慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0954

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3950-3955.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0954

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慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

周桢杰，李强，李诗鹏，陶旋，马跃刚

桂林医学院附属医院，广西壮族自治区桂林市 541001

修回日期:2018-06-26 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 李强，主任医师，教授，硕士生导师，桂林医学院附属医院，广西壮族自治区桂林市 541001
作者简介:周桢杰，男，1991年生，浙江省桐庐县人，汉族，桂林医学院在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31160199)；广西壮族自治区自然科学基金项目(2014GXNSFAA118263)；桂林医学院科研项目(LX2014254)

Double transfection with lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhou Zhen-jie, Li Qiang, Li Shi-peng, Tao Xuan, Ma Yue-gang

Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2018-06-26 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Li Qiang, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhou Zhen-jie, Master candidate, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31160199; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2014GXNSFAA118263; the Scientific Research Project of Guilin Medical University, No. LX2014254

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
慢病毒载体：是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有较强的感染能力。另一方面，慢病毒载体可将目的基因整合入宿主细胞基因组中，大部分情况下不会因宿主细胞的分裂、分化而失表达，可实现长期而稳定的表达。
血管内皮生长因子：是一类具有肝素结合性的二聚体糖蛋白，具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管生成、增加毛细血管渗透性等作用，也能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。骨组织作为一个高度血管化的组织，血管内皮生长因子在骨折愈合过程中发挥了必不可少的作用。

摘要
背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子，利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。
目的：探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。
方法：将骨髓间充质干细胞分为4组：①未转染组；②空载组：通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞；③BMP-2组：转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP)；④BMP-2/VEGF-165组：通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP，Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达，MTT法检测各组细胞增殖活性，转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：①空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达；②转染后3 d，BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达；转染后7，14，21 d，目的蛋白检测无明显变化(P > 0.05)；③BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P < 0.05)，BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P < 0.05)；④BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组；⑤结果表明，慢病毒介导的hBMP-2和hVEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内，并长期稳定表达，该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3182-1517(周桢杰)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白2, 血管内皮生长因子165, 慢病毒, 基因转染, 细胞增殖, 碱性磷酸酶, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and vascular endothelial growth factor 165 (VEGF-165) are essential cytokines for bone repair. Lentiviral transfection of stem cells is important for studying the biological changes of doubly transfected cells.
OBJECTIVE: To study the feasibility of human BMP-2 and human VEGF-165 dual gene transfection of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and to explore the osteogenic capacity of doubly transfected cells.
METHODS: Rabbit BMSCs were divided into four groups: untransfected group, blank vector group transfected with control lentivirus, BMP-2 group transfected with Lv-BMP-2/GFP, and BMP-2/VEGF-165 group transfected with Lv-BMP-2/GFP and Lv-VEGH-165/RFP. Expression of targeted proteins was detected using western blot at different time after transfection. MTT assay was used to detect cell proliferation in each group. Alkaline phosphatase activity was measured at 14 days after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The corresponding green and red fluorescent protein expressions were observed under fluorescence microscope in the blank vector, BMP-2, and BMP-2/VEGF-165 groups. (2) The corresponding target proteins were highly expressed in the BMP-2 and BMP-2/VEGF-165 groups at 3 days after transfection, but no significant changes were detected at 7, 14, and 21 days after transfection (P > 0.05). (3) Compared with the BMP-2 group, the proliferation of cells was slightly faster in the BMP-2/VEGF-165 group (P < 0.05), but significantly lower in the untransfected group and blank vector group (P < 0.05). (4) The activity of alkaline phosphatase in the BMP-2, and BMP-2/VEGF-165 groups was significantly higher than that in the untransfected and blank vector groups (P < 0.05). These findings reveal that BMSCs were successfully transfected by hBMP-2 and hVEGF-165, and the dual gene transfection could promote the production of alkaline phosphatase, thereby accelerating the osteogenic differentiation of BMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Bone Morphogenetic Proteins, Vascular Endothelial Growth Factors, Lentivirus Infections, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周桢杰，李强，李诗鹏，陶旋，马跃刚. 慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3950-3955.

Zhou Zhen-jie, Li Qiang, Li Shi-peng, Tao Xuan, Ma Yue-gang. Double transfection with lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3950-3955.

图/表（结果） 2

2.1 原代细胞的分离纯化与鉴定结果 原代细胞分离后于培养箱内静置48 h，再给予首次换液，镜下可见散在簇状分布的BMSCs，呈短梭形、三角形。随培养时间延长及数次换液后，杂质细胞可被洗去。原代BMSCs培养7 d左右，细胞可达80%-90%融合，为防止细胞老化给予传代培养。传代后细胞分布均匀，排列呈漩涡状、鱼群状，细胞呈短梭形、三角形，椭圆形胞核明显，有的可见双核(图1)。流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代BMSCs表面标志物CD44、CD29阳性表达，其阳性率达90%以上，CD45阴性表达，结果符合BMSCs特征。

2.2 原代细胞的双基因转染 用携带hBMP-2基因的慢病毒载体以MOI=50转染第3代BMSCs时，转染后未见细胞死亡，转染后第3天将携带hVEGF-165基因的慢病毒载体以MOI=50再次转染，依然未见细胞死亡。首次转染第7天，即第2次转染后第4天，BMP-2/VEGF-165组和空载组细胞在荧光显微镜下均见到绿色和红色荧光表达，荧光下细胞形态未见明显改变，肉眼计数绿色和红色荧光表达量均可达85%，综合转染率可达95%以上(图2)，说明病毒携带的BMP-2和VEGF-165基因成功转入细胞中。

2.3 转染前后细胞双基因目的蛋白表达 BMP-2/VEGF- 165组及BMP-2组检测到M_r30 000左右大小的BMP-2阳性条带，而空载组和未转染组在该区域上仅见较弱条带；BMP-2/VEGF-165组在M_r17 000左右大小区域检测到VEGF-165阳性条带，其余3组在该区域均未见阳性条带，见图3。各时间点灰度值分析见表1。

在第7，14，21天时，BMP-2组及BMP-2/VEGF-165组的BMP-2表达差异无显著性意义(P > 0.05)，但均高于第3天，差异有显著性意义(P < 0.05)；在第7，14，21天时，BMP-2/VEGF-165组的VEGF165表达差异无显著性意义(P > 0.05)，但均高于第3天，差异有显著性意义(P < 0.05)。上述结果说明慢病毒介导的BMP-2和VEGF-165基因成功转入细胞内并长期稳定表达目的蛋白，目的蛋白未随细胞增殖传代而表达降低。

2.4 转染前后细胞形态变化 转染成功后第7天，可见BMP-2组和BMP-2/VEGF-165组细胞质内有少量颗粒，细胞形态均未见明显改变，呈梭状，胞核明显。转染成功后第14天，BMP-2组和BMP-2/VEGF-165组细胞质内颗粒明显增多，并且后者较前者稍多，两组细胞变宽、变大，伸出伪足，有极性。未转染组和空载组可见极少数细胞胞质内出现质密颗粒，细胞形态保持梭状。

2.5 转染前后细胞增殖能力变化 BMP-2/VEGF-165组BMSCs增殖稍快于BMP-2组(P < 0.05)，后者又明显快于空载组和未转染组(P < 0.05)。未转染组和空载组细胞增殖曲线的走行方向基本一致，差异无显著性意义(P > 0.05)。该结果再次提示该双基因转染方法未对细胞造成损伤，可以排除慢病毒转染带来的干扰，见图4。
2.6 转染前后细胞碱性磷酸酶定性及定量检测结果 转染后第14天，BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶染色可见大部分细胞胞浆被密集的细沙样黑色颗粒所深染，细胞核周围染色最深，显现出明显的未被染色细胞核部分，细胞整体深染率可达90%，这与细胞形态学观察时看到的胞核周围质密颗粒相符，表明这些质密颗粒含大量碱性磷酸酶。BMP-2组细胞染色形态与双基因转染组相似，但整体深染率为80%。未转染组和空载组仅约5%细胞被深染，见图5。转染后第14天各组碱性磷酸酶活力，见图6，4组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活性较BMP-2组升高约1/5，但未转染组和空载组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年4月至2018年3月在桂林医学院科学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 清洁级健康3月龄新西兰大白兔1只，雌雄不拘，体质量7 000 g，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：scxk(桂)2013-0001。实验中所有处置完全按照动物伦理学标准执行。

1.3.2 实验试剂与仪器 慢病毒载体的构建和鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成；DMEM细胞培养基、胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶(四季青)；BMP-2单克隆抗体(北京中杉金桥)；VEGF-165单克隆抗体(Abcam)；流式一抗小鼠抗兔CD44/CD45、CD29(Antigenix)；同型对照小鼠抗兔IgG1k(eBioscien)；碱性磷酸酶染色液(北京雷根生物)；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物)；流式二抗PerCP标记(Jackson Immuno Research)；CO₂培养箱、-80 ℃超低温冰箱、液氮罐(Thermo)；流式细胞仪(BD)；生物安全柜(苏州苏洁)；倒置相差显微镜(Nikon)；化学发光仪(BIO-RAD)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔BMSCs的分离纯化及表型鉴定 取3月龄新西兰大白兔1只，经耳缘静脉注入麻醉药后固定于操作木板上，消毒皮肤后用无菌骨穿针穿刺双侧股骨干骺端，注射器抽取10 mL骨髓注入15 mL无菌离心管离心(1 500 r/min，5 min)，倒去上清液，加入适量L-DMEM培养基重悬细胞，再加入等体积的Percoll淋巴细胞分离液离心(2 500 r/min，20 min)；在离心管中吸取中间絮物状细胞悬液层至一新的无菌离心管中，加入L-DMEM培养基洗涤1次，再次离心后倒去上清液，加入适量含体积分数为15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的L-DMEM完全培养基重悬，细胞悬液接种于25 cm²塑料培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱培养；静置48 h后予首次换液，当细胞汇合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化，予1∶2传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长情况，细胞传至第3代进行实验，并随机选取第3代细胞制成细胞悬液，等量分装于4支离心管中，分别加入CD44、CD45、CD29的抗体，设置IgG(H+L)为阴性对照，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。

1.4.2 细胞转染及实验分组 取第3代兔BMSCs进行实验，以感染复数(MOI)为50的Lv-BMP-2/GFP转染细胞，转染后第2天，可见细胞已倍增，取其一半细胞再以感染复数(MOI)为50的Lv-VEGF-165/RFP转染，另一半继续正常培养。作者前期研究发现慢病毒转染兔BMSCs第3-7天为转染率最佳观察时间^[6]。在首次转染后第7天，第2次转染后第4天，荧光显微镜下观察转染率。实验分为4组：①未转染组；②空载组：通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞(Lv-GFP，Lv-RFP)；③转染Lv-BMP-2/GFP组(BMP-2组)：转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP)； ④Lv-BMP-2/GFP-VEGF-165/RFP组(BMP-2/VEGF-165组)：通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/ GFP，Lv-VEGH-165/RFP)。

1.4.3 转染前后Western blot检测目的蛋白表达 转染后第3，7，14，21天，各组分别取2×10⁶细胞，提取蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度，以每孔30 μg蛋白计算每孔上样体积；以12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%SDS-PAGE)分离，转膜，孵育一抗(BMP-2、VEGF-165单克隆抗体)、二抗(辣根酶标记抗体)行抗体杂交；ECL发光、显影、定影。

1.4.4 MTT比色法检测转染前后兔BMSCs的增殖情况 按实验分组，每组以2×10³/孔接种96孔板，每组设置7个复孔，共接种7板，每隔24 h随机取1块96孔板，每孔加入20 μL MTT工作液(5 g/L)，37 ℃避光孵育4 h后移去上清液，每孔加150 μL二甲基亚砜，37 ℃摇床低速摇晃10 min，酶标仪设置波长为490 nm测定吸光度值(A值)，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4.5 转染前后碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶水平检测 细胞转染后第14天，根据碱性磷酸酶染色试剂盒(改良Gomori钙钴法)(北京雷根生物)和检测试剂盒(南京建成生物)说明书步骤操作。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态；②各组细胞中hBMP-2和hVEGF-165的表达；③各组细胞的增殖活性；④各组细胞的碱性磷酸酶活性。

1.6 统计学分析 使用SPSS 20.0软件对各组数据比较进行成组设计的F 检验，所有参数均用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

BMSCs具有多向分化潜能，可在不同诱导条件下向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等细胞分化^[7]，由于其提取方便、增殖活跃、低免疫原性以及能向成骨细胞分化，无疑成为理想的组织工程种子细胞^[8-9]。目前提取原代BMSCs的方法大致为4种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式分选法和免疫磁珠法^[10]，后2种方法由于对细胞损伤大、获取效率低，一般不选用。实验用全骨髓贴壁法获取细胞，对细胞损伤小，少量的血细胞等杂质细胞通过几次换液便可几乎全部洗去，可快速获取大量较纯的原代BMSCs，在干细胞老化或者纤维化前留给实验者充足的时间完成实验。

基因经反转录病毒介导转染细胞时，首先病毒和细胞膜表面的特异性受体相结合，介导病毒感染前复合体进入细胞质，再穿过细胞核核膜把目的基因整合至染色质上，通常整合位点为靠近核膜的常染色质^[11]。由于细胞膜表面的特异性受体数量是有限的，越高的转染复数并不能持续提高转染率，却会因基因毒性而引起宿主细胞的死亡。因此，利用反转录病毒介导基因转染时，需要了解某种病毒对应某种细胞在何种感染复数下引起细胞大量死亡、在何种感染复数范围内感染率升高缓慢或几乎相等、在何种感染复数范围内感染率大幅升高，根据这些信息可拟定单次转染或者二次转染的最佳感染复数。慢病毒作为反转录病毒的一种，能感染分裂和非分裂细胞，并能把目的基因整合到宿主染色质中，达到稳转效果^[12]。Jiang等^[13]用不同感染复数的慢病毒转染鼠间充质干细胞，发现MOI=40时转染率为90%。在前期预实验中了解到慢病毒载体对应BMSCs在感染复数为40-100范围内转染率高而且相差不大，同时细胞状态良好；感染复数<40时，转染率大幅增加；感染复数>100时转染率几乎不变，细胞逐渐变得增殖缓慢及死亡。实验用MOI为50的慢病毒转染hBMP-2基因，转染率可达85%。转染后第3天细胞已倍增，取其一半再用MOI为50转染hVEGF-165基因，二次转染后细胞状态良好，经Western Blot检测两种目的蛋白均有较强表达。实验结果证实了该双基因转染方法的可行性，转染的目的基因可长期稳定表达。另一方面，慢病毒介导经2次转染的双基因转染方法保证了单基因转染组细胞与双基因转染组的同源性，避免了不同实验组间客观操作引起的实验误差。

BMP-2是转化生长因子β超家族的一员，是目前公认的诱导成骨能力最强的因子。BMP-2作为成骨过程中的关键因子，具有募集细胞、促进细胞增殖和成骨分化等功能^[13-15]。课题组前期已分别从体外和体内实验验证了BMP-2强大的成骨作用^[16-17]，该实验BMP-2组和空载组的实验结果比较也证实了这一点。VEGF是目前认为成血管性能最强的因子，它在成骨过程中也是一个不可缺少的因子^[18-19]。VEGF常见有VEGF-121，145，206，189，165这5种异构体，其中VEGF-165以其含量最多、生物作用性最强而被广泛研究^[20]。VEGF-165可以增加血管的通透性，更利于骨形成区域各类养分、因子及修复细胞的渗透并发挥作用；VEGF-165可直接作用于血管内皮细胞，促进其分裂同时抑制其凋亡；它又能促进新的血管形成，使无血管区域的组织工程骨产生新的血管；它也能在一定程度上促进BMSCs向成骨细胞分化。这些作用无疑对前期的骨形成及后期的塑形带来极大的帮助，在联合有强大成骨作用的BMP-2治疗骨缺损时，能更快更优质的成骨，同时降低人为给予因子的剂量和浓度，避免异位骨化和肿瘤形成。许多学者在体内及体外都证实BMP-2和VEGF联合诱导成骨在相同时间点下成骨性能优于单独应用BMP-2或VEGF^[21-24]。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的重要标志物之一，成熟的成骨细胞可产生大量的骨特异性碱性磷酸酶，它可催化无机磷酸盐的水解，有利于骨的矿化，因此碱性磷酸酶活性的高低在一定程度上反映了成骨细胞的分化成熟程度。实验通过细胞形态学观察、细胞增殖检测、碱性磷酸酶检测和染色证实了BMP-2和VEGF-165双基因转染兔BMSCs在体外的成骨性能优于BMP-2单基因转染。双基因转染组的成骨能力相对于单基因转染组有差异性，但并不是特别大，作者认为可能与转染后双因子产生的比例或者浓度有关。

综上所述，兔BMSCs经慢病毒介导转染BMP-2和VEGF-165基因时，细胞可长期稳定表达目的蛋白，并且双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化，但是，BMP-2和VEG-F165的不同比例或者浓度也许调控着细胞的成骨能力，因此，BMP-2和VEGF-165因子在体外的最佳比例和浓度，仍需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

Double transfection with lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

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