2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠60只，分为2组，造模后有1只大鼠出现自噬，2只不明原因死亡，用同批大鼠补齐，60只大鼠进入结果分析。

2.2  影像学观察  造模后4 d，2组骨折线均十分清晰，未见明显骨痂；术后7 d，2组骨折线均清晰，纤维骨痂实验组较对照组稍明显；造模后10 d，骨折线稍模糊，实验组骨折线处骨痂较对照组明显增大，骨痂密度影较小，有类骨质存在，分布不均匀；造模后14 d，骨折线模糊，实验组骨折线处骨痂继续增大，但与对照组间差距缩小，骨痂密度影较浅，类骨质增多，且分布较均匀，骨折线表面粗糙；造模后21 d，骨折线消失，2组骨折断端连接较好，骨痂密度增大，对照组骨痂较实验组膨大，密度均匀，骨折线处平坦。X射线片见图2。

由于大鼠胫骨纤细，骨扫描仪不能精确扫描骨折线处骨痂密度，每组比较并不具有统计学意义。故仅对实验组和对照组骨密度扫描数值整体进行了单因素方差分析，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3  苏木精-伊红染色下的骨细胞和骨小梁定量分析  用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对每张图片测量骨小梁面积和骨陷窝数量，并以骨陷窝数量代表骨细胞数量，计算出骨细胞密度(骨细胞数量/骨小梁面积)，见表1；病理样图见图3。7 d组中，对照组和实验组均处于骨损伤修复早中期，以纤维骨痂和软骨骨痂为主，修复效果有差异，新生骨组织增生，可见少量成骨细胞，但不明显；10 d组中，对照组仍可见明显血肿和坏死骨，骨小梁较细，周围可见软骨痂，实验组中纤维骨痂开始减少，骨性骨痂逐渐增多，可见骨小梁明显减少，骨组织周围成骨细胞逐渐向骨细胞转化，说明实验组修复效果比对照组好。

测量图片总骨小梁面积和视野面积，计算出骨小梁密度(总骨小梁面积/视野面积)^[23]；病理样图见图4。骨损伤区域修复过程主要为纤维组织增生和新骨组织的形成。 7 d时，在早期修复效果相差不明显，但仍能看出实验组骨纤维和骨细胞更加成熟；10 d时，实验组中骨性骨痂逐渐增多，骨小梁明显减少，亦说明实验组修复效果较对照组好。

每张图片所测得的数据分别导出到相应的Excel表里，应用SPSS 17.0统计软件对数据进行方差分析，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明在该实验的骨折愈合中，抑制FGFR3能促进骨小梁和骨细胞的再生。2组每个时间点骨细胞密度和骨小梁密度的平均值见表1，2；并将最终数据做成统计图，见图5。通过2组的比较，找出FGFR3表达最活跃的时间段(2条折线中间的距离越大说明实验效果越明显，即FGFR3表达最活跃)。2组统计在7-14 d差异最大，说明FGFR3在该时间段表达最为活跃。







2.4  Masson三色法染色下对骨痂纤维化成熟程度进行定量分析  每张切片先在100倍镜下观察全部组织，再根据具体大小及表达情况选择3个区域400倍镜下采集图片，染色病理样本见图6。用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像纤维组织和新生骨占视野面积的百分比(纤维率)。应用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明在该实验的骨折愈合中，抑制FGFR3能加快骨纤维化进程。将2组每个时间点纤维化率的平均值制成统计图，见图7。2组统计在7-14 d差异最大，说明FGFR3在该时间段表达最为活跃。

随着社会、经济的高速发展，交通、工伤等意外导致的各种高能量骨折患者逐年增多，这种骨折常伴有重要的神经损伤^[1]。伴有神经损伤的骨折称之为失神经骨折^[2]，临床上发现，失神经骨折在愈合过程中会生成大量的软骨痂，甚至异位骨化，其结构紊乱、骨小梁排列松散、生物力学性能差，是一种病理性骨痂^[2-3]，可导致骨折延迟愈合甚至不愈合，产生严重的后果^[4]。骨折的愈合是一个相当复杂的生物修复过程，受很多因素的影响，涉及新生血管和神经再生、神经调控、细胞分化等^[5-6]。骨组织中含有丰富的神经纤维，大量研究表明，周围神经对骨折愈合有重要的调节作用^[7-9]。

成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptors 3，FGFR3)属于酪氨酸激酶(RTK)家族成员之 一^[10]，通过与22种成纤维细胞生长因子(成纤维细胞生长因子1-14，16-23)结合传递信号^[11]。而FGFR3是该家族里已知唯一一个负向调节的生长因子受体，主要在软骨内化骨中起作用^[12]，并且在失神经状态下该因子会过度表达^[13]，这可能是大量生成低性能病理性骨痂的原因之一。作者前期研究已经证实在中枢神经损伤状态下抑制FGFR3能促进骨痂的矿化，减少骨质的流失，促进骨小梁再生^[14-15]。此次实验通过建立大鼠周围神经失神经的胫骨骨折模型，并抑制FGFR3，比较在不抑制该受体情况下大鼠胫骨骨折愈合过程的骨痂变化，来探讨FGFR3在这一骨折愈合过程中的作用及表达变化规律。有望通过该研究改善因失神经所产生的一些不良影响，加深对失神经下病态骨痂的了解，为实践中认识、治疗伴有神经损伤的骨折提供理论指导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3月至2019年1月在甘肃省骨关节疾病重点实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  动物选择  成年雌性SD大鼠60只，SPF级，体质量(220±10) g。购于兰州大学动物实验中心，许可证号为SCXK(甘)2015-0002。实验中饲养、处理动物的方法符合中国监管部门的相关规定、要求^[16]。

1.3.2  主要实验试剂  FGFR3抑制剂PD173074购自美国Selleck公司。苏木精染液、伊红染液珠购自海贝索生物技术有限公司，Masson染色试剂盒购自于南京建成生物技术公司。

1.3.3  主要仪器  转轮式冰冻切片机(徕卡-2016，德国)，BMJ-Ⅲ型包埋机(常州中威电子仪器有限公司)，TSJ-Ⅱ型全自动封闭组织脱水机、图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 (美国Media Cybernetics公司)，数码三目型摄像显微镜(BA400Digital，MOTIC CHINA GROUP CO.LTD.)等。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组  将60只大鼠按Hiltunen法制备成失神经胫骨骨折模型后，再随机分组，给予不同处理。实验组(失神经骨折+FGFR3阻滞剂)，对照组(失神经骨折+生理盐水)，2组各30只，每组又分为术后4，7，10，14，21 d，每组、每个时间节点均处死6只大鼠取标本。

1.4.2  失神经胫骨骨折模型建立  大鼠给予体积分数10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，满意后，右股外侧区剪毛备皮，碘伏消毒。取右股后外侧切口，逐层切开皮肤、皮下浅、深筋膜，钝性分离臀肌和股外侧肌，暴露、游离坐骨神经至后肌群分支以上，长约0.8 cm，将下肢坐骨神经该段切除，见大鼠患肢抽动，用生理盐水彻底冲清伤口，止血。3-0缝线依次缝合肌肉层、筋膜、皮肤，再次消毒^[17](切口及切除的坐骨神经见图1)。参照Hiltunen法做大鼠右侧标准胫骨横形骨折模型，以克氏针做髓内固定^[18-19]。在大鼠右下肢内侧备皮、消毒，切开皮肤约1 cm，然后屈曲膝关节，髌腱下端横行切开约0.5 cm小口，于胫骨平台前端中心点开口，插入0.8 mm的克氏针髓腔内固定，沿胫骨嵴纵向分离胫骨中上1/3处的肌肉，将插入的克氏针拔出2/3，用特制咬骨钳夹住胫骨，用力后听到“咔哒”声，检查胫骨已完全离断，生理盐水及时冲洗胫骨断面，然后将克氏针插入并对合胫骨，检查胫骨固定牢靠，伤口撒头孢硫脒粉末，缝合髌腱，逐层关闭切口^[17]。

实验组：术后按体质量给大鼠腹腔注射FGFR 3抑制剂PD173074[1 mg/(kg·d)]持续1周。对照组：同时间每天注射等剂量生理盐水。

1.4.4  影像学检查  2组大鼠麻醉后分别于术后4，7，10，14，21 d采用颈椎脱臼法处死，拍X射线片观察骨折愈合及骨痂生长情况。取整个患肢胫骨，取材过程中避免损伤骨膜及骨痂，拔除髓内针。取出标本迅速置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定48 h，随后做骨密度扫描(完整胫骨标本见图1)。

1.4.5  组织学分析  影像学检查完毕后，将标本泡入15%的EDTA中脱钙，每3 d换液1次，直至完全脱钙(针刺无阻力)。取出脱钙的胫骨，于骨折线上下4 mm处剪断作为标本，石蜡包埋，切片(厚度)5 μm，用苏木精-伊红染色，Masson三色法染色观察骨折愈合过程的病理变化。使用Masson三色法染色基本原理：肌纤维等呈现红色(丽春红和酸性品红作用)，胶原纤维呈现蓝色(被苯胺蓝所作用)，纤维越成熟染色越深^[21-22]。

1.4.6  骨形态计量分析  采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对所采集全部图片进行分析处理，并计算(纤维组织和新生骨占视野面积的百分比)。

1.5  主要观察指标  ①大鼠胫骨骨折后X射线片观察；②苏木精-伊红染色组织学观察；③Masson三色法染色组织学观察。

1.6  统计学分析  应用SPSS 17.0统计分析软件对数据行单因素方差分析，数据以x(_)±s表示。样本间比较均采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨折的愈合是非常复杂的生物修复过程，受到众多要素的影响^[24]。大量研究表明完整的神经支配在整个骨折愈合过程中起着十分重要的作用^[25]。人体的各种器官、组织和细胞均在神经系统的精密调控和监测下工作^[26]，骨折合并神经损伤后，可通过各种神经体液因素的反馈激活相关基因^[27]，作用在靶细胞，分泌促进骨折愈合的物质，影响骨折愈合进程。失去正常的神经支配，产生的骨痂在微观结构上有欠缺，钙盐沉积减慢、骨小梁稀疏、布列絮乱，生物力学性能不足^[2]。成纤维细胞生长因子与FGFR结合，能够使其自身磷酸化残基被激活，进而激活下游磷脂酶Cγ(PLCγ)，催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)转化为甘油二脂(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，进而调节细胞内外的Ca²⁺，对骨质的矿化及钙盐沉积产生影响^[28-31]。FGFR3在这些神经因素中起主要作用还是众多影响因素之一，也有可能与调节骨重建的各个信号通路相互联系起来参与骨折愈合，这些将是下一步探索方向。在骨折愈合过程中，骨痂的质量相较体积显然是更重要的^[32]。

FGFR3是成纤维细胞生长因子家族里唯一负性调控因子，主要在软骨内成骨中起作用^[33]。稳定的骨折愈合主要是由膜内成骨引起的^[34]，骨折端附近的间充质干细胞可在相关因子的刺激下直接分化为成骨细胞^[35]。软骨内成骨主要出现在不稳定性骨折中，因骨折断端不稳定，骨周围血管破坏，血供不足，骨折间充质细胞在相关因素的影响下分化为软骨细胞，形成骨痂，软骨细胞逐渐成熟、肥大、凋亡、血管长入，重建后被骨组织取代^[36-38]。大鼠胫骨神经支配主要是坐骨神经，此次实验采用坐骨神经损伤模型，参照Hiltunen法做大鼠右侧胫骨横形骨折，以克氏针做髓内固定，只是相对稳定，胫骨断裂处仍然可以围绕针转动，并可能相互产生摩擦，基本实现了失神经下的软骨内化骨模型^[39-41]。但骨折模型的制作很难完全一致，不能保证每个标本均是横形骨折，这也是实验需要改进的地方。作者利用FGFR3的负向调节作用，抑制FGFR3因子表达，得到了周围神经对骨折局部愈合的影响，更重要的是通过时间窗的对比找出了FGFR3这一负性调控因子的作用高峰时间段。

在以往文献中，研究骨折影响因素、观察骨折愈合的过程时，大部分仅从宏观上描述骨痂变化，或测量骨痂体积、称量湿质量，其可控性较差。此次研究也通过拍X射线片做了类似的对比，除此之外还从细胞分化和纤维化不同层面做了病理染色，将病理图片导入计算机图形软件系统，通过精确测量骨细胞和成分的比例得出了骨折愈合过程中的骨痂变化规律，其结果更精确，可信度更高。

综上所述，在大鼠周围神经损伤并骨折愈合中，抑制FGFR3能促进骨小梁和骨细胞的再生，加快骨痂纤维化进程，促使骨痂尽快成熟进入改造塑形期。该因子受体的表达有一定的时间变化规律，在大鼠骨折后7-14 d为其表达高峰阶段。知道这一点，虽然没有从根本上解决问题，但可以通过研究FGFR3来减少由去神经支配引起的负面影响，深化对病理性骨痂的认识，为失神经骨折的临床治疗提供参考。

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文题释义：

失神经骨折：机体骨折合并有各类、各层面神经的损伤。随着社会经济的飞速发展，这类骨折的发生也逐年增多，在愈合过程中表现出较单纯骨折愈合加速且骨痂过量生长，甚至在肌肉中出现异位骨化，尤其是关节周围的骨折，严重影响关节功能和治疗效果，已成为修复重建和组织工程领域的研究热点。

创伤性神经损伤：包括创伤性颅脑损伤、脊髓损伤和周围神经损伤。这类损伤伴有骨折的患者表现出较单纯骨折愈合加速且骨痂过量生长，甚至在肌肉中出现异位骨化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

成纤维细胞生长因子受体3是成纤维细胞生长因子家族里唯一负性调控因子，主要在软骨内成骨中起作用。稳定的骨折愈合主要是由膜内成骨引起的。骨折端附近的间充质干细胞可以在相关因子的刺激下直接分化为成骨细胞。

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