Apelin干预骨髓间充质干细胞移植治疗改善心肌梗死后心功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0952

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3937-3943.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0952

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Apelin干预骨髓间充质干细胞移植治疗改善心肌梗死后心功能

侯婧瑛，龙会宝，陈旭翔，汪蕾，郭天柱，郑韶欣，钟婷婷，伍权华，吴浩，王彤

中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120

修回日期:2018-03-22 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 侯婧瑛，博士，主治医师，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:侯婧瑛，女，1985年生，安徽省庐江县人，汉族，2017年中山大学孙逸仙纪念医院毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞与心血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81700242)“lncRNA-H19/miR-199a-5p/VEGF通路在apelin促进MSCs生存和血管再生改善心梗后心衰中的作用及机制研究”；广东省科技计划项目(2017A020215176)“Apelin激活PI3K/AKT经lncRNA-H19/miR-199a-5p/VEGF途径促进MSCs生存和血管再生改善心肌梗死后心力衰竭机制研究”；广东省医学科研基金(A2016264)“心肌干细胞经由HIF-1α/Apelin/APJ/ACE2通路下调ANGII改善心肌梗死大鼠心电生理学稳定性的机制研究”；广东省医学科研基金(A2017001)“Apelin经PI3K/AKT/miR-199a-5p/ VEGF通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生改善心肌梗死后心力衰竭机制研究”

Apelin combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation improves cardiac function after myocardial infarction

Hou Jing-ying, Long Hui-bao, Chen Xu-xiang, Wang Lei, Guo Tian-zhu, Zheng Shao-xin, Zhong Ting-ting, Wu Quan-hua, Wu Hao, Wang Tong

Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2018-03-22 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Hou Jing-ying, Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Hou Jing-ying, M.D., Attending physician, Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81700242; the Science and Technology Research Project of Guangdong Province, No. 2017A020215176; the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2016264, A2017001

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Apelin/APJ：血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ)是G蛋白耦联大家族中的一种跨膜蛋白。Apelin是APJ的内源性配体，与APJ构成apelin/APJ系统。Apelin/APJ被证实参与心血管功能的调节。研究发现，apelin在体内促进心肌梗死后新生血管的形成。不仅如此，apelin亦可促进骨髓间充质干细胞在体外缺氧条件下的生存和血管再生。
PI3K/AKT信号通路：广泛存在于真核动物细胞中，被认为是细胞内最重要的生存通路。PI3K/AKT调节众多重要的细胞过程如细胞发育、增殖、凋亡及分化等。研究表明PI3K/AKT对骨髓间充质干细胞生存和血管再生具有促进作用。PI3K/AKT是apelin发挥作用的一个重要下游信号。目前已发现apelin介导的一些生物学效应包括增强骨髓间充质干细胞生存、促进新生血管形成以及上调血管内皮生长因子表达均与PI3K/AKT激活密切相关。

摘要
背景：课题组前期研究发现血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白内源性配体(apelin)能够促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在体外缺血缺氧条件下的生存和血管再生。
目的：采用体内实验探讨apelin联合MSCs移植治疗对心肌梗死后心功能的影响及相关机制。
方法：开胸结扎50只C57BL/6小鼠左前降支冠状动脉并随机分为5组：MSCs组、MSCs+apelin组、sh-APJ MSCs+apelin组、apelin组和PBS组。模型建立2周后，对动物进行第2次开胸手术，MSCs组于局部梗死心肌内注射单纯的MSCs，MSCs+apelin组和sh-APJ MSCs+apelin组分别注射MSCs以及sh-APJ MSCs并且均连续腹腔内注射2周apelin-13，PBS组心肌内注射不含MSCs的PBS。各组治疗前及治疗2周后检测心功能。实验结束后，摘取心脏检测左心室心肌组织梗死边缘区的MSCs生存和血管再生情况以及相关因子的表达。
结果与结论：①与治疗前比较，治疗2周后MSCs组、MSCs+apelin组、sh-APJ MSCs+apelin组、apelin组左室射血分数明显增加(P < 0.01)，左室舒张末期内径、左室收缩末期内径显著减小(P < 0.01)；其中MSCs+apelin组以上指标改善最显著(P < 0.01)；②与MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比，MSCs+apelin组梗死边缘区PKH26阳性细胞和CD31阳性细胞的平均光密度值显著增高，且PKH26和CD31双阳性细胞占PKH26阳性细胞的比例显著增加(P < 0.01)；③与MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比较，MSCs+apelin组APJ、AKT、pAKT以及VEGFA表达显著增加，而MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组在上述各项指标表达方面差异均无显著性意义(P > 0.05)；④以上提示apelin能够通过与其受体APJ结合改善MSCs在心肌梗死局部组织中的生存和血管再生，从而进一步提高心肌梗死后心功能，此效应与VEGFA表达上调相关，PI3K/AKT的激活可能在其中起到一定的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0492-2216(侯婧瑛)

Abstract:

BACKGROUND: Our previous work demonstrated that apelin could promote bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) survival and vascularization under hypoxic-ischemic conditions in vitro.
OBJECTIVE: To explore the effect of apelin combined with BMSCs transplantation on cardiac function after myocardial infarction and the relevant mechanisms.
METHODS: Fifty C57BL/6 mice with myocardial infarction were induced by the left anterior descending coronary artery ligation. Animal models were then randomized into five groups: BMSCs, BMSCs+apelin, sh-APJ BMSCs+apelin, apelin and PBS groups. Two weeks after modeling, the mice in the former four groups were subjected to secondary thoracotomy, BMSCs group was given intramyocardial injection of sole BMSCs. BMSCs+apelin and sh-APJ BMSCs+apelin groups were given intramyocardial injection of BMSCs and sh-APJ BMSCs respectively, in combination with intraperitoneal injection of apelin-13 for 2 weeks consecutively. Mice in the PBS group received intramyocardial injection of PBS without BMSCs. Cardiac function of mice was evaluated before and 2 weeks after treatment. MSCs survival and vascularization in the infarct border zone were examined, and the expression of relevant factors was detected thereafter.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 2 weeks after treatment, the cardiac function of mice was obviously improved in the former four groups in contrast with the baseline, especially in the BMSCs+apelin group; Left ventricular ejection fraction was significantly increased (P < 0.01), and left ventricular end diastolic diameter and left ventricular end systolic diameter were significantly reduced (P < 0.01). (2) Compared with BMSCs and sh-APJ BMSCs+apelin groups, the average optical density of PKH26- and CD31-positive BMSCs in the infarct border zone was significantly enhanced in the BMSCs+apelin group. Moreover, the percentage of CD31 and PKH26 double positive cells to the PKH26-positive BMSCs was considerably increased (P < 0.01). (3) The expression levels of APJ, AKT, pAKT and VEGFA were significantly increased in the BMSCs+apelin group compared with the BMSCs and sh-APJ BMSCs+apelin groups (P < 0.01). However, there was no difference in the above biomarkers between the BMSCs and sh-APJ BMSCs+apelin groups. It was concluded that apelin could combine with APJ to promote BMSCs survival and vascularization in the infarcted myocardial tissues, thereby further improving cardiac function post myocardial infarction. This effect was associated with the up-regulation of VEGFA. Activation of PI3K/AKT signaling pathway was likely to exert some functions in the above procedure.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Myocardial Infarction, Vascular Endothelial Growth Factor A, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

侯婧瑛，龙会宝，陈旭翔，汪蕾，郭天柱，郑韶欣，钟婷婷，伍权华，吴浩，王彤. Apelin干预骨髓间充质干细胞移植治疗改善心肌梗死后心功能[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3937-3943.

Hou Jing-ying, Long Hui-bao, Chen Xu-xiang, Wang Lei, Guo Tian-zhu, Zheng Shao-xin, Zhong Ting-ting, Wu Quan-hua, Wu Hao, Wang Tong. Apelin combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation improves cardiac function after myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3937-3943.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 50只C57BL/6小鼠全部存活，均进入结果分析。

2.2 各组心功能比较 小鼠心肌梗死模型建立后进行心脏超声检测，结果显示各组小鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末期室间隔厚度、左室收缩末期室间隔厚度、左室射血分数之间差异均无显著性意义(P > 0.05，表1)；在经过相关治疗后2周再次检测心功能，结果显示：与治疗前相比较，MSCs组、MSCs+apelin组、sh-APJ MSCs+apelin组以及apelin组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径明显下降，左室射血分数明显增高(P < 0.01，表1和表2)，而PBS组治疗前后相比各指标差异无显著性意义(P > 0.05，表1和表2)。与PBS组相比较，其余各组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径明显下降，左室射血分数明显增高(P < 0.01，表2)；与MSCs组、sh-APJ MSCs+apelin组及apelin组相比较，MSCs+apelin组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径明显下降，左室射血分数明显增高(P < 0.01，表2)；与MSCs组相比较，apelin组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径增加，左室射血分数下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 MSCs生存和血管再生情况 与MSCs组、sh-APJ MSCs+apelin组相比较，MSCs+apelin组梗死边缘区PKH26(+)以及CD31(+)细胞的平均光密度值显著增高(P < 0.01，图1)，PKH26和CD31双阳性细胞占PKH26(+)细胞的比例显著增多(P < 0.01，图1)，差异有显著性意义(P < 0.01，图1)，而sh-APJ MSCs+apelin组与MSCs组相比较，在上述指标方面差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 治疗后2周梗死边缘区APJ、AKT、pAKT以及VEGFA表达 与PBS组相比较，其他组APJ、AKT、pAKT以及VEGFA表达明显增高(P < 0.01，图2)；与MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比，MSCs+apelin组APJ、AKT、pAKT以及VEGFA的蛋白表达水平明显增加(P < 0.01，图2)，而MSCs组、sh-APJ MSCs+apelin组以及apelin组之间上述指标表达差异无显著性意义(P > 0.05，图2)。

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引言

材料方法

1.1 设计 动物体内实验。

1.2 时间及地点 于2017年8月至2018年1月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 C57BL/6小鼠，由中山大学实验动物中心提供，其中3周龄、体质量10 g左右小鼠20只用于MSCs分离、培养；3月龄，体质量20-25 g雄性小鼠共50只用于心肌梗死模型的制备。

1.3.2 实验试剂及仪器 胎牛血清、DMEM-低糖培养基、双抗(Hyclone公司)；胰蛋白酶、PBS(Hyclone公司，美国)；VEGFA兔多克隆抗体(Abcam，英国)；APJ兔多克隆抗体(Lifespan Biosciences，美国)；AKT兔多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；pAKT兔多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；CD31兔多克隆抗体(Abcam，英国)；一抗及二抗稀释液(Millipore，美国)；辣根过氧化物酶连接的二抗(Southern Biotech，美国)；apelin-13、苯巴比妥钠、PKH26、BCA法蛋白含量检测试剂盒(Abcam，英国)；发光液(中杉金桥，中国)； TRIZOL RNA 提取试剂盒(Santa Cruz，美国)；转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)；293T 细胞(中国科学院细胞库)；Optimen(Gibco，美国)；小动物呼吸机(泰盟HX-300S，中国)；摊片机、切片机及石蜡包埋机(金华市益迪医疗设备厂，中国)；心脏超声分析仪(Philips，荷兰)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)。

1.4 实验方法
1.4.1 C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养课题组已形成成熟的培养方法，具体培养及鉴定方法参照课题组前期发表文献[1，9，15]，选取第3代细胞用于后续实验，采用PKH26进行标记，具体参照课题组前期发表文献[16-17]。

1.4.2 pLVX-shAPJ慢病毒载体构建和稳定株筛选 课题组前期已完成了对APJ siRNA有效干扰序列的筛选，筛选出的APJ siRNA有效干扰序列为：5'-GAA AUC GAU UCC CUA UAG UdT dT-3'，AS：5'-ACU AUA GGG AAU CGA UUU CdT dT-3'。选用pLVX-shRNA1作为载体，将APJ siRNA构建入pLVX-shRNA1，形成pLVX-shAPJ。APJ siRNA扩增引物序列由苏州金唯智公司合成，引物序列：APJ siRNA-F：5'-gat ccG AAA TCG ATT CCC TAT AGT ctc gag ACT ATA GGG AAT CGA TTT CTT TTT g-3' (BamHⅠ限制性酶切位点)，APJ siRNA-R：5'-aat tca aaa aGA AAT CGA TTC CCT ATA GTc tcg agA CTA TAG GGA ATC GAT TTC g-3' (EcoRⅠ限制性酶切位点)。APJ siRNA-F与APJ siRNA-R分别等体积混合后，沸水浴中煮沸5 min，然后72 ℃ 15 min，自然冷却至室温，约30 min。在无菌的0.2 mL EP反应管中，取pLVX-shRNA1载体15 µL，用BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切，再进行酶切产物回收，将酶切回收的产物与pLVX-shRNA1载体进行连接，16 ℃连接1 h。将5 µL连接产物分别加入至50 µL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30 min，42 ℃水浴热休克90 s，快速将管转移至冰浴中，冰浴2 min，分别加入200 µL LB培养基，混匀，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h。于超净工作台中，取上述转化混合液，均匀涂布于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37 ℃生化培养箱过夜培养。从平板上挑取若干单克隆于3 mL LB管中摇床过夜培养，进行质粒提取并直接送质粒测序。测序结果进行Blast比对确认APJ siRNA已成功克隆到pLVX-shRNA1载体中，形成重组质粒pLVX-shAPJ。重组质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen 公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染HEK293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定慢病毒滴度为1.0×10⁸ TU/mL。按实验需要将MSCs铺板计数，以第2天密度约50%左右为宜，37 ℃培养过夜。次日感染前从冰箱取出并在37 ℃水浴中快速融化病毒(轻轻晃动约几秒，以溶化液体中有少量冰块为宜，立即取出)，并立即用事先加热到37 ℃的新鲜完全培养基稀释成所需浓度。轻轻混匀，吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中，轻摇匀，37 ℃培养过夜。感染后第2天吸去含病毒的培养液，更换新鲜的完全培养液，继续37 ℃培养，感染后第3天，挑选阳性克隆，筛选稳定株，进行细胞扩增，筛选成功后用于体内实验。

1.4.3 小鼠心肌梗死模型的制备 3月龄C57BL/6小鼠麻醉后，气管插管并接呼吸机，从左侧第四肋间打开胸腔，暴露心脏，用镊子撕开心包膜，清楚暴露左前降支冠状动脉，用带8-0细尼龙丝线的小圆针缝扎左前降支冠状动脉。关胸前放置细塑料软管，便于关胸后引流和吸取气体和渗出的血液。缝扎成功的标志是肢体心电图ST段明显抬高，QRS波宽大畸形，左室射血分数显著降低，提示模型构建成功，详见课题组发表文献^[16-17]。

1.4.4 MSCs移植及药物治疗 50只小鼠随机分为5组：MSCs组、MSCs+apelin组、sh-APJ MSCs+apelin组、apelin组和PBS组，每组10只。小鼠心肌梗死模型制备成功后超声心动图检测心功能，2周后重新麻醉，行气管插管并监测PETCO₂，对动物进行第2次开胸手术，其中MSCs组在局部梗死心肌内注射5×10⁶ PKH26标记的由PBS悬浮的MSCs，MSCs+apelin组在注射MSCs同时予以apelin-13 [1 mg/(kg•d)]连续腹腔内注射2周，sh-APJ MSCs+apelin组在注射sh-APJ MSCs同时予以apelin-13[1 mg/(kg•d)]连续腹腔内注射2周，apelin组予以apelin-13[1 mg/(kg•d)]连续腹腔内注射2周，PBS组心肌内注射不含MSCs的PBS。各组治疗前及治疗2周后检测心功能。实验结束后，摘取心脏检测左心室心肌组织梗死边缘区的MSCs生存和血管再生情况以及相关因子的表达。
1.4.5 超声心动图检测 所有小鼠心肌梗死模型成功制备后及治疗后2周进行超声心动图检测，采集相关心功能参数，包括左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室射血分数(LVEF)，处死小鼠采集心脏标本，待下一步相关指标检测^[16]。
1.4.6 免疫荧光染色 处死小鼠后取出梗死边缘区心脏标本，具体染色方法参照课题组前期发表文献[16-17]，其中一抗CD31稀释浓度1∶500，二抗稀释浓度1∶1 000，实验结束后荧光显微镜下观察，随机选取5个不同的视野并用软件测定平均光密度值和阳性染色细胞比例以评估MSCs的生存和血管再生情况。
1.4.7 Western blot检测APJ、AKT、pAKT和VEGFA的蛋白表达，具体方法参照课题组前期发表文献^[16-17]。
1.5 主要观察指标 ①超声心动图评估心功能；②心肌梗死边缘区PKH26阳性MSCs和CD31阳性细胞的平均光密度值以及PKH26和CD31双阳性细胞比例，评估治疗后梗死边缘区MSCs生存和血管再生情况；③APJ、AKT、pAKT和VEGFA的表达水平。
1.6 统计学分析 统计学处理由独立的与实验无关的统计人员实施。数值用x±s表示，采用SPSS 16.0 for windows软件处理，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用用Bonferroni 法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

MSCs因其独特的优越性而被认为是治疗心肌梗死理想的细胞来源^[18]。目前不论是基础研究还是临床试验均证实了MSCs移植对于改善心肌缺血或心肌梗死后受损心功能是可行和有效的治疗方案^[2^，^18]。尽管如此，现阶段MSCs移植治疗的效果仍难以令人满意，无论是单纯的MSCs还是转染后的MSCs，在缺血缺氧的梗死心肌组织中的存活率均较低，形成的新生血管密度低下^[4]。因此，如何加强MSCs对缺血缺氧的耐受性，促进MSCs在心肌梗死后缺血和营养剥夺病理微环境中的生存，从而提高MSCs的治疗效果，是目前研究的重点。

APJ是G蛋白耦联大家族中的一种跨膜蛋白，其结构与血管紧张素受体AT1相似。Apelin是APJ的内源性配体，与血管紧张素Ⅱ具有同源性，与APJ构成apelin/APJ系统^[5^，^9]。证据表明apelin在促进MSCs生存和血管再生中具有重要作用^[1^，^5-8]。Apelin通过抑制线粒体去极化、细胞色素C释放及caspase级联反应来减少细胞凋亡进而在无血清条件下促进MSCs的生存^[7]；其亦通过调控自噬来调节MSCs生存。缺氧情况下apelin产生保护性自噬效应提高MSCs生存，而同时其又减少复氧过程中由自噬诱导的细胞死亡^[6]。缺氧能够呈时间依赖性增强MSCs的生存力与缺氧诱导因子引发的apelin/APJ系统激活紧密相关^[19]。除调节MSCs生存外，apelin亦被证实与干细胞血管再生密切相关^[8]。Apelin可通过上调 SDF-1α/CXCR-4促进血管前体祖细胞在梗死区域的归巢进而增加心肌血管形成，减小纤维化和心肌肥厚^[20]。另有研究发现，在早期心肌修复过程中，apelin能够作为循环血中cKit⁺/Flk1⁺/Aplnr⁺前体细胞的一个强有力的趋化因子，通过介导旁分泌效应诱导血管新生进而在心脏缺血性损伤中发挥保护作用^[21]。作者前期研究亦发现apelin能够促进MSCs在体外缺血缺氧条件下的生存和血管再生^[1^，^9]。该实验通过建立心肌梗死后心力衰竭的小鼠模型，在体内探讨apelin能否通过促进MSCs在心肌梗死局部微环境中的生存和血管再生从而改进细胞移植治疗的疗效。结果显示，与apelin组和PBS组相比较，MSCs组左室射血分数增加，左室舒张末期内径、左室收缩末期内径减小，与MSCs组、sh-APJ MSCs+apelin组、apelin组及PBS组相比较，MSCs+apelin组左室射血分数明显增加，左室舒张末期内径、左室收缩末期内径显著减小，而MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组在上述指标表达上无明显差异性。对MSCs生存和血管再生的检测结果显示：与MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比，MSCs+apelin组梗死边缘区PKH26阳性和CD31阳性细胞平均光密度值均显著增高，且PKH26和CD31双阳性细胞占PKH26阳性细胞的比例显著增加，而MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比较则无差异性。综合以上说明：MSCs移植治疗能够显著改善心肌梗死后心功能，而MSCs联合apelin治疗较单纯的MSCs治疗对于心功能则具有更为明显的进一步改善作用，并且MSCs在梗死局部微环境中的生存率和血管再生能力明显提高，而在对MSCs进行APJ敲除的情况下再采用apelin联合治疗，与MSCs+apelin组相比较，对心功能更为明显的改善作用消失，MSCs的生存率和血管再生能力亦未见明显提高。由此apelin与其受体APJ结合后能够促进MSCs在心肌梗死后局部微环境中的生存和血管再生进而显著改善心肌梗死后心力衰竭的疗效。

研究表明MSCs可以通过自分泌或旁分泌生长因子促进血管新生。VEGF是MSCs产生的重要生长因子之一，其能够特异性作用于血管内皮细胞^[22]。VEGF增加微血管的通透性，它通过作用于VEGF受体促进血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，进而促进毛细血管新生，最终改善血液供应^[23]。VEGF已被证实具有舒张冠状动脉和减轻心肌缺血再灌注损伤等作用^[24]。研究表明MSCs移植治疗后损伤组织中新生毛细血管增多可能与其合成和分泌VEGF密切相关^[25-26]。VEGF促进MSCs增殖和分化，从而在MSCs生存和血管再生中扮演了十分重要的角色。采用VEGF的免疫脂质体联合MSCs治疗或VEGF包被的MSCs移植治疗均能够更加有效增加移植细胞的数量和新生血管的形成，从而改善心功能和减少纤维化^[27-28]。另有研究显示VEGF诱导MSCs分化为内皮细胞，抑制VEGF的表达导致MSCs的血管形成能力显著降低^[29]。作者前期研究也发现促进VEGF表达能够显著提高MSCs的生存力和血管形成能力^[30]，并且发现apelin在体外缺血缺氧环境下促进MSCs生存和血管再生与其上调VEGF的表达相关^[1^，^9]。实验结果显示，与MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组相比较，MSCs+apelin组VEGFA的表达显著增加，而MSCs组和sh-APJ MSCs+apelin组之间VEGFA表达无明显差异性，可见apelin能够促进MSCs在梗死局部微环境中表达VEGFA，而通过受体途径阻断APJ后apelin诱导的这种效应消失，以上表明apelin与其受体APJ结合后促进MSCs在体内心肌梗死后局部微环境中的生存和血管再生与VEGFA表达上调相关。

PI3K/AKT信号通路广泛存在于真核动物细胞中，被认为是细胞内最重要的生存通路。PI3K/AKT调节众多重要的细胞过程如细胞发育、增殖、凋亡及分化等^[31]。多项研究表明，PI3K/AKT能够促进MSCs增殖并抑制其发生凋亡^[10-11]。缺氧条件下PI3K/AKT的激活提高MSCs的生存力并增强其血管形成能力^[32]。缺氧预处理人脐血间充质干细胞能够通过激活AKT增强其在体内局部缺血微环境中的生存和血管再生进而提高其移植疗效^[33]。过表达AKT的MSCs产生的外泌体中旁分泌因子的水平显著增高，并且在促进血管形成和改善心功能方面更为有效^[34]。上述充分说明了PI3K/AKT在促进MSCs生存和血管再生中的重要作用。PI3K/AKT已被证实为apelin的一个重要下游信号分子。既往有研究发现apelin促进MSCs生存与其激活PI3K/AKT密切相关^[11]，另有研究表明apelin通过激活PI3K/AKT促进血管新生^[12-13]。证据显示PI3K/AKT激活后能够上调VEGF^[11^，14]。PI3K/AKT通过促进MSCs表达VEGF进而进一步诱导新生血管形成^[11，14]，并且最近有研究报道apelin能够通过激活PI3K/AKT上调VEGF进而介导血管新生^[35]。实验发现apelin干预MSCs治疗后，MSCs在梗死局部微环境中的生存和血管再生明显增强，VEGFA的表达显著增高，同时APJ、AKT、pAKT的表达均明显增高，而在APJ敲除的情况下再进行联合移植治疗APJ、AKT、pAKT的表达出现显著下降，说明apelin与其受体APJ结合后激活了PI3K/AKT，而这有可能在apelin上调VEGFA促进MSCs生存和血管再生中发挥了一定的调控作用。

综合以上，研究发现采用apelin干预MSCs移植治疗apelin能够通过促进MSCs在心肌梗死局部微环境中的生存和血管再生进而进一步改善心功能，同时提出此效应与VEGFA表达上调相关。Apelin通过与受体APJ结合后可能通过激活PI3K/AKT进而发挥了上述调控作用。该研究结果为改进MSCs移植治疗的疗效提供了新的思路和选择方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Apelin干预骨髓间充质干细胞移植治疗改善心肌梗死后心功能

Apelin combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation improves cardiac function after myocardial infarction

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