2.1  实验动物数量分析  造模时造模失败2只，死亡4只大鼠，及时补充，最终共有 108只大鼠(9组)进入结果分析。 

2.2  各组大鼠血清钙浓度比较  第2周，模型组血钙浓度高于假手术组、醇提物各剂量组、水提物中、低剂量组(P < 0.05)；第4周，模型组高于醇提物高剂量组、水提物低剂量组(P < 0.05)；假手术组高于醇提物高剂量组(P < 0.05)；第6周，模型组高于醇提物各剂量组、水提物高剂量组(P < 0.05)，与中华跌打丸组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见表2。

2.3  各组大鼠血清磷水平比较  第2周，模型组和中华跌打丸组血清磷水平低于醇提物高、中剂量组(P < 0.05)；第4周，假手术组低于模型组、中华跌打丸组、醇提物高剂量组、水提物低剂量组组(P < 0.05)，中华跌打丸组高于水提物高剂量组(P < 0.05)；第6周，假手术组低于水提物中剂量组(P < 0.05)。见表3。

2.4  各组大鼠血清碱性磷酸酶浓度  第2周，醇提物高剂量组血清碱性磷酸酶浓度高于假手术组、模型组、中华跌打丸组、醇提物低剂量组、水提物高剂量组、水提物低剂量组(P < 0.05)；第4周，醇提物高剂量组高于假手术组，低于模型组(P < 0.05)；第6周，醇提物高剂量组高于假手术组、模型组、醇提物中、低剂量组、水提物中剂量组(P < 0.05)，水提物高剂量组高于模型组、醇提物中剂量组(P < 0.05)。见表4。   

2.5  各组大鼠骨折断端X射线观察及评分  药物干预后第2周，模型组、醇提物低剂量组和水提物低剂量组3个组骨痂形成不明显，骨折线明显。而醇提物高、中剂量组，水提物高、中剂量组及中华跌打丸组骨折区可见少量骨痂形成，骨折线较模糊；第4周，模型组、醇提物中、低剂量组见骨痂少量显影，骨折断端开始变模糊，而醇提物高剂量组、水提物各剂量组和中华跌打丸组大部分标本均已完全形成骨性骨痂，有连续性骨痂通过骨折线，骨折线明显模糊，且醇提物高剂量组和水提物高剂量组显著；第6周，各组均达临床愈合标准，骨折线消失或显著模糊；而中华跌打丸组、醇提物高、中剂量组、水提物高剂量组骨折愈合塑形良好，髓腔已贯通(醇提物高剂量组显著)，醇提物低剂量组、水提物中、低剂量组欠佳。见图1。

通过参照X射线片Beck LS and Deguzman L评分系统进行骨折愈合状况半定量评定分析如下：第2，4，6周， 模型组X射线评分低于中华跌打丸组、醇提物各剂量组、水提物高、中剂量组(P < 0.05或P < 0.01)；中华跌打丸组X射线评分高于醇提物低剂量组、水提物低剂量组(P < 0.05)；醇提物高剂量组X射线评分高于中华跌打丸组、醇提物中、低剂量组、水提物各剂量组(P < 0.05)；水提物高剂量组、醇提物中剂量组X射线评分高于醇提物低剂量组、水提物中、低剂量组(P < 0.05)。见表5，图1。

2.6  三点弯曲生物力学结果  通过载荷-位移曲线计算最大载荷、最大挠度。各组模型骨折后的最大载荷及最大挠度随时间的延长逐渐增加。第2周，最大载荷、最大挠度各组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；第4周，模型组最大载荷低于中华跌打丸组、醇提物高、中剂量组、水提物高剂量组(P < 0.05，P < 0.01)。模型组最大挠度低于中华跌打丸组、醇提物高剂量组、水提物高剂量组(P <0.05)；中华跌打丸组、醇提物高剂量组最大载荷及最大挠度高于醇提物中、低剂量组，水提物中、低剂量组(P < 0.05)；水提物高剂量组最大载荷高于水提物中、低剂量组(P < 0.05)；水提物高剂量组最大挠度高于醇提物低剂量组、水提物中、低剂量组(P < 0.05)；第6周，模型组最大载荷及最大挠度低于中华跌打丸组，醇提物高、中剂量组，水提物高、中剂量组(P < 0.05)；中华跌打丸组最大载荷高于水提物中、低剂量组，低于醇提物高剂量组(P < 0.05)；中华跌打丸组最大挠度高于醇提物中、低剂量组，水提物中、低剂量组，低于醇提物高剂量组(P < 0.05)；醇提物高剂量组最大载荷及最大挠度高于醇提物中、低剂量组和水提物各剂量组(P < 0.05)；水提物高剂量组最大载荷高于水提物中、低剂量组(P < 0.05)；水提物高剂量组最大挠度高于醇提物中、低剂量组，水提物中、低剂量组(P < 0.05)。见表6，图2。

2.7  骨折端骨组织形态观察结果  第2周，模型组、水提物低剂量组出现有较多的炎细胞浸润及充血，表现为炎症反应；中华跌打丸组，醇提物各剂量组、水提物高、中剂量组形成较多的成纤维细胞和肉芽组织，骨小梁不成熟，排列稍紊乱、疏松，有轻度的充血；第4周，模型组、水提物低剂量组逐渐形成成纤维细胞，表现为慢性炎症反应；中华跌打丸组可见新生的毛细血管及肉芽组织；醇提物高剂量组炎细胞浸润，开始形成成纤维细胞，新生骨组织和纤维组织，可见骨板；醇提物中、低剂量组，水提物高、中剂量组炎细胞浸润，形成大量的成纤维细胞和骨小梁，已渐趋成熟伴有轻度充血；第6周，模型组、水提物低剂量组软骨的骨化尚在进行，以骨小梁为主的结构，排列已稍有序，表现为修复过程；中华跌打丸组、醇提物高剂量组、水提物高剂量组软骨的骨化完成，部分已基本骨性愈合，骨小梁形成，已较成熟及骨髓腔沟通。醇提物中、低剂量组、水提物低剂量组骨性骨痂(骨板)和纤维性骨痂形成。见图3。  

骨折是临床常见损伤，骨折愈合是指骨折断端之间再连接并进行自我修复的缓慢而复杂的修复过程^[1]。尽管多数骨折都能愈合，但仍有10%的患者发生延迟愈合^[2]，已证实10%-15%的骨折并发症源于延迟愈合和不愈合^[3-4]。骨折愈合延迟或不愈合导致患者再次入院手术，无形中增加患者的经济负担^[5-6]。其常见于四肢骨干骨折，在相关研究中四肢发生骨不连的发生率成一定比例(股骨∶胫骨∶肱骨∶尺桡骨为46∶29.6∶16.8∶7.5)^[7-8]，股骨骨折比率最高。因此，如何降低骨延迟愈合及骨不愈合的发生率，促进骨折保守治疗或者骨折术后的愈合，及早恢复患肢功能，成为临床骨折治疗的热点和难点之一^[9]。 

新疆西伯利亚接骨木为忍冬科，接骨木属植物，其根皮、茎叶、花朵均可用药^[10]。在民间习用其树皮和嫩枝(夏季采嫩枝，秋季采树皮，切成小段，晒干)入药，性味辛、温、入骨和关节，具有接骨续筋、活血止痛、祛风活络之功效^[11]，主要含有三萜苷元类化合物、甾醇类化合物、酚酸类化合物、芹菜素、芦丁、花青素等多种黄酮类成分及环烯醚萜和木脂素类等^[12]。西伯利亚接骨木在新疆自然分布只有1属1种，是阿尔泰山脉特有树种，即新疆道地药   材^[13]，有可探寻的悠久用药历史，为新疆民间促进骨折愈合常用药^[14]。查阅国内外文献发现^[15]，目前尚无类似的相关研究，薄弱的基础性研究会影响到西伯利亚接骨木的临床用药及开发利用。因此，研究将欲利用SD大鼠右下肢股骨干骨折模型，探讨西伯利亚接骨木树皮2种提取法所得提取物对促进骨折愈合的疗效，为临床用药提供理论的依据及进一步开发利用提供科学支撑。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年12月至2019年5月在新疆医科大学动物实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  清洁级3月龄健康雄性SD大鼠108只，体质量240-280 g，购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(新)2018-0003。相关操作符合国家关于动物实验的指导原则。所有实验动物于室温25-27 ℃、湿度50%-85%、SPF环境中自由摄食水。

1.3.2  药物  新疆西伯利亚接骨木树皮：新疆阿勒泰地区阿尔泰山脉采集8 kg新疆西伯利亚接骨木树皮，晒干，备用。药材经新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授鉴定为忍冬科西伯利亚接骨木树皮。  

1.3.3  实验用主要试剂及仪器  C004-2型钙测试盒、C006-3型磷测试盒、A059-2型碱性磷酸酶测试盒(批号：20190426)南京建成生物工程研究所提供。中华跌打丸：(批号：20180506)广西梧州制药(集团)股份有限公司提供。麻醉药：舒泰(剂型：舒泰^®50；剂量：大鼠(平均值)肌肉注：0.02 mL/kg；批号：20180403)法国维克有限公司生产。DC-NSG型实验型提取浓缩机(上海达程实验设备有限公司)，SP-TDL-5C低速多管家自动平衡离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，Varioskan Flash 全波长扫描式多功能读数酶标仪(Thermo Fisher)，ZK-DR型X射线机(北京中科美伦数字技术股份有限公司)，3005T型微机控制全数字化电子万能生物材料实验机(深市瑞格尔仪器有限公司)，EG1150(H+C)型包埋机(德国Leica)，LEICA石蜡切片机(德国)，OLYMPUS CX-3型双目显微镜(奥林巴斯中国有限公司)。 

1.4  实验方法

1.4.1  西伯利亚接骨木树皮提取物的制备  

(1)粗制备：将干燥的西伯利亚接骨木树皮剪成0.5-    1.0 cm大小的细段。将小块树皮各半分为醇提法组和水提法组后装在纱布袋内，备提。

(2)醇提法：取干燥的西伯利亚接骨木树皮4 kg , 加3倍量体积分数70%乙醇浸泡过夜，放电热套中加热60 ℃回流提取3 h，滤过，再加3倍量体积分数95%乙醇，加热60 ℃回流提取2 h，滤过，再加3倍量体积分数70%乙醇，加热60 ℃回流提取1 h，滤过，合并3次滤液，放冷，抽滤并浓缩，冷冻干燥，得469 g醇提物，备用。

(3)水提法：取干燥的西伯利亚接骨木树皮4 kg , 加5倍量蒸馏水浸泡过夜，放电热套中加热90 ℃回流提取3 h, 滤过，再加5倍量蒸馏水，加热90 ℃回流提取2 h，滤过，再加5倍量蒸馏水，加热90 ℃回流提取1 h，滤过，合并3次滤液，使其冷却，并抽滤，浓缩，冷冻干燥，得506 g水提物，备用。

1.4.2  大鼠右侧股骨干骨折模型造模  根据参考文献进行大鼠右侧股骨干骨折造模^[16-17]。适应性喂养1周后，大鼠称体质量，造模前禁食8 h(不禁水)。大腿肌肉注射舒泰(0.07 mL/kg)，麻醉生效后，取左侧卧位。备皮刀剃除右侧髋部及大腿外侧毛并体外定位，常规消毒。取右侧股外侧切口，长1.5-2.5 cm，依次切开皮肤、皮下组织，钝性分离股外侧肌，充分显露股骨干中段。以线锯截开股骨干内测骨皮质，然后用两把止血钳折断，清除游离小骨块；屈曲膝关节，用电钻将直径1 mm的克氏针从骨折端钻入并从股骨髁间穿出，用止血钳复位骨折断端并维持，反方向钻入克氏针穿出于股骨大转子；活动大鼠术膝关节，确认克氏针不在膝关节内，同时确认固定牢靠，剪除克氏针多余部分；适量生理盐水冲洗切口，逐层缝合。假手术组仅暴露股骨干，不做截骨。术后肌注青霉素50 mg/(kg·d)，连续注射3 d，分笼饲养。造模过程中造模不成功或死亡的大鼠及时排除并补充。

1.4.3  分组及给药  采用随机数字表法将其分成9组(12只/组)，分别为：①假手术组：未造模，给予蒸馏水；②模型组：造模，给予蒸馏水；③中华跌打丸组：阳性对照组，剂量为0.54 g/kg；④醇提取物高、中、低剂量组：剂量分别为0.314，0.157，0.078 g/kg；⑤水提取物高、中、低剂量组：剂量分别为0.340，0.170，0.085 g/kg。大鼠给药剂量均参考成人用药剂量进行相应换算：据文献[18]，西伯利亚接骨木树皮成人用药剂量为15 g/kg(1次/d)，大鼠给药剂量按人和动物药物等效剂量换算公式计算^[19]；2种提取物和跌打丸成人(按体质量60 kg常人为标准)的临床用药剂量折算成大鼠的用药剂量(均指提取物剂量)。各组造模后第1天开始每天定时以经口灌胃方式连续给药6周(晨10：00-11：00时，1次/d)；假手术组和模型组灌胃等体积蒸馏水。

1.5  主要观察指标

1.5.1  骨折断端X射线观察及评分  各组分别于药物干预后第2，4，6周时随机选取4只大鼠，麻醉下(肌肉注射舒泰，0.07 mL/kg)拍摄DR片(40 kV、2 mAs、4 ms条件下)，3名观察者(2名高年资骨科主治医师，1名经验丰富的放射科医师)按Beck LS and Deguzman L评分系统^[20](见表1)进行骨折愈合状况半定量评定，如有异议，通过讨论最终达成一致意见为准。 

1.5.2  检测血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶水平  摄X射线片后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，常规脱毛、消毒腹部，取横切口，暴露腹主动脉并采血5 mL。血标本静置30 min，用低温高速离心机离心20 min(15 000 r/min，离心半径250 mm)；用微量移液器吸取上层血清，严格按照试剂盒说明书步骤，测定血清中Ca、P、碱性磷酸酶水平。

1.5.3  三点弯曲生物力学测试  抽血后立即原切口显露股骨干并取出之，刮除其表面肌肉、筋膜等软组织残留，抽出克氏针。在新疆大学(南校区)机械学院强度测定室，根据文献报道的方法^[21-22]，采用微机控制全数字化电子万能生物材料试验机，将大鼠游离股骨进行三点弯曲试验。股骨标本置于测试支架上，股骨尺面向下，跨距L=19 mm骨折线居中，T型头正对骨折线上方，以2 mm/min速度匀速下降，直至标本断裂。量取骨干正中的内外径，由载荷，桡度换算并绘制应力应变曲线，从曲线上读取及计算最大载荷、最大挠度^[21-22]。

1.5.4  骨折端骨组织形态观察  完成三点弯曲实验后，截断股骨头，将股骨干浸泡于EDTA脱钙液(pH 7.2)；脱钙完成后，手工脱水；脱水后包埋；用LEICA石蜡切片机沿长轴方向将骨折断端骨质做成切片(厚5 μm)，进行苏木精-伊红染色和封固，待干燥后，用显微镜观察其组织形态学变化。 

1.6  统计学分析  采用SPSS 21.0统计软件包进行数据处理，所有数据以x(_)±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两样本均数比较用独立样本的t 检验，以(P < 0.05)为差异有显著性意义。

据文献报道，不同地区分布的接骨木属研究有所不同，如在中国东北、华北、华东、华中、甘肃、四川、云南等地区分布的接骨木^[23]。研究发现，东北等地区接骨木根皮的提取物在骨折治疗上取得了显著的疗效，有疗程短、功能恢复快、无毒副作用等特点^[24-25]。实验研究已确定接骨木根皮促进骨折愈合的有效部位主要为成分^[26]。韩华^[27]对接骨木根皮促进骨折愈合作用的研究中发现接骨木根皮通过促进成骨细胞的分裂增殖、分泌碱性磷酸酶加快骨基质钙化，促使新骨形成的同时也具有促进坏死骨的吸收作用。赵湘婷^[28]研究报道，家兔用人工的方法造成骨折模型，外敷接骨木茎枝制成的酊剂可明显促进骨痂的形成和钙、磷在骨折部位的沉积。同一种接骨木属的药材成长于不同的自然环境，水土、气候、日照、分布等的差异，使得不同的药材，从而逐渐形成了“道地药材”。药材自然环境条件的改变可导致药材的变迁，药材的产地、采收与贮存是否适宜，也是直接影响药材的重要因素^[29-30]。水提法中，水是一种强的极性溶剂，中药中亲水性的成分能被水溶出，但亲脂性强的成分不易被水溶出，而且提取物易霉坏变质。醇提法也就是以乙醇提取最常用，乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强，难溶于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大、提取时间也短^[31-32]。

在骨的无机成分中，Ca和P是最主要的部分。骨是人体内Ca、P的储存库，人体中约有99%的Ca和85%的P存在于骨中。Ca和P作为人体骨骼中最基本的矿物质元素，在骨骼代谢中至关重要，其含量的升高与降低将直接影响骨的代谢过程，且与骨的钙化、溶解以及成骨、破骨有着密切的联系。一般说，血Ca和血P水平的基本恒定是维持人体基本生理功能，骨组织正常成长、更新的必要条件^[33]。此次实验发现，西伯利亚接骨木树皮2种提取物组血Ca水平低于假手术组和模型组，说明2种提取物对大鼠成骨速度快，骨折处需要较多的钙盐沉积，促进骨折愈合，所以血中游离Ca减少(各期醇提物高剂量组血Ca低于假手术组、模型组，故醇提物高剂量组成骨速度快，其次醇提物中、低剂量组、水提物高剂量组)。而2种提取物组血P水平高于假手术组及模型组，由于体内存在着健全的调节系统，可使P的排泄量下降，血P浓度升高^[34]。这说明2种提取物可以使促进血Ca降低，并能升高血P，从而保证了血Ca、P之间的平衡关系，所以Ca、P沉积仍为正常。这就促进了骨盐的形成与沉积，保证了骨折的愈合(醇提物高剂量血P高于假手术组、模型组、中华跌打丸组)。

碱性磷酸酶在骨骼、肝、脾、肾上腺等处合成，其中骨骼和肝脏合成最高，约各占总量一半。成骨细胞分泌的碱性磷酸酶可以渗入血液中，故血清碱性磷酸酶含量与成骨细胞数量和成骨细胞活性呈正相关^[35]。破骨细胞与成骨细胞在体内保持动态平衡是维持骨骼完整性的关键。破骨细胞的分化被成骨细胞所调节，使其更好地参与到骨吸收的过程中。成骨细胞的活性及成骨作用的变化与血清碱性磷酸酶的活力密切相关^[36]。很多与骨折关系密切的细胞如骨母细胞、血管骨内皮细胞在骨折愈合过程中均会合成、分泌丰富的碱性磷酸酶使血清碱性磷酸酶升高^[37-38]。因此，目前将碱性磷酸酶作为成骨细胞活动的标志，碱性磷酸酶含量升高则表示成骨细胞活动旺盛。此次实验发现，2种提取物血碱性磷酸酶活性比假手术组、模型组、阳性对照组显著升高(各期醇提物高剂量组血碱性磷酸酶显著升高于其他组，故醇提物高剂量组成骨细胞活动旺盛，其次为水提物高剂量组)，这说明2种提取物(醇提物高剂量组显著)具有骨折部位细胞增殖及促进骨折愈合的作用，其能通过激活碱性磷酸酶来促进骨折大鼠成骨。

X射线片、镜下观察是评判骨折愈合进展的最直接方法^[39]，其证明，2种提取物可促使大鼠骨折区的愈合(醇提物高剂量组显著，中华跌打丸组、水提物高、中剂量组，醇提物中剂量组良好，醇提物低剂量组、水提物低剂量组欠佳)。三点弯曲力学试验是常用的骨生物力学特性测定方法之一，可以较好地反映骨折愈合情况和了解骨折愈合过程中骨痂生物力学的变化，有助于该研究的深入。载荷是衡量骨骼所能承受外力的指标，其数值与骨的强度成正比；挠度是反映骨骼柔韧性的指标，其数值与骨基质中胶原蛋白的含量有关^[40]。此次研究通过对生物力学指标的检测发现，第4，6周西伯利亚接骨木树皮2种提取物对大鼠股骨的最大载荷、最大挠度值高于模型组和阳性对照组，这说明，2种提取物有助于重建骨组织结构，改善骨质量，促进骨骼强度和韧性的恢复(醇提物高剂量组明显升高，中华跌打丸组、水提物高、中剂量组，醇提物中剂量组良好、醇提物低剂量组、水提物低剂量组欠佳)。

结论：由此可见，新疆西伯利亚接骨木树皮2种提取物具有很好的促进骨折愈合的作用，其在骨折愈合中的促进作用可能涉及多个因素和复杂的调控。此次实验中，2种提取物能通过在骨折愈合的不同阶段降低血钙、提高血磷及碱性磷酸酶的含量来助其快速成骨，这为骨折的临床治疗提供了理论基础。作者发现，2种提取法和不同给药剂量所引起的疗效有所不同。醇提物高剂量组对促使大鼠骨折区的愈合作用明显高于其他组(水提物高、中剂量组、醇提物中剂量组良好、低剂量组欠佳)，故醇提物组促进骨折愈合的作用优于水提物组，2种提取物高剂量组对其骨折愈合的疗效高于中、低剂量组，醇提法优于水提法。这有可能新疆西伯利亚接骨木树皮成分不易被水溶出，而乙醇的溶解性能比较好、对西伯利亚接骨木树皮细胞的穿透能力较强、溶解度较大有关。这为进一步开发利用新疆西伯利亚接骨木树皮提供了科学支撑。

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文题释义：

新疆西伯利亚接骨木：为忍冬科，接骨木属植物，其根皮，茎叶，花朵均可用药。在民间习用其树皮和嫩枝(夏季采嫩枝，秋季采树皮，切成小段，晒干)入药。性味辛、温、入骨和关节，具有接骨续筋、活血止痛、祛风活络之功效。主要含有三萜苷元类化合物、甾醇类化合物、酚酸类化合物、芹菜素、芦丁、花青素等多种黄酮类成分及环烯醚萜和木脂素类等。

醇提法：是以乙醇提取最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强，难溶于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大、提取时间也短。

水提法：水是一种强的极性溶剂，中药中亲水性的成分，能被水溶出。但亲脂性强的成分不易被水溶出，而且提取物易霉坏变质。

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研究发现，东北等地区接骨木根皮的提取物在骨折治疗上取得了显著的疗效，有疗程短、功能恢复快、无毒副作用等特点。实验研究已确定接骨木根皮促进骨折愈合的有效部位主要为成分_。同一种接骨木属的药材成长于不同的自然环境，水土，气候，日照，分布等的差异，使得不同的药材，从而逐渐形成了“道地药材”。药材自然环境条件的改变可导致药材的变迁，药材的产地，采收与贮存是否适宜，也是直接影响药材的重要因素。

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