制备异甘草素壳聚糖纳米粒抑制人肺癌细胞A549的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1360

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (26): 4200-4205.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1360

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制备异甘草素壳聚糖纳米粒抑制人肺癌细胞A549的增殖

吕文娟¹，刘福定²，王桃姣³，万浪³，陈芳¹

¹武汉大学人民医院心内科，湖北省武汉市 430060；鄂东医疗集团黄石市中心医院， ²院感办，³耳鼻咽喉科，湖北省黄石市 435000

收稿日期:2019-04-02
通讯作者: 陈芳，博士，主任护师，武汉大学人民医院心内科，湖北省武汉市 430060
作者简介:吕文娟，女，1987年生，湖北省大冶市人，汉族，武汉大学第一临床学院在读硕士，主要从事临床护理研究。
基金资助:
湖北省卫计委科研项目(WJ2017M253)，项目负责人：陈芳

Preparation of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles and their inhibitory effects on the proliferation of human lung cancer cell line A549

Lü Wenjuan¹, Liu Fuding², Wang Taojiao³, Wan Lang³, Chen Fang¹

¹Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ²Hospital Infection Office, ³Department of Otolaryngology, Huangshi Central Hospital, Edong Healthcare, Huangshi 435000, Hubei Province, China

Received:2019-04-02
Contact: Chen Fang, MD, Chief nurse, Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Lü Wenjuan, Master candidate, Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
Hubei Provincial Health Planning Commission Scientific Research Project, No. WJ2017M253 (to CF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

壳聚糖：是甲壳质脱乙酰化产物，其本质是一种带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，自1859年被法国人Rouget率先发现以来，因其具有生物相容性、抗细菌和能被生物降解等独特的理化性能而被广泛应用于生物医学工程、食品化工和环保治污等领域。

纳米颗粒：人工制造的、大小不超过100 nm的微型颗粒叫做纳米颗粒，纳米颗粒不仅是一种微小粒子更是一门学问，自从1984年德国科学家Gleiter等首次用惰性气体凝聚法成功地制得铁纳米微粒以来，标志着纳米科学技术正式诞生。

背景：异甘草素是一种异黄酮化合物，有着很强的药理活性如抗癌、抗病毒、抗糖尿病等，但水溶性差，这极大地限制了其临床应用。

目的：制备异甘草素壳聚糖纳米粒，探讨其在体外对人肺癌细胞A549生长的抑制作用。

方法：以壳聚糖为载体材料，异甘草素为模型药物，三聚磷酸钠为离子交联剂，利用离子交联法制备异甘草素壳聚糖纳米粒，测定其粒径、分散度和Zeta电位，通过透射电镜观察纳米粒形态，通过离心测定其包封率和载药量。将异甘草素与甘草素壳聚糖纳米粒分别置于透析袋内，以PBS为释放介质，动态观察其体外释放。分别以含不同质量浓度(1，5，25 mg/L)异甘草素、甘草素壳聚糖纳米粒及壳聚糖纳米粒的培养液培养人肺癌细胞A549，培养48 h后，采用MTT法检测细胞增殖，计算细胞生长抑制率。

结果与结论：①异甘草素壳聚糖纳米粒为球形或类球形，结构完整，大小较为均一，纳米粒平均粒径为 (159±20) nm，Zeta电位为+17.2 mV，分散度为0.243，包封率和载药量分别为(85.28±1.31)%和(13.28±0.53)%；②游离异甘草素在8 h内释放完毕；异甘草素壳聚糖纳米粒具有缓慢释放特性，72 h累积释放量达83.98%，体外释药过程符合一级动力学方程；③不同质量浓度的壳聚糖纳米粒对A549细胞生长无抑制作用；异甘草素、异甘草素壳聚糖纳米粒均呈浓度依赖性抑制A549细胞的生长，并且相同质量浓度下，异甘草素壳聚糖纳米粒对A549细胞生长的抑制作用强于异甘草素(P < 0.05)；④结果表明采用离子交联法制备的异甘草素壳聚糖纳米粒，具有良好的缓释性能，提高了异甘草素在体外对A549细胞增殖的抑制作用。

ORCID: 0000-0001-7587-3074(吕文娟)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 异甘草素, 壳聚糖, 纳米粒, 离子交联法, 纳米颗粒, 肿瘤, A549, 细胞增殖, 抑制作用

Abstract:

BACKGROUND: Isoliquiritigenin, one kind of isoflavone compounds, has a wide range of biological activities, such as anti-cancer, anti-virus, and anti-diabetes, but its clinical application is limited by its poor water solubility.

OBJECTIVE: To prepare chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles and investigate their inhibitory effects on human lung cancer cell line A549 in vitro.

METHODS: The chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles were prepared by ionic gelation method with chitosan as the carrier material, isoliquiritigenin as the model drug, and sodium tripolyphosphate as the ionic crosslinking agent. The nanoparticle size, dispersion, and Zeta potential were investigated by malvern laser particle size analyzer. The morphology of the nanoparticles was observed by transmission electron microscopy. The encapsulation efficiency and cumulative release rate of the nanoparticles were measured by centrifugation. Isoliquiritigenin and chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles were placed in dialysis bags and their dynamic release was determined in PBS buffer. Human lung cancer cell line A549 was cultured in different concentrations (1, 5, 25 mg/L) of isoliquiritigenin, chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles, and chitosan nanoparticles. MTT assay was used to investigate the inhibitory effects of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles on human lung cancer cell A549 in vitro after 48 hours of culture. The growth-inhibitory rate was calculated.

RESULTS AND CONCLUSION: The chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles were spherical or quasi spherical in shape with complete structure and of relatively uniform size. The average particle size, dispersion and Zeta potential of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles were (159±20) nm, 0.243 and +17.2 mV, respectively. The encapsulation efficiency and cumulative release rate of the nanoparticles were (85.28±1.31)% and (13.28±0.53)% respectively.The release of free isoliquiritigenin was completed within 8 hours, while the chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles had sustained release property in vitro, with 72-hour cumulative release amount of 83.98%. This well fitted the first-order kinetic model. Chitosan nanoparticles at different concentrations had no inhibitory effects on the growth of A549 cells. Both isoliquiritigenin and chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles inhibited the growth of A549 cells in a concentration-dependent manner, and the inhibitory effect of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles was stronger than that of isoliquiritigenin when used at the same concentration (P < 0.05). The results suggest that the chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles prepared by ionic crosslinking method had encouraging sustained release performance and enhanced the inhibitory effects of isoliquiritigenin on the proliferation of A549 cells in vitro.

Key words: isoliquiritigenin, chitosan, nanoparticle, ionic crosslinking method, tumor, A549, cell proliferation, inhibitory effect

中图分类号:

吕文娟，刘福定，王桃姣，万浪，陈芳. 制备异甘草素壳聚糖纳米粒抑制人肺癌细胞A549的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(26): 4200-4205.

Lü Wenjuan, Liu Fuding, Wang Taojiao, Wan Lang, Chen Fang. Preparation of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles and their inhibitory effects on the proliferation of human lung cancer cell line A549[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(26): 4200-4205.

图/表（结果） 5

2.1 异甘草素壳聚糖纳米粒的表征制备好的纳米粒经透射电镜拍照，如图1所示，透射电镜下空白壳聚糖纳米粒和异甘草素壳聚糖纳米粒均为球形或类球形，结构完整，大小较为均一，无粘连现象。

经测定，当壳聚糖纳米粒未载药物时其粒径为50- 100 nm，当负载异甘草素时其粒径逐渐增大为100-200 nm，平均粒径(159±20) nm，Zeta电位为+17.2 mV，分散度为0.243，表明所制备纳米颗粒分布均匀、性质稳定，粒子间静电作用良好、不易发生聚集。

2.2 异甘草素壳聚糖纳米粒的包封率和载药量结果如表2所示，异甘草素壳聚糖纳米粒的平均包封率为(85.28±1.31) %，平均载药量为(13.28±0.53)%。

2.3 异甘草素壳聚糖纳米粒的体外药物释放游离异甘草素在8 h内释放完毕。异甘草素壳聚糖纳米粒的释放效果可明显地分为2个阶段：前期释药较快，这包含了纳米颗粒表面吸附着的未被包封的异甘草素的释放；后期释药较慢，由纳米颗粒内部的药物逐渐释放引起，其中6 h累积释放量约为52.71%，12 h后释放趋于平缓，72 h累积释放量达到了83.98%，见图2。上述结果表明异甘草素壳聚糖纳米粒缓释作用明显。对异甘草素壳聚糖纳米粒的累积释药曲线进行释药模型拟合，见表3，由拟合方程的相关系数可看出异甘草素壳聚糖纳米粒的释放曲线比较符合一级动力学方程。

2.4 体外抑制癌细胞增殖的活性由图3可知，壳聚糖纳米粒对A549细胞的生长几乎没有抑制作用。异甘草素在3 种质量浓度下对A549细胞均有生长抑制作用，且呈剂量依赖性，对A549细胞的生长抑制率分别为(13.65±1.96)%，(41.18±2.37)%，(64.16±3.13)%；异甘草素壳聚糖纳米粒在3种质量浓度下对A549细胞的生长抑制率分别为(32.13±1.88)%，(61.98±3.19)%，(85.39±2.69)%，两者同质量浓度下相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明异甘草素壳聚糖纳米粒对A549肿瘤细胞生长的抑制能力相比于游离异甘草素得到了提高。

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引言

材料方法

1.1 设计载药纳米颗粒制备，体外细胞实验。

1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年12月主要在武汉大学人民医院完成，部分指标检测在鄂东医疗集团黄石市中心医院、武汉大学纳米科学与技术研究中心完成。

1.3 材料壳聚糖(脱乙酰度95%)，由武汉远成共创科技有限公司提供，见表1；三聚磷酸钠(国药集团化学试剂北京有限公司)；异甘草素(武汉海瑞生物科技有限公司)；人肺癌细胞A549(武汉大学基础医学院)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)；QL 861涡旋混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；JEM 1400电子透射显微镜(日本JEOL)；90-2型磁力搅拌器(上海泸西分析仪器厂有限公司)；UV-2201 紫外分光光度计(日本岛津公司)；Zetasizer Nano ZS型激光粒度及其电位分析仪(英国Malvern公司)；MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 异甘草素壳聚糖纳米粒的制备采用离子交联法制备纳米颗粒。将20 mg壳聚糖溶于10 mL 1%醋酸溶液中，用NaOH溶液调节pH值至5.6，不断磁力搅拌并逐滴滴加异甘草素的甲醇溶液，使载体与药物的质量比为4∶1，然后逐滴滴加三聚磷酸钠溶液(1 g/L)，得到有乳光的溶液，在30-40 ℃持续搅拌反应10-30 min，所得溶液透析24 h，0.45 μm膜过滤后即得到异甘草素壳聚糖纳米粒悬液，冷冻干燥即得异甘草素壳聚糖纳米粒冻干粉。用同样方法制备得到不载药的空白壳聚糖纳米颗粒。

1.4.2 纳米粒的粒径与表面形貌取异甘草素壳聚糖纳米粒冻干粉适量，分散于双蒸水中，Zetasizer Nano ZS分析仪依次测定样品的粒径、Zeta电位和分散度，每个样品测量3次，取平均值。

在透射电镜下观察粒子的形貌，首先吸取少量样品滴加在覆盖有碳膜的铜网上、室温晾干，再滴加20 g/L的磷钨酸作负染、晾干，最后置于JEM 1400型(加速电压40-120 kV)透射电镜下观察并拍照。

1.4.3 纳米粒的包封率和载药量

标准曲线制作：异甘草素紫外光谱检测的最佳紫外吸收峰是368 nm。称取5 mg异甘草素于10 mL容量瓶，用甲醇溶解、定容，即得到 0.5 g/L的异甘草素溶液。取2 mL该母液至新的10 mL容量瓶，甲醇定容，即稀释5倍得到100 mg/L的异甘草素标准溶液。将得到的标准溶液倍比稀释可得一系列不同质量浓度的异甘草素标准溶液(100，50，25，12.5，6.25，3.125 mg/L)，分别测定其在368 nm处的吸光度，以异甘草素的质量浓度、吸光度分别做为横、纵坐标可得到线性回归方程A=0.192 1C-0.066 2(R=0.998 5)。

包封率和载药量测定：取准备好的异甘草素壳聚糖纳米粒混悬液于12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用标准曲线计算异甘草素含量(记为m₁)，将离心的沉淀用PBS液洗涤3次，干燥称质量，质量记为m₂。制备时加入异甘草素的质量记为m₃。按照以下公式计算载药量和包封率，做3个平行测定。载药量=(m₃-m₁)/m₂×100%，包封率=(m₃-m₁)/m₃×100%。

1.4.4 体外释放实验经动态透析法测定异甘草素壳聚糖纳米粒的体外释药效果。精密移取异甘草素壳聚糖液 2 mL，置于预处理好的透析袋内(截留相对分子质量为 3 500)，以50 mL PBS(pH=7.4)为释放介质，于(37.0± 0.5) ℃恒温，70 r/min转速搅拌，0，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24，48，72 h取透析液5 mL，同时补充等量的释放介质，用紫外分光光度计于最大吸收波长368 nm处对取出样品进行测定，每个时间点测量3次，以此绘制异甘草素壳聚糖纳米粒的体外释药曲线。

1.4.5 体外抗肿瘤活性研究采用MTT法检测异甘草素壳聚糖纳米粒对人肺癌细胞A549的生长抑制作用。将人肺癌细胞A549在含体积分数5%CO₂、37 ℃及饱和湿度条件下培养，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，48 h后胰酶消化成单个细胞，稀释至1×10⁷ L^-1的细胞浓度，用移液枪吸取单细胞悬液铺于96孔板(100 μL每孔)，置培养箱孵育24 h使其贴壁完全：实验组分别加入100 µL含不同质量浓度(1，5，25 mg/L)异甘草素、壳聚糖和异甘草素壳聚糖纳米粒的培养液，对照组加入等体积培养液，每组做5个平行对照孔，在37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中继续培养48 h。之后弃去培养液，用200 μL PBS离心洗涤1次，用无血清DMEM将MTT配制成5 g/L，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中继续培养4 h，去除上层培养液，在避光条件下加入DMSO (100 μL每孔)，随后将细胞培养板震荡10 min，之后经酶标仪于570 nm处检测每孔的吸光度A值，计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(1-A值实验组/A值对照组)×100%。

1.5 主要观察指标异甘草素壳聚糖纳米粒的理化性能与体外抗肿瘤作用。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有数据均以x(_)±s表示，用 t 检验进行显著性分析，当 P < 0.05即表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

纳米药物是现代生物医学工程领域的热点之一，药物被分散、包封、吸附于纳米载体上，通过囊壁沥滤、渗透和扩散释放出来，与传统药物相比具有许多优点，能提高药物在水溶液中的含量及其在水溶液中的稳定性，还可以缓释药物降低药物的毒副作用。

壳聚糖纳米颗粒的制备方法主要包括离子交联法、沉淀法、共价交联法、大分子复合法等^[22]。大分子复合法即通过相反电荷的带负电的大分子与作为带正电的壳聚糖链在溶液中进行复合^[23-24]，借助于两者的相互作用而形成壳聚糖纳米颗粒，虽然这种方法工艺简单，但它更适用于制备基因药物的壳聚糖纳米颗粒，有粒径小、稳定性好等优势；共价交联法即利用壳聚糖分子链上的氨基或羧基与一些化学交联剂发生反应^[25-26]，但是制备过程中所用的交联剂毒性大，会对细胞的存活率和大分子药物的完整性产生不利的影响；沉淀法也称为去溶剂法或凝聚法，是利用壳聚糖不溶于碱性递质及遇碱沉淀凝聚的性质制备纳米粒，其优点是可以根据不同制备需要而选择不同相对分子质量的壳聚糖、调节搅拌速率或超声强度，不足之处在于所获得的纳米粒尺寸较大，有的甚至大于1 000 nm，应用受到限制^[27-28]。

离子交联法是迄今制备壳聚糖纳米颗粒应用最广泛的方法，最初由Bodmeier等^[29]于1989年首次报道，并由Calvo等^[30]于1997年在此基础上进行改良，该方法可在室温下操作，不需要经过高温高压或借助于有毒的有机溶剂，能很好地保留所包载药物的生物活性，所得到的纳米颗粒大小均一、稳定、质量可控^[31-32]，故此次实验采用离子交联法制备异甘草素壳聚糖纳米颗粒。三聚磷酸钠是应用最为广泛的离子交联剂，在酸性条件下三聚磷酸钠磷酸根离子在水溶液中携带负电荷，壳聚糖分子中存在的大量游离氨基可发生质子化而带正电荷，两者通过静电引力而发生交联，当溶液中同时加入药物将形成载药壳聚糖纳米颗粒，壳聚糖-三聚磷酸钠交联法已用于多种药物纳米制剂的制备^[33-35]。任振堃等^[36]在0.1%乙酸溶液中加入柚皮素和壳聚糖，使壳聚糖：柚皮素的质量比约为3∶5∶1，然后加入1 g/L的三聚磷酸钠溶液，最终得到粒径139 nm的载柚皮素壳聚糖纳米颗粒；吴振宇等^[37]在常温下先配制壳聚糖的1%醋酸溶液，然后将制备三聚磷酸钠的水溶液通过调节其pH值至弱碱性，使其暴露出带负电的磷酸根，然后将三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖中，保持壳聚糖与三聚磷酸钠质量比在3∶1- 6∶1之间即可得到较好的纳米颗粒。此次实验根据文献数据和前期摸索设定壳聚糖：柚皮素的质量比约为4∶1，滴加 1 g/L的三聚磷酸钠时控制其与壳聚糖(2 g/L)的质量比在 1∶6-1∶3之间，结果确实得到结构完整、大小较为均一、纳米粒平均粒径为(159±20) nm的载药纳米颗粒。

目前以壳聚糖这种天然高分子材料制备异甘草素纳米粒的研究还未见报道，壳聚糖具有无毒、成粒性好等特点，适合作为水溶性差中药有效成分的缓释载体，多种难溶的药物成分(如雷公藤甲素、姜黄素等)制备成由壳聚糖包载的纳米颗粒已见报道，陈瑞等^[38]的实验显示雷公藤甲素-壳聚糖纳米颗粒的包封率为(77.0±1.2)%，载药量为(2.0±0.4)%，药物释放速率在24 h内持续稳定，缓释效果显著；彭琳等^[39]研究你现实姜黄素-壳聚糖纳米颗粒最高的包封率达(97.8±4.8)%，载药量最高为(8.89±0.38)%。此次实验中异甘草素水溶性差，经制备成壳聚糖纳米颗粒，其包封率和载药量分别为(85.28±1.31)%和(13.28±0.53)%，72 h累积释放量达83.98%，且对A549增殖的抑制效果显著高于游离异甘草素，由此可见异甘草素壳聚糖纳米颗粒性能良好，可用作进一步的体外活性研究。

总之，研究以壳聚糖为载体包载异甘草素，利用温和的离子交联法制备得到了异甘草素壳聚糖纳米粒，所得纳米粒粒径比较均一，形态圆整，有着具有包封率和缓释效果，且体外实验表明其对肺癌A549细胞的抑制作用高于游离异甘草素。实验为异甘草素纳米制剂的开发提供了一定的参考依据，然而有关体内释放及毒性尚有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

制备异甘草素壳聚糖纳米粒抑制人肺癌细胞A549的增殖

Preparation of chitosan/isoliquiritigenin nanoparticles and their inhibitory effects on the proliferation of human lung cancer cell line A549

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