甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡、侵袭与miR-93的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0957

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3987-3992.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0957

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甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡、侵袭与miR-93的影响

何新制¹，卢冠铭²，浦涧³，韦忠恒⁴，马燕飞¹，陈永诚¹，覃强¹，黄前方¹，罗志斋¹

¹靖西市人民医院普通外科，广西壮族自治区靖西市 531600；右江民族医学院附属医院，²腺体外科，³肝胆外科，⁴肿瘤科，广西壮族自治区百色市 533000

修回日期:2018-03-12 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 卢冠铭，博士，副教授，副主任医师，右江民族医学院附属医院腺体外科，广西壮族自治区百色市 533000
作者简介:何新制，1980年生，广西壮族自治区靖西市人，主治医师，主要从事普外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81060028)；广西教育厅项目(KY2016YB342)

miR-93 effects on the proliferation, apoptosis and invasion of tumor stem cells in thyroid papillary carcinoma

He Xin-zhi¹, Lu Guan-ming², Pu Jian³, Wei Zhong-heng⁴, Ma Yan-fei¹, Chen Yong-cheng¹, Qin Qiang¹, Huang Qian-fang¹, Luo Zhi-zhai¹

¹Department of General Surgery, Jingxi People’s Hospital, Jingxi 531600, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ²Department of Gland Surgery, ³Department of Hepatobiliary Surgery, ⁴Department of Oncology, Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2018-03-12 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Lu Guan-ming, M.D., Associate professor, Associate chief physician, Department of Gland Surgery, Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:He Xin-zhi, Attending physician, Department of General Surgery, Jingxi People’s Hospital, Jingxi 531600, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060028; the Project of the Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. KY2016YB342

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
miR-93：microRNA(简称miR)是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码小RNA，长18-25 nt，进化具有高度保守性，可调控细胞的周期及凋亡，在人类疾病与肿瘤发生及进展中扮演着重要角色。miR-93属于miR-106b-25家族，位于染色体7q22.1，研究证实其在衰老、高血糖症、成骨细胞钙化中发挥了重要作用，同时还参与了肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤的发生及进展。
CD44：对CD44的研究时间较长、较深入亦较广泛。已知其为分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性黏附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的黏附，异质性黏附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。

摘要
背景：前期研究发现，miR-93作为保护因子而非致病因子参与甲状腺腺瘤及其应激胰岛素抵抗的发生和发展。
目的：研究miR-93对甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。
方法：采用流式细胞技术从人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中分选CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞与非CD44⁺CD24^-细胞，检测两种细胞中miR-93基因的表达。取CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，分别转染miR-93模拟物与miRNA模拟物对照，采用CCK-8法、流式细胞技术、Transwell小室检测细胞增殖、凋亡、侵袭能力，采用Western Blot 检测细胞增殖蛋白Ki67、凋亡蛋白Bax及Bcl-2、侵袭标志蛋白MMP-2及MMP-9的表达。
结果与结论：①CD44⁺CD24^-细胞中的miR-93表达明显低于非CD44⁺CD24^-细胞(P < 0.05)；②转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖速度明显慢于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)，细胞增殖蛋白Ki67表达明显低于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)；③转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡率明显高于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)，促凋亡蛋白Bax表达高于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)；④转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力、侵袭标志蛋白MMP-2及MMP-9表达均明显低于转染miRNA模拟物对照组(P < 0.05)；⑤结果表明，miR-93可抑制甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力，促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9186-2973(何新制)

关键词: 甲状腺乳头状癌, 肿瘤干细胞, miR-93, 细胞增殖, 细胞凋亡, 细胞侵袭, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that miR-93 acts as a protective factor rather than a virulence factor involved in the occurrence and development of thyroid adenomas and stress insulin resistance.
OBJECTIVE: To study the effect of miR-93 on the proliferation, apoptosis and invasion of tumor stem cells in thyroid papillary carcinoma.
METHODS: Flow cytometry was used to sort CD44⁺CD24^- cells (cancer stem cells) and CD44⁺CD24^- cells in human thyroid cancer cells TPC-1. The expression levels of miR-93 gene were detected in these two kinds of cells. CD44⁺CD24^-cancer stem cells were transfected with miR-93 mimics and miRNA mimics. Then, cell proliferation, apoptosis and invasion were detected through cell counting kit-8, flow cytometry, Transwell assay, respectively. Western blot assay was also used to measure expression of Ki67, Bax, Bcl-2, matrix metalloproteinases 2 and 9.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of miR-93 in CD44⁺CD24^- cells was significantly lower than that in non-CD44⁺CD24^- cells (P < 0.05). CD44⁺CD24^- tumor stem cells transfected with miR-93 mimics exhibited lower proliferation (P < 0.05) and lower Ki67 expression than those transfected with miRNA mimics (P < 0.05). Compared with the miRNA mimics group, higher apoptotic rate, higher Bax expression and lower Bcl-2 expression were detected in the miR-93 mimics group (P < 0.05). Cell invasion ability and expression levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 were also lower in the CD44⁺CD24^- cancer stem cells transfected with miR-93 mimics than those transfected with miRNA mimics (P < 0.05). Our experimental findings suggest that miR-93 can inhibit the proliferation and invasion of tumor stem cells in thyroid papillary carcinoma and promote cell apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Thyroid Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, MicroRNAs, Transfection, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

何新制，卢冠铭，浦涧，韦忠恒，马燕飞，陈永诚，覃强，黄前方，罗志斋. 甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡、侵袭与miR-93的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3987-3992.

He Xin-zhi, Lu Guan-ming, Pu Jian, Wei Zhong-heng, Ma Yan-fei, Chen Yong-cheng, Qin Qiang, Huang Qian-fang, Luo Zhi-zhai. miR-93 effects on the proliferation, apoptosis and invasion of tumor stem cells in thyroid papillary carcinoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3987-3992.

图/表（结果） 1

2.1 CD44⁺CD24^-细胞与非CD44⁺CD24^-细胞中miR-93的表达 实验成功从人甲状腺癌细胞TPC-1中分离出CD44⁺CD24^-细胞与非CD44⁺CD24^-细胞，CD44⁺CD24^-细胞中的miR-93表达明显低于非CD44⁺CD24^-细胞(P < 0.05)，见图1。

2.2 miR-93模拟物的转染效率 qRT-PCR检测结果显示，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞中的miR-93表达高于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图2。

2.3 CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖

CCK-8检测结果：培养2-4 d时，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖速度明显慢于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图3A。

细胞增殖蛋白Ki67表达：转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的细胞增殖蛋白Ki67表达明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图3B。

2.4 CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡率

流式细胞仪检测结果：转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡明显多于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图4A。

凋亡蛋白表达：转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的促凋亡蛋白Bax表达高于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图4B。

2.5 CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力

细胞侵袭能力：Transwell小室实验结果显示，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图5A。

侵袭标志蛋白表达：转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，见图5B。

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引言

乳头状癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占甲状腺癌的85%，好发于中年女性，常伴有淋巴结转移，近年发病呈逐渐增高趋势，目前其发病机制尚不完全明确。当前的观点认为，干细胞自我更新失调可导致肿瘤的发生^[1-3]。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新、分化潜能及耐药性的一类特殊干细胞，其可由正常干细胞遗传与表型突变而来，也可来源于成熟细胞无分化形成的幼稚细胞，在肿瘤发生与进展中发挥着重要作用^[4-7]。大多数肿瘤干细胞高表达CD44，低表达CD24^[8]。有研究发现CD44⁺CD24^-细胞存在于甲状腺乳头状癌组织中，并且CD44⁺CD24^-细胞高表达肿瘤干细胞标记物OCT4与转录因子POU5F1^[9]，因此实验采用流式细胞仪从甲状腺乳头状癌组织中分选高纯度的CD44⁺CD24^-细胞，作为甲状腺肿瘤干细胞。

microRNA(简称miR)是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码小RNA，长18-25 nt，进化具有高度保守性，可调控细胞的周期及凋亡，在人类疾病与肿瘤发生及进展中扮演着重要角色。miR-93属于miR-106b-25家族，位于染色体7q22.1，研究证实其在衰老、高血糖症、成骨细胞钙化中发挥了重要作用，同时还参与了肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤的发生及进展^[10-11]。杨帆等^[12]利用人工合成miR-93 mimic瞬时转染脑胶质瘤A172细胞，分别采用MTT比色法、流式细胞术检测A172细胞增殖及细胞周期与凋亡，发现过表达miR-93有效促进了A172细胞的增殖，降低了细胞凋亡。陈鑫等^[13]在神经母细胞瘤SH-SY5Y和SH-N-SH细胞中转染miR-93 mimic，转染24 h后利用实时定量PCR技术检测细胞中miR-93的表达水平，同时利用Transwell侵袭实验与体外划痕实验检测过表达miR-93对细胞侵袭与迁移能力的影响，结果发现与原发性神经母细胞瘤相比，miR-93在转移瘤中表达显著降低，过表达miR-93后SH-SY5Y和SH-N-SH细胞的侵袭和迁移能力显著降低，说明miR-93能够抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭和迁移能力。

查阅文献发现，目前鲜见miR-93在甲状腺癌中的研究，因此实验主要探讨miR-93对甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年3至10月在靖西市人民医院实验室完成。

1.3 材料 人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1购自上海慧颖生物科技有限公司。

实验主要试剂：重组人表皮生长因子、B27添加剂、基础培养基DMEM、干细胞培养基DMEM/F12(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；胎牛血清(上海酶联生物)；PE标记的鼠抗人CD24单抗、FTTC标记的鼠抗人CD44单抗及其同型对照(美国BD公司)；总蛋白提取试剂盒、碱性成纤维细胞生长因子(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(艾美捷科技有限公司)；Ki67、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9与GAPDH兔抗人单克隆抗体(武汉博士德)；FACS缓冲液(北京美科美佳生物科技开发有限公司)；TRITC标记的羊抗兔二抗(美国KPL公司)；Taqman MicroRNA反转录试剂盒与All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒(上海慧颖生物科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、U6、Lipofectamine 2000转染试剂盒(北京义翘神州科技有限公司)；miR-93模拟物与miRNA模拟物对照(苏州吉玛基因股份有限公司)。

实验主要仪器：紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；倒置显微镜(北京瑞科中仪科技有限公司)；流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 甲状腺癌细胞的培养 将冻存的人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1置于37 ℃水浴中复苏后，加入含体积分数10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂、饱和湿度环境下培养。

待细胞培养至密度达80%以上时即可传代，加入1 mL胰酶，轻轻晃动，使胰酶浸没到皿底所有部位，放入培养箱中消化，显微镜下观察大部分细胞不再贴壁，加入培养基混匀，将细胞悬液均匀分成几份，分别加入不同培养皿中，补加新培养基后放回培养箱培养。

1.4.2 CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的分选 取对数生长期的人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1，消化后制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清后重悬于 FACS缓冲液中。实验组加入CD24-PE 10 μL与CD44-FITC 10 μL，对照1组加入CD24-PE 10 μL，对照2组加入CD44-FITC 10 μL，阴性对照组加入10 μL同型对照抗体，于4 ℃避光孵育，每10 min混悬细胞1次，30 min后采用流式细胞仪检测，分选出CD44⁺CD24^-细胞与非CD44⁺CD24^-细胞。将两种细胞培养于含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂、饱和湿度环境下培养。

1.4.3 实时反转录PCR检测miR-93的表达 提取CD44⁺CD24^-细胞与非CD44⁺CD24^-细胞的总RNA，以紫外分光光度计检测RNA浓度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录操作，合成cDNA，将所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系，将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应，设置U6为内参，反应条件为：93 ℃ 2 min预变性；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环；72 ℃ 7 min延伸。采用2^-??Ct方法分析miR-93在两种细胞中的相对表达水平。miR-93的正向引物：5'-AGT CTC TGG CTG ACT ACA TCA CAG-3'，反向引物：5'-CTA CTC ACA AAA CAG GAG TGG AAT C-3'；U6 snRNA的正向引物：5'-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3'，反向引物：5'-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3'。

1.4.4 CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的转染 将CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞以2×10³/孔的密度接种于6孔板中。观察细胞达到70%融合时，严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书操作，每孔添加150 μL转染剂miR-93模拟物或miRNA模拟物对照，转染24 h后更换为含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基，48 h收集细胞。采用qRT-PCR检测miR-93模拟物转染效率。

1.4.5 CCK-8法检测CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖 取转染48 h的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，以2×10³/孔的密度接种到96孔板中，加入含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基，每组5个复孔，置入37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养4 d，每天检测细胞活性，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养2 h，然后在450 nm波长处检测吸光度(A)值。

1.4.6 流式细胞仪检测CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡 取转染48 h的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，收集到10 mL离心管中，每样本细胞浓度为1×10⁹ L^-1，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min；用100 μL的FITC-Annexin V+PI标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10-15 min；1 000 r/min离心5 min，孵育缓冲液洗1次；加入荧光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下避光孵育20 min，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.4.7 Transwell小室检测CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力 在接种细胞前，用50 mg/L Matrigel 1︰8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干，吸出培养板中残余液体，每孔加入50 μL含10 g/L BSA的无血清培养液，37 ℃ 30 min。取转染48 h的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，去血清培养12 h，使细胞处于饥饿状态。取出转染细胞，弃去培养液，无菌PBS清洗，消化后制成单细胞悬液，加入无血清DMEM/F12培养基，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1。在Transwell小室上室加入200 μL细胞悬液，在Transwell小室下室加入600 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基，每组细胞3个复孔。将Transwell小室置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。取出Transwell小室上室，洗出残余液体，PBS清洗3次后自然风干，轻轻去除基质胶和上室内未侵袭的细胞，以0.1%结晶紫染色，PBS清洗3次，自然风干。倒置显微镜下观察，随机选取6个视野计数细胞，取均值。

1.4.8 Western Blot检测CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞相关蛋白表达 取转染48 h的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗Ki67、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9与GAPDH兔抗人单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，加入TRITC标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，显色曝光，以GAPDH作为内参。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 ①miR-93在CD44⁺CD24^-细胞与非CD44⁺CD24^-细胞中的表达；②miR-93模拟物转染CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的效率；③转染miR-93模拟物后，CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖、凋亡及侵袭能力。

1.6 统计学分析 计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件进行组间t 检验统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

多数研究已证实人类疾病的发生与基因密切相关^[14-16]，所以基因治疗恶性肿瘤是近年来研究的热点。microRNA是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码小RNA，参与调控机体各种各样的生理活动，例如生长发育^[17-18]、造血功能^[19-20]、细胞增殖与凋亡^[21-22]、器官形成^[23]、脂肪代谢等^[24]，目前人类有10%-30%的基因接受microRNA的调节，microRNA可发挥原癌基因的作用，也可以发挥抑癌基因的作用，但关于microRNA调节基因表达水平的机制尚不清楚。许多学者也进行了甲状腺乳头状癌的microRNA基因谱研究，发现伴有腺外转移的甲状腺乳头状癌中，miR-221、miR-222、miR-146b-5p等14种microRNA的表达显著高于不伴腺外转移的甲状腺乳头状癌，而miR-16、miR-613等10种microRNA的表达显著下调^[25-27]。miR-93属于miR-106b-25家族，位于染色体7q22.1，研究证实其在衰老、高血糖症、成骨细胞钙化中发挥了重要作用，同时还参与了肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤的发生及进展。但是目前关于miR-93与甲状腺乳头状癌的研究较少。前期研究发现，miR-93在甲状腺腺瘤患者呈低表达，在应激胰岛素抵抗患者也呈低表达，miR-93表达水平与总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、空腹胰岛素水平呈负相关，miR-93作为保护因子而非致病因子参与甲状腺腺瘤及其应激胰岛素抵抗的发生和发展^[28]。miR-93在甲状腺乳头状癌的表达如何？对甲状腺乳头状癌是保护因子还是致病因子？为了验证这些疑问，实验研究了miR-93对甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。

研究证实microRNA能够调控肿瘤干细胞的增殖、自我更新及转移等，因此实验从人甲状腺癌细胞TPC-1中分离出CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞，通过实时转录PCR检测发现miR-93在CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞中呈低表达，那么给予外源性miR-93补充对CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞会有何影响？为了更进一步明确miR-93对CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的作用，实验通过脂质体将外源性miR-93模拟物转染至CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞中，观察肿瘤干细胞的增殖、凋亡及侵袭能力变化。CCK-8法检测细胞增殖发现，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞培养2-4 d的增殖速度明显慢于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)；Western Blot 检测发现，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的细胞增殖蛋白Ki67表达明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，这些结果说明miR-93可抑制CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的增殖。流式细胞仪检测结果发现，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡明显多于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)；Western Blot 检测发现，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的促凋亡蛋白Bax表达高于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，这些结果说明miR-93可促进CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的凋亡。Transwell小室实验结果显示，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)；Western Blot 检测发现，转染miR-93模拟物的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于转染miRNA模拟物对照的CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞(P < 0.05)，证实miR-93可抑制CD44⁺CD24^-肿瘤干细胞的侵袭能力。

综上所述，miR-93在甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞中低表达，上调其表达后能够抑制甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞的增殖与侵袭能力，促进其凋亡。但是miR-93是通过何种途径来抑制甲状腺癌肿瘤干细胞增殖与侵袭能力的？其靶基因及靶点又是什么？这些还有待更深入更进一步的研究，研究将会从不同的层面揭示甲状腺乳头状癌的发病机制，开发靶向抗肿瘤的治疗前景，为临床甲状腺乳头状癌的诊治开辟新的途径，延缓甲状腺乳头状癌的复发与转移，提高疗效。

甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡、侵袭与miR-93的影响

miR-93 effects on the proliferation, apoptosis and invasion of tumor stem cells in thyroid papillary carcinoma

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