慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0953

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3944-3949.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0953

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慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长

何杨¹，林晨¹，高琴²，宋京翔³，涂小煌¹

¹解放军福州总医院普外科，福建省福州市 350025；²解放军福州总医院普外科研究所，福建省福州市 350025；³厦门大学附属东方医院普外科，福建省福州市 350025

修回日期:2018-06-25 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 涂小煌，博士，主任医师，教授，解放军福州总医院普外科，福建省福州市 350025
作者简介:何杨，男，1987年生，山东省枣庄市人，汉族，2014年福建医科大学毕业，硕士，主要从事胃肠道肿瘤诊疗及临床营养支持研究。并列第一作者：林晨，男，1979年生，福建省莆田市人，汉族，2011年解放军第二军医大学毕业，博士，副主任医师，主要从事胃肠道肿瘤、血管疾病研究。
基金资助:
福建省自然科学基金项目(2012J01406)；福建省自然科学基金面上项目(2017J01327)

Lentivirus-mediated human interleukin-12 fusion gene-transfected rat bone marrow mesenchymal stem cells inhibit CT26 tumor growth

He Yang¹, Lin Chen¹, Gao Qin², Song Jing-xiang³, Tu Xiao-huang¹

¹Department of General Surgery, ²Institute of General Surgery, Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China; ³Department of General Surgery, Dongfang Hospital of Xiamen University, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Revised:2018-06-25 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Tu Xiao-huang, M.D., Chief physician, Professor, Department of General Surgery, Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
About author:He Yang, Master, Department of General Surgery, Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China. Lin Chen, M.D., Associate chief physician, Department of General Surgery, Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2012J01406, 2017J01327

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞对结肠癌CT26细胞的作用：骨髓间充质干细胞是骨髓衍生的非造血基质细胞，它具有增殖能力及多向分化潜能，此外还有较好的肿瘤趋向性，也正是因为这点，其被广泛应用在肿瘤生物治疗中。既往有研究表明，骨髓间充质干细胞有一定的促进肿瘤生长或抑制肿瘤生长的作用，而该研究中未见明显促进或抑制结肠癌CT26细胞的增殖。
白细胞介素12：它由p35和p40两个亚基间通过二硫键结合形成，是一种免疫应答中的关键调节因子，可激活树突状细胞、自然杀伤细胞、T细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞等细胞，并在抑制肿瘤血管生长等方面起到重要作用，其在乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤细胞的研究中发现可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭，该研究中也发现白细胞介素12可抑制结肠癌CT26细胞的增殖及侵袭。

摘要
背景：白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点，但其在结直肠癌方面的研究相对较少。
目的：构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(hIL-12-BMSCs)，观察其对大鼠结肠癌模型的影响。
方法：设计并合成引物，PCR扩增并回收纯化后的p40和p35基因片段，行Overlap-ping PCR连接获得hIL-12的单链双亚基表达融合基因，与慢病毒包装系统共转染293T细胞，构建慢病毒过表达重组体，再转染大鼠骨髓间充质干细胞，药物筛选培育出稳转株。32只裸鼠皮下注射CT26细胞悬液造模成功后，随机分为4组：瘤周分别注射0.2 mL hIL-12-BMSCs(hIL-12-BMSCs组)、0.2 mL PBS溶液(PBS组)、0.2 mL骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞组)、0.2 mL表达IL-12的慢病毒液(LV-IL-12组)，统计并分析各组瘤体生长情况。
结果与结论：①观察期内PBS组与骨髓间充质干细胞组肿瘤体积差异无显著性意义(P > 0.05)，表明骨髓间充质干细胞本身对CT26瘤体生长无明显促进或抑制作用；②注射7 d后hIL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P < 0.01)，表明白细胞介素12对CT26瘤体生长有明显抑制作用；③注射10 d后hIL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P < 0.05)，表明hIL-12-BMSCs抑制CT26生长优于LV-IL-12；④结果表明，hIL-12-BMSCs对裸鼠CT26移植瘤体生长有明显的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8822-1980(何杨)

关键词: 结直肠癌, 人白细胞介素12, 鼠骨髓间充质干细胞, 慢病毒载体, 干细胞, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Interleukin-12 as the most potent anti-tumor factor has been a hot topic in research, but little is reported on its use in the treatment of colorectal cancer.
OBJECTIVE: To construct rat bone marrow mesenchymal stem cell lines stably expressing human interleukin-12 (hIL-12-BMSCs), and to observe its effect on colorectal cancer (CT26).
METHODS: Primers were designed and synthesized, and purified p40 and p35 gene fragments were amplified by PCR. The single-chain double-subunit fusion gene, hIL-12, was obtained by Overlap-ping PCR ligation, and 293T cells were co-transfected with lentiviral packaging system. Recombinant lenovirus overexpressing hIL-12 (LV-IL-12) was constructed to transfect rat BMSCs. The stable strain was then cultured via drug screening. Thirty-two nude mice were subcutaneously injected with CT26 cells to make animal models, and then randomly divided into four groups to receive peritumoral injection of hIL-12-BMSCs (0.2 mL; hIL-12-BMSCs group), 0.2 mL of PBS (PBS group), 0.2 mL of BMSCs (BMSCs group), or 0.2 mL of LV-IL-12 (LV-IL-12 group). Tumor growth was then statistically analyzed in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no significant difference in tumor volume between the PBS and BMSCs groups (P > 0.05), indicating that BMSCs cannot promote or inhibit the growth of CT26 tumors. However, from the 7th day after injection, the tumor volume showed a significant difference between hIL-12-BMSCs and PBS groups as well as between PBS and LV-IL-12 groups (P < 0.01), indicating that Hil-12 has a significant inhibitory effect on CT26 tumor growth. From the 10th day after injection, a significant difference in the tumor volume was found between the hIL-12-BMSCs and LV-IL-12 groups (P < 0.05), indicating that hIL-12-BMSCs are more effective than LV-IL-12 in inhibiting the growth of CT26. To conclude, hIL-12-BMSCs considerably inhibit the growth of CT26 tumor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Colorectal Neoplasms, Interleukin-12, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lentivirus Infections, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

何杨，林晨，高琴，宋京翔，涂小煌. 慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3944-3949.

He Yang, Lin Chen, Gao Qin, Song Jing-xiang, Tu Xiao-huang. Lentivirus-mediated human interleukin-12 fusion gene-transfected rat bone marrow mesenchymal stem cells inhibit CT26 tumor growth[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3944-3949.

图/表（结果） 2

2.1 BMSCs形态及鉴定结果 培养24 h后细胞呈圆形，少量贴壁；72 h后大部分贴壁，呈梭形；第3代细胞形态已较均一，绘制细胞生长曲线(图1)。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD90阳性表达率为91.10%，93.50%，而CD34、CD45阴性表达率为99.18%，97.78%，表明BMSCs培养成功(图2)。

2.2 PCR扩增产物电泳图及测序结果 产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(图3，4)，IL-12p35(648 bp)、IL-12p40 (1 008 bp)、IL-12(1 620 bp)的测序结果及片段大小与预期一致，表明构建IL-12融合基因成功，待用。

2.3 构建慢病毒/IL-12过表达体 慢病毒转染293T细胞72 h后，实验组、对照组均见大量绿色荧光(图5)，且荧光表达稳定，表明过表达体构建成功。

2.4 过表达体转染BMSCs 过表达体转染BMSCs 24 h后，即见荧光，且强度随时间增强，72 h后绝大多数细胞呈现绿色(图6)。流式细胞仪测定在MOI=10，30，50的转染率，实验组分别为35.4%，83.1%，97.3%，对照组分别为31.8%，79.9%，91.2%。MOI=50时，荧光最强且细胞形态无明显变化，表明慢病毒可将hIL-12基因转染至BMSCs，且转染率超过85%，满足实验需求。

2.5 hIL-12-BMSCs形态及鉴定结果 过表达体转染BMSCs 24 h后，即见荧光，强度随时间增强且形态未见明显改变(图7)。ELISA法检测实验组12，24，48，72，96 h上清液中hIL-12蛋白量分别为(5.08±0.99)，(57.68±3.73)，(102.16±6.26)，(146.64±7.46)，(189.47±3.80) ng/10⁶细胞，对照组未检测到hIL-12蛋白的表达，表明hIL-12-BMSCs构建成功(图8)。

2.6 各组裸鼠生存及肿瘤生长情况 所有裸鼠注射CT26细胞悬液7 d后均见长径≥5 mm瘤体，造模成功率100%，观察期内所有裸鼠均存活。各组各时间段瘤体体积数据及肿瘤生长曲线见表1和图9。4组瘤体体积在前4 d差异无显著性意义(P > 0.05)，观察期内PBS组与BMSCs组肿瘤体积差异均无显著性意义(P > 0.05)，表明BMSCs本身对CT26瘤体生长无明显促进或抑制作用；7 d后hIL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P < 0.01)，表明IL-12对CT26瘤体生长有明显抑制作用；10 d后hIL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P < 0.05)，表明hIL-12-BMSCs抑制CT26生长优于LV-IL-12。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外、体内实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年5月在福州总医院动物实验科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及细胞株 两三周龄雄性SD大鼠4只(体质量180-200 g)，两三周龄雄性裸鼠32只(体质量28-20 g)，为福州总医院比较检验科惠赠。293T细胞株、CT26细胞株(被N-亚硝基-N-甲基脲烷诱导得到的未分化的小鼠结肠癌细胞)、E.coli DH5α为福州总医院实验科惠赠。

1.3.2 工具酶及实验试剂 EcoRⅠ酶、XhoⅠ、NotⅠ酶、T₄DNA酶(NACALAI TESQUE公司)；L-DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清、PBS、0.25%胰酶、P/S(青链霉素双抗)、培养瓶、离心管、一次性吸管(Hyclone公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(Life Technologies公司)；含绿色荧光蛋白GFP及嘌呤霉素抗性基因PURO的慢病毒载体表达质粒pLV-GFP-PURO、包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG(广州辉骏生物科技有限公司)；pUNO1-hIL-12 (p35)、pUNO1-hIL-12(p40)质粒(InvivoGen公司)；Polybrene、Ficoll淋巴细胞分离液(斯丹塞公司)；嘌呤霉素、ELASA试剂盒(Sigma公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 鼠BMSCs的获取、培养、传代及鉴定 参照Todo等^[6]方法，选取4只两三周龄清洁级SD大鼠，采用颈椎脱臼法处死，体积分数为75%乙醇浸泡30 s，无菌条件下取出双下肢股骨、胫骨，用培养基(每100 mL培养基含89 mL L-DMEM+10 mL胎牛血清+1 mL P/S)冲洗骨髓腔，收集骨髓液，1 000 r/min离心10 min×2次，弃上清加适量培养基吹打均匀接种至培养瓶，置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，48 h后换液，以后每3 d换液1次，观察细胞形态并绘制细胞生长曲线。待细胞融合80%左右，胰酶消化，1∶3传代并标记。流式细胞仪检测鼠BMSCs表面标志物CD29、CD34、CD44、CD45的表达。

1.4.2 IL-12引物设计及合成 根据Genbank中hIL-12p35 (648 bp)、hIL-12p40(1 008 bp)的cDNA序列设计引物。p35上游引物5'-GTC CGA ATT CTG TCA ATC ACG CTA CCT CCT CT-3'，p35下游引物5'-CCG AAT TCT TAG GAG GAG CTC AGA TAG TTC AT-3' (下划线部分为EcoRⅠ酶切点)；p40上游引物5'-CAC TCG AGA TGT GTC ATC AGA AGT TAA CCT TCT CCT-3' (下划线部分为XhoⅠ酶切点)，p40下游引物5'-ATG CGG CCG CTT AGG ATC GGC CCC TGC AGG GTA CAC-3' (下划线部分为NotⅠ酶切点)。引物由广州辉骏公司合成。

1.4.3 IL-12融合基因的构建 以p40和p35质粒为模板，用引物PCR扩增p40和p35基因。扩增循环如下：48 ℃ 45 min，94 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，70 ℃ 2 min，循环40次；70 ℃延伸10 min。以纯化的p40和p35片段为模板，Overlapping PCR拼接获得IL-12融合基因，扩增循环如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，循环6次；94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，循环30次；68 ℃延伸5 min。产物均行1.5%琼脂糖凝胶电泳后送广州辉骏公司测序鉴定。

1.4.4 慢病毒/hIL-12过表达载体构建 EcoRⅠ酶、XhoⅠ、NotⅠ酶切纯化的hIL-12片段，借T₄DNA酶与pLV-GFP-PURO链接，产物转化感受态细胞E.coli DH5α，PCR检测转化子，获阳性克隆，抽取阳性菌落摇菌，抽提质粒，测序鉴定正确者命名pLV-GFP-PURO- hIL-12。

1.4.5 BMSCs转染、筛选及鉴定 第3代BMSCs接种于96孔板内，每孔约2×10⁵个BMSCs。实验组每孔加入1 mL病毒液及polybrene至终质量浓度5 mg/L，4 h后每孔补充1 mL培养液(期间每30 min摇晃1次)，12 h后换液，此后每24 h换液1次并收集12，24，48，72，96 h上清液，采用ELISA法测hIL-12蛋白的表达量。对照组不加病毒液，余同。感染第7天换含5 mg/L嘌呤霉素的培养液，此后每24 h换液1次，持续2至3周，筛选出稳定表达hIL-12的细胞，命名hIL-12-BMSCs稳转株。

1.4.6 造模及实验分组 参照邹宁等^[7]方法，建立CT26荷瘤鼠模型。分别于32只裸鼠左下肢皮下注射0.2 mL CT26悬液(约2×10⁶个细胞)，7 d后观察成瘤率，将造模成功裸鼠随机分4组，瘤周分别注射0.2 mL hIL-12-BMSCs(约2×10⁶个细胞)、0.2 mL PBS溶液、0.2 mL BMSCs(约2×10⁶个细胞)、0.2 mL LV-IL-12(约2×10⁹个病毒颗粒)，每4 d重复1次，共3次。

1.5 主要观察指标 每3 d观察小鼠生存状况及肿瘤大小，测肿瘤最长径a及最短径b，计算肿瘤体积(V=1/6πab²)、肿瘤相对增长率=(当前肿瘤体积-肿瘤初体积)/肿瘤初体积×100%，并绘制肿瘤生长曲线。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，组间采用LSD-t 检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肿瘤患者存在明显的细胞免疫功能低下，因此，如何提高肿瘤患者体内免疫细胞尤其是淋巴细胞的功能来杀伤肿瘤细胞，一直是国内外学者研究的热点。肿瘤生物治疗是继手术、化疗、放疗后的肿瘤第四大模式，其中以细胞因子的基因治疗发展最为迅速。

20世纪80年代，Gately等^[8]和Kobayashi等^[9]分别发现了一种细胞因子，它可有效刺激CTL细胞(细胞毒性T淋巴细胞)和NK细胞(自然杀伤细胞)的活性，故分别将其命名为CTMF(细胞毒性淋巴细胞成熟因子)和NKSF(NK细胞刺激因子)，这两种细胞因子后来证实其实是同一种细胞因子，现将其统称为IL-12。它主要由树突细胞、单核巨噬细胞及B淋巴细胞等抗原提呈细胞分泌，作为细胞因子和免疫调节因子有直接对抗肿瘤的作用^[10]，是目前公认的最具潜能的抑瘤细胞因子^[11]。IL-12不仅是免疫应答过程中的关键因子，还可直接调节T细胞及自然杀伤细胞的增殖、细胞毒性和细胞因子的生成。此外，IL-12还可增强多种免疫效应细胞的细胞活性，在机体免疫应答中，特别是机体抗肿瘤和抗病毒免疫中发挥不可替代的作用^[12]，其可通过以下途径发挥抗肿瘤作用：①T细胞介导的抗瘤效应。Sospedra等^[13]利用SFV病毒表达IL-12，发现其对结肠癌肝转移动物模型中的肿瘤细胞具有明显抗肿瘤效果。Collison等^[14]在将IL-12用于小鼠肝癌治疗的研究中发现，IL-12基因能有效上调血清中IL-12和γ-干扰素水平，从而有效抑制局部和远处肿瘤的生长。IL-12可诱导CD4⁺ Th0细胞向Th1细胞分化，并促进其发育、增殖，后者进一步分泌γ-干扰素、白细胞介素2等细胞因子，辅助CD8⁺CTL通过颗粒酶/穿孔素和Fas/FasL两条途径发挥抗瘤作用^[15]。IL-12可活化CD4⁺T细胞，后者可辅助固有免疫细胞如自然杀伤细胞、树突细胞等的活化。此外，IL-12还可增强TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)的肿瘤杀伤作用；②B细胞介导的抗瘤效应。Th1细胞可辅助B细胞产生IgM、IgG2a和IgA类抗体，通过ADCC、CDC、干扰瘤细胞黏附作用、与肿瘤表面抗原形成免疫复合物、调理等发挥抗瘤作用；③LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)、NK细胞介导的抗瘤效用。IL-12可诱导NK细胞分泌γ-干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α等，发挥强大的细胞毒作用^[16]，可增加LAK、NK细胞内颗粒酶、穿孔素的合成及释放，激活其CD28依赖及非依赖杀伤途径^[17-18]；④巨噬细胞介导的抗瘤效应。IL-12可激活巨噬细胞，增强巨噬细胞对抗原缺失的肿瘤细胞的杀伤力^[19]，还可诱导巨噬细胞分泌一氧化氮，后者可致肿瘤细胞的程序性死亡；Chmielewski等^[19]将T细胞进行改造，使其既表达促进T细胞重定位的嵌合抗原受体，又可局部释放IL-12。这些被改造的T细胞可以通过募集和激活巨噬细胞等固有免疫细胞发挥抗肿瘤效应；⑤抑制肿瘤血管生成。IL-12可诱生γ-干扰素、干扰素诱生蛋白(IP-10)和Meg蛋白等，下调多种促血管生成因子如白细胞介素6、层黏连蛋白5(laminin-5)、血管内皮生长因子C、D(VEGF-C、VEGF-D)的表达，从而抑制肿瘤血管的生成^[20-21]。

IL-12的生物活性依赖于两亚基的结合，在应用IL-12基因治疗疾病时，两亚基必需同时表达。以往关于IL-12的研究，多是将p35、p40双亚基基因分别克隆至载体内，按1∶1比例共感染细胞，实验操作繁琐且易导致细菌污染，还存在着双亚基基因能否同步转染入细胞并同时以及按比例表达的问题，此外，同一细胞中两者的表达是否存在拮抗作用也罕见文献报道。该实验中将PCR扩增、纯化后的p40和p35片段，通过Overlapping PCR拼接，获得IL-12的单链双亚基表达融合基因，避免了上述繁琐。

目前针对间充质干细胞对肿瘤细胞微环境的影响一直存在着争议。有多项体外实验证实，间充质干细胞可抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡^[22]。而体内实验则发现，间充质干细胞可通过免疫抑制作用降低机体内淋巴细胞活性，使肿瘤细胞逃避免疫监视^[23]。Tsai等^[24]发现，间充质干细胞可通过旁分泌作用直接促进肿瘤生长。Shinagawa等^[25]将不同比例的BMSCs与肿瘤细胞混合培养后接种于小鼠体内，与单独接种肿瘤细胞的小鼠进行对比后发现，高比例混合的BMSCs可显著促进结直肠癌的增殖、转移，而低比例混合的BMSCs则不能促进肿瘤转移。

此前有报道称，间充质干细胞可通过分泌dickkopf-1等抑制肿瘤生长^[9]，也有研究发现间充质干细胞可通过分泌抑制转化生长因子β、白细胞介素10、前列腺素E2等促进肿瘤生长^[26]，其可能机制为：①间充质干细胞可能直接以旁分泌方式分泌CXCL1、CXCL2和CXCL12/SDF-1等对肿瘤细胞产生作用，促进后者的增殖、侵袭及转移；②间充质干细胞可通过内皮祖细胞聚集来促进肿瘤血管的形成；③在肿瘤微环境内分化为其他干细胞，反过来影响肿瘤的发展；④间充质干细胞可发挥免疫调节作用，保护肿瘤细胞免受机体免疫调节系统的影响。王久香等^[27]研究发现，间充质干细胞可促进胃腺癌细胞SGC-7901的侵袭力。而该实验观察期内，PBS组与BMSCs组肿瘤体积差异无显著性差异(P > 0.05)。注射7 d后hIL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P < 0.01)。结果提示，BMSCs未见明显促进或抑制CT26瘤体生长，而通过瘤周注射hIL-12-BMSCs或LV-IL-12，可使肿瘤周围维持持久、高浓度的IL-12，从而抑制CT26肿瘤的生长。此外，实验还发现，注射10 d后hIL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P < 0.05)，且LV-IL-12组的肿瘤相对增长率高于hIL-12-BMSCs组，提示hIL-12-BMSCs抗瘤作用优于LV-IL-12，具体机制尚不清楚。

总之，近几年关于IL-12基因治疗在体外实验、动物实验甚至某些肿瘤的临床试验中都取得了令人振奋的效果，虽然大规模临床应用还面临着技术复杂、外源基因表达的稳定性及安全性尚不十分可靠等难题，但IL-12表现出的较其他细胞因子更强的抗肿瘤效用，已经被国内外多数学者所证实和认可，相信随着基因工程技术的进一步发展，IL-12抗肿瘤应用会取得更加令人满意的结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长

Lentivirus-mediated human interleukin-12 fusion gene-transfected rat bone marrow mesenchymal stem cells inhibit CT26 tumor growth

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