中、高剂

量组IκBα蛋白表达水平显著升高(P=0.041，0.009，0.001)，p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(p-IκBα: P=0.044，0.008，0.001；NF-κB: P=0.036，0.008，0.001)，见图8。

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引言

材料方法

1.1 设计对照观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018-04-03/07-23在海南医科大学完成。

1.3 材料胡椒叶由海南医科大学药学院提供；苏木精-伊红染色试剂盒、RIPA裂解液购自碧云天生物科技公司；BCA试剂盒购自北京索莱宝生物公司；Tunnel细胞凋亡试剂盒购自瑞士罗氏公司；超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的ELISA试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；脑源性神经营养因子、神经/胶质细胞抗原、IκBα、p-IκBα和NF-κB抗体购自英国Abcam公司；Bcl-2、Bax和Caspase-3抗体购自美国Santa cruz公司。

实验动物：4周龄SPF级雄性SD大鼠100只，体质量180-220 g，购自成都达硕实验动物公司，生产许可证号：SCXK(川)2012-0001。所有大鼠均自由进食，日照时间12 h，温度24-27 ℃。将100只大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、胡椒叶提取物低、中、高剂量组^[9]，每组20只。

1.4 实验方法

1.4.1 药物提取将胡椒叶洗净后室温干燥5 d，打粉。取300 g干燥粉末，先后加入900 mL己烷、900 mL氯仿和 900 mL甲醇，采用索氏提取法提取4 h，提取3次。随后进行过滤，合并滤液、浓缩，精制后获得提取物1.1 g，稀释成100 g/L质量浓度，临用前分别稀释到10，20，40 g/L进行实验。

1.4.2 模型建立及分组干预除假手术组外，其余组大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，以T₁₀为中心剃毛并进行常规消毒，消毒后作手术切口，暴露T₉-T₁₁棘突，暴露T₁₀胸椎，采用Allen’s法造模^[10]，用10 g打击棒从2.5 cm自由落体撞击T₁₀胸髓，撞击后移开打击棒。以致伤瞬间大鼠尾部痉挛性摆动，双后肢及躯干出现回缩扑动视为造模成功。假手术组大鼠除了不采用打击棒进行打击外其他操作同上。造模成功10 min内，胡椒叶提取物低、中、高剂量组分别灌胃给予100，200，400 mg/(kg•d)的胡椒叶提取物，假手术组和脊髓损伤组灌胃给予等量的溶媒，连续28 d(最终纳入统计的大鼠至少8只)。给药后3，7，14，28 d对所有大鼠进行BBB评分(评分越高功能恢复越好)和斜板实验(评分越高功能恢复越好)，28 d后处死所有大鼠，取脊髓组织进行后续实验。

1.5 主要观察指标

1.5.1 苏木精-伊红染色观察病理损伤麻醉大鼠，采用生理盐水行心脏灌流至流出液体颜色澄清透明，再用40 g/L多聚甲醛灌注至大鼠全身僵硬，随后取脊髓损伤点为中心的脊髓组织，放入40 g/L多聚甲醛进行后固定。采用蔗糖进行梯度脱水后，制作石蜡切片，根据苏木精-伊红染色试剂盒说明书进行染色，于生物显微镜下观察染色情况。

1.5.2 TUNNEL检测细胞凋亡取石蜡切片，采用二甲苯进行脱蜡处理后，根据TUNNEL试剂盒说明书对脊髓组织凋亡细胞进行染色处理，生物显微镜下观察细胞凋亡情况，每个标本随机选取5个视野进行计数统计。

1.5.3 免疫印迹检测蛋白表达用生理盐水对大鼠进行心脏灌注后，取以脊髓损伤为中心的脊髓组织，采用RIPA裂解液提取各组组织蛋白，用BCA试剂盒进行定量分析。随后每组各取30 g蛋白，用10%SDS-PAGE分离蛋白，采用半干法将蛋白质转移到PVDF膜，用5%脱脂牛奶进行封闭处理后，加入适宜浓度的一抗(脑源性神经营养因子， 1∶1 100；神经/胶质细胞抗原，1∶1 000；IκBα 1∶1 000； p-IκBα，1∶800；NF-κB p65，1∶900；Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶950；Caspase-3，1∶800)4 ℃孵育过夜，第2天洗去未结合一抗，加入适宜浓度二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h后，洗去残余二抗于暗室曝光显影。每组至少8个样本。

1.5.4 试剂盒检测血清细胞因子浓度将大鼠麻醉后，首先进行心脏取血，将所获得的外周血室温静置1 h后， 3 500 r/min离心15 min，取上层血清，根据试剂盒说明书检测血清中炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白

细胞介素6浓度及氧化应激相关细胞因子超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶水平。

1.6 统计学分析实验结果均采用SPSS 19.0进行统计学分析，每组至少有8只大鼠纳入统计。首先对数据进行正态分布分析，符合正态分布多组间比较采用单因素方差分析，反之采用秩和检验，实验结果均以x(_)±s表示，以P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

研究表明脊髓原发性损伤后出现的一系列继发性损伤，是导致脊髓损伤加重的主要原因，也是导致不可逆性神经功能损伤的主要原因^[11]。继发性脊髓损伤主要包括炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡及星形胶质细胞瘢痕的形成^[12]。目前虽无有效治疗及防止外伤导致脊髓损伤的方法，但大量研究表明，有效减少继发性脊髓损伤能明显降低脊髓损伤的致残率^[13]。因此，及时防治继发性脊髓损伤是促进脊髓损伤患者神经功能恢复的关键。研究表明，胡椒叶提取物具有抗炎抗氧化活性。Hazekawa等^[14]研究发现白胡椒水提物能通过抑制炎症因子分泌，抑制小鼠脾脏细胞增殖抑制炎症反应，同时也有研究发现胡椒具有明显的抗氧化活性^[15]。但胡椒叶提取物是否能减轻脊髓损伤及继发性的脊髓损伤还未见报道。此次研究采用改良Allen’s法复制大鼠创伤性脊髓损伤模型，并连续给予模型大鼠不同浓度胡椒叶提取物4周，以探究胡椒叶提取物对脊髓损伤的作用。实验结果表明，脊髓损伤模型大鼠BBB评分及斜板实验评分均明显降低，表明大鼠后肢运动功能受到明显影响，模型复制成功；给予胡椒叶提取物后，大鼠后肢运动功能明显改善，表明胡椒叶提取物对脊髓损伤大鼠均有明显的保护作用，但作用病理环节及机制有待进一步探究。

脊髓组织水肿及炎性细胞浸润均是脊髓损伤后的常见病理表现，神经细胞凋亡更是导致脊髓损伤后患者运动功能受损的主要原因^[16-17]。越来越多的研究表明，脊髓损伤初期患者和动物模型均出现不同程度的神经元及胶质细胞凋亡，其中线粒体细胞凋亡途径在其中起到了重要作用^[18]。Bax和Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要调控蛋白，Bax过表达能激活Caspase家族蛋白介导的细胞凋亡^[19]。苏木精-伊红染色结果表明，模型大鼠脊髓组织出现了明显水肿、炎性细胞浸润，细胞核出现了明显固缩，且Tunnel实验表明模型大鼠脊髓组织凋亡细胞明显增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少，凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达水平显著升高。200，400 mg/kg的胡椒叶提取物能明显减轻模型大鼠组织水肿、减少炎性细胞浸润及细胞和固缩，并能抑制细胞凋亡，并且随药物浓度剂量作用有所增强，表明胡椒叶提取物能抑制脊髓损伤后神经细胞凋亡。

研究表明，氧化应激及炎症反应是导致脊髓损伤及继发性脊髓损伤的主要原因^[20-21]。据既往研究报道，大鼠脊髓损伤后炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达明显增多，并且炎症因子的表达能进一步激活小胶质细胞，进一步放大炎症反应，诱导神经诱导凋亡^[2²^]。氧化应激的发生可激活线粒体细胞凋亡途径，导致神经细胞大量凋亡^[2³^]。Hirata等^[2⁴^]研究发现胡椒叶具有明显的抗组胺活性。此次实验结果发现，急性脊髓损伤模型大鼠血清炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α及脂质过氧化物丙二醛浓度明显升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低，但胡椒叶提取物能显著降低模型大鼠白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α及丙二醛浓度，升高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，并且随剂量升高作用增强，表明胡椒叶提取物减轻模型大鼠脊髓损伤的作用与其抗氧化剂抗炎作用有关，并且可能具有量效关系。

此外，胡椒叶提取物还能抑制模型大鼠脊髓组织p-IκBα、NF-κB p65的蛋白表达，促进IκBα蛋白的表达，表明其能抑制脊髓损伤模型大鼠NF-κB信号通路的激活。NF-κB信号通路是调控炎症因子表达的重要信号通路，该通路的激活能促进炎症因子的表达，加重脊髓损伤^[2⁵^]。实验结果表明，胡椒叶提取物抑制脊髓损伤模型大鼠炎症反应与抑制NF-κB信号通路激活有关。

综上所述，胡椒叶提取物能升高脊髓损伤模型大鼠BBB评分和斜板实验评分，减轻脊髓组织病理损伤，抑制脊髓损伤模型大鼠炎症因子释放，促进抗氧化酶表达，抑制氧化产物的产生，抑制脊髓组织神经细胞凋亡及NF-κB信号通路的激活，表明胡椒叶提取物能通过抑制氧化应激、炎症反应及细胞凋亡减轻急性脊髓损伤模型大鼠脊髓组织损伤、促进模型大鼠后肢运动功能的恢复，作用机制与抑制NF-κB信号通路激活。此次研究首次探究了胡椒叶提取物对脊髓损伤的作用，但对脊髓损伤其他病理机制的作用还有待探究，可能为脊髓损伤的治疗提供了新的潜力药物。

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