Wnt/β-catenin信号通路在卵巢癌干细胞增殖、迁移和侵袭中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0930

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Wnt信号通路：在物种进化过程中高度保守，包括Wnt基因家族与Wnt受体等，目前已发现的主要Wnt信号通路包括经典的Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/PCP信号通路及Wnt/Ca²⁺信号通路3条，研究较多且作用最关键的为经典Wnt/β-catenin信号通路。在正常干细胞中，Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的增殖、自我更新、迁移与凋亡。在肿瘤干细胞中，Wnt/β-catenin信号通路同样也发挥着重要作用。
上皮间质转化：在肿瘤原发灶中，多数肿瘤实质细胞表现为明显的上皮表型，但是若要侵袭转移到其他器官，就必须向间质表型转化，而参与这项转化的生物学行为就是上皮间质转化。发生上皮间质转化的细胞会发生形态变化(由单层细胞转变为有突起的梭形细胞)、分子表达变化(上皮表型分子表达下调，间质表型分子表达上调)、生物学改变等。

摘要
背景：在肿瘤细胞中，β-catenin降解障碍导致胞浆内游离的β-catenin聚集并与TCF/LEF结合进入细胞核内，启动下游基因转录，诱发Wnt/β-catenin信号通路异常改变。因此，研究β-catenin与卵巢癌干细胞的关系，可为特异性抑制卵巢癌干细胞提供新的思路。
目的：观察β-catenin基因沉默后卵巢癌干细胞增殖、迁移与侵袭能力的变化。
方法：采用免疫磁珠法从人卵巢癌细胞A2780中分离CD133阳性卵巢癌干细胞。选取70%-80%融合的CD133阳性细胞，分别转染慢病毒pLKO.1-shRNA-β-catenin(实验组)与pLKO.1-shRNA-ctrl(对照组)质粒，转染后72 h，采用Western blot检测两组细胞β-catenin、上皮表型分子E-cadherin和间质表型分子Vimentin的表达，MTT法检测两组细胞增殖活性，Transwell小室实验检测两组细胞迁移与侵袭能力。
结果与结论：①转染后72 h，实验组细胞β-catenin蛋白明显低于对照组(P < 0.05)；②实验组培养2，3 d的细胞增殖能力低于对照组(P < 0.05)；③转染后72 h，实验组细胞迁移能力、侵袭能力明显低于对照组(P < 0.05)；④转染后72 h，实验组上皮表型分子E-cadherin蛋白表达高于对照组(P < 0.05)，间质表型分子Vimentin蛋白表达低于对照组(P < 0.05)；⑤结果表明，Wnt/β-catenin信号通路参与了卵巢癌干细胞的迁移与侵袭，沉默β-catenin基因表达可抑制卵巢癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4453-2220(姚彬)

关键词: 卵巢癌干细胞, Wnt/β-catenin信号通路, 细胞增殖, 细胞迁移, 细胞侵袭, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Inability of degradation makes free cytosolic β-catenin in tumor cells aggregate and bind to TCF/LEF into the nuclei, which initiates transcription of downstream genes, and eventually induces abnormal changes in Wnt/β-catenin signaling pathways. Therefore, investigations on the relationship between β-catenin and ovarian cancer stem cells can provide a new insight into the specific inhibition of ovarian cancer stem cells.
OBJECTIVE: To observe the proliferation, migration and invasion abilities of ovarian cancer stem cells after β-catenin gene silencing.
METHODS: CD133 positive tumor stem cells were isolated from human ovarian cancer cell line A2780 by immunomagnetic beads. CD133 positive cells with 70%-80% confluence were selected and transfected with pLKO.1-shRNA-β-catenin (experimental group) and pLKO.1-shRNA-ctrln (control group), respectively. The expression of β-catenin, E-cadherin and Vimentin were detected by western blot at 72 hours after transfection. Cell proliferation was detected by MTT, and cell migration and invasion ability was detected by Transwell chamber assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of β-catenin protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group at 72 hours after transfection (P < 0.05). (2) With the extension of culture time, the proliferation ability of the two groups increased gradually, but the cell proliferation ability of the experimental group was lower than that of the control group at 2 and 3 days after transfection (P < 0.05). (3) After 72 hours of transfection, the cell migration and invasion abilities of the experimental group were significantly lower than those of the control group (P < 0.05). (4) At 72 hours after transfection, the expression of E-cadherin protein in the experimental group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), and the expression of Vimentin protein was lower than that of the control group (P < 0.05). To conclude, the Wnt/β-catenin signaling pathway is involved in the migration and invasion of ovarian cancer stem cells. β-catenin silencing can inhibit the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Ovarian Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, beta Catenin, Gene Silencing, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

卵巢癌是第二大常见的女性恶性肿瘤，占女性癌症的3%^[1-2]，具有典型的肿瘤异质性，90%来源上皮组织，死亡率较高，目前以手术治疗为主，化疗为辅，但是此病具有高复发率与高转移率，远期预后不理想^[3-5]。因此深入理解卵巢癌转移的分子机制，寻找有效的治疗靶点，对于提高其治疗效果、改善其预后具有重要的意义。

肿瘤的复发、转移与肿瘤干细胞密切相关^[6-10]。肿瘤干细胞具有普通干细胞及胚胎干细胞的特性，可无限增殖、自我更新，具有较强的分化能力，并有放化疗抵抗性^[11-13]。也正是由于肿瘤干细胞的存在，使得实体瘤无法被彻底根除，以致于不久后会复发。肿瘤干细胞是正常干细胞或祖细胞信号传导通路成分突变或表达失调，导致调控机制异常，诱发细胞发生异常分化而形成的。肿瘤干细胞也受细胞信号通路调控，例如Wnt、Notch、BMP、SHH信号通路等^[14-16]。

Wnt信号通路在物种进化过程中高度保守，包括Wnt基因家族与Wnt受体等，目前已发现的主要Wnt信号通路包括经典的Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/PCP信号通路及Wnt/Ca²⁺信号通路3条，研究较多且作用最关键的为经典Wnt/β-catenin信号通路^[17-19]。在正常干细胞中，Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的增殖、自我更新、迁移与凋亡。在肿瘤干细胞中，Wnt/β-catenin信号通路同样也发挥着重要作用，王海全^[20]研究结果证实，转化生长因子β1通过Wnt/β-catenin信号通路诱导肝癌细胞SMMC-7721发生上皮间质转化样改变，促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为；熊姗姗^[21]研究结果证实，Wnt/β-catenin信号通路的异常与鼻咽癌肿瘤干细胞的生物学意义密切相关，干扰此通路可以改变鼻咽癌肿瘤干细胞的特性。在肿瘤细胞中，β-catenin降解障碍导致胞浆内游离的β-catenin聚集并与TCF/LEF结合进入细胞核内，启动下游基因转录，诱发Wnt/β-catenin信号通路异常改变。因此，研究β-catenin与卵巢癌干细胞的关系，可为特异性抑制卵巢癌干细胞提供新的思路。

为探讨Wnt/β-catenin信号通路与卵巢癌干细胞之间的关系，实验通过shRNA沉默β-catenin基因表达，观察β-catenin基因沉默后卵巢癌干细胞迁移与侵袭能力的变化。

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材料方法

1.1 设计 对比观察，细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年5月在华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院完成。

1.3 材料 人卵巢癌细胞A2780(上海信裕生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培养液、DMEM/F12培养基(北京生东科技有限公司)；pLKO.1puro载体质粒、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛血清白蛋白和人胰岛素(Sigma公司)；鼠抗人Nanog、Sox-2、Oct-4单抗(Abcam公司)；GAPDH鼠抗人单克隆抗体(武汉博士德)；CD133磁珠分选试剂盒(中科雷鸣(北京)科技有限公司)；Matrigel基质胶(BD Biosciences公司)；总蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (艾美捷科技有限公司)；293T细胞(上海然泰生物科技有限公司)；DNA-Lipofectamine 2000复合物(上海玉博生物科技有限公司)；兔抗β-catenin单克隆抗体、兔抗E-cadherin单克隆抗体、兔抗Vimentin单克隆抗体(Cell Signaling Technology)。

1.4 实验方法

1.4.1 卵巢癌细胞的培养 取冻存的人卵巢癌细胞A2780，迅速放入37 ℃水浴中，摇动30-60 s，使其快速融化；用体积分数70%乙醇擦拭消毒冻存管，在离心管中注入细胞悬液，再添加含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液10 mL，低速880 r/min离心5 min，去上清后用培养液再洗1次。用培养液适当稀释后，装入培养瓶37 ℃培养，次日更换1次培养液，培养两三天后，采用胰蛋白酶消化，以1∶2-1∶3传代，每两三天换液1次。

1.4.2 分离培养卵巢癌干细胞亚群 取对数生长期的人卵巢癌细胞A2780，以磁珠试剂盒缓冲液重悬，计数，与CD133磁珠冰上孵育30 min，加入缓冲液洗涤离心2次，将细胞沉淀用500 μL缓冲液重悬，经过磁珠分选仪获得CD133阳性细胞和CD133阴性细胞。将CD133阳性细胞置于干细胞培养基中培养，干细胞培养基成分：含20 μg/L表皮生长因子、5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 g/L牛血清白蛋白和5 mg/L人胰岛素的DMEM/F12培养基；将CD133阴性细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。

1.4.3 细胞增殖能力检测 取对数生长期的CD133阳性细胞和CD133阴性细胞，分别接种于96孔板中，每孔约1×10³个细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液200 μL，每48 h添加25 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，同时计数细胞1次，每次每组各取3孔，取平均值，绘制细胞生长曲线。

1.4.4 Western Blot检测干细胞表面标志物表达 取对数生长期的CD133阳性细胞和CD133阴性细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，制成单细胞悬液，以1×10⁶ L^-¹的细胞浓度接种于培养皿，继续培养24 h后，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗鼠抗人单克隆抗体(鼠抗人Nanog、Sox-2、Oct-4单抗)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，显色曝光，以GAPDH作为内参。

1.4.5 细胞转染^[22] 构建pLKO.1-shRNA-β-catenin与pLKO.1-shRNA-ctrl质粒表达载体。取对数生长期的293T细胞，以6×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于细胞培养皿，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱过夜，更换含胎牛血清的DMEM培养液，加入DNA-Lipofectamine 2000复合物，再加入目的质粒、包装质粒与包膜质粒，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱过夜，更换含胎牛血清的DMEM培养液继续培养。72 h后收集培养基(病毒上清)，离心，-80 ℃保存。选取70%-80%融合的CD133阳性细胞，胰酶消化，加入病毒上清进行转染72 h，获得慢病毒pLKO.1-shRNA- β-catenin(实验组)与pLKO.1-shRNA-ctrl (对照组)转染的CD133阳性细胞，采用Western Blot检测细胞转染后的β-catenin表达。

1.4.6 转染后MTT法检测细胞生长情况 取转染后72 h的CD133阳性细胞，计数，接种于96孔板，每孔1 000个细胞，每孔加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液100 μL，每组5个平行孔，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养，培养后1，2，3 d，采用MTT法检测细胞吸光度A值，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.4.7 转染后采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力

细胞迁移能力：取转染72 h后的CD133阳性细胞，以0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，采用无血清DMEM培养基调整细胞浓度，以5×10⁸ L^-1的细胞浓度铺于Transwell小室上层腔室。然后，将含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基加入Transwell小室下层腔室。培养24 h后，取Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗涤3遍，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min(37 ℃)，计数迁移细胞数。每个实验独立重复3次，与对照组转染的CD133阳性细胞比较，计算迁移细胞数相对值。

细胞侵袭能力：分组及实验步骤同细胞迁移能力操作，仅是在上层腔室聚碳酸酯膜上涂上一层Matrigel基质胶，模仿细胞外基质。计数侵袭细胞数。每个实验独立重复3次，与对照组转染的CD133阳性细胞比较，计算侵袭细胞数相对值。

1.4.8 Western Blot检测β-catenin、E-cadherin、Vimentin的表达 取转染72 h后的CD133阳性细胞，提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳；将5 μL蛋白样品与20 μL 5×蛋白上样缓冲液混合均匀，转膜2.5 h，取下PVDF膜，以含10%BSA的TBST溶液封闭1 h，加入一抗(兔抗β-catenin单克隆抗体、兔抗E-cadherin单克隆抗体、兔抗Vimentin单克隆抗体)，室温摇动孵育1 h，TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次。蛋白条带用ELC底物发光液显色，设置上样内参蛋白为GAPDH。采用Biomad western分析仪自动分析蛋白表达含量。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 转染慢病毒pLKO.1-shRNA- β-catenin质粒后，CD133阳性卵巢癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0统计学软件。数据资料用x(_)±s表示，样本均数比较采用组间t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

Wnt/β-catenin信号通路在多种原发性上皮性肿瘤发生与发展中扮演着重要角色，激活该通路可增强肿瘤细胞的迁移与侵袭能力^[23-24]。而在肿瘤复发与转移中，肿瘤干细胞发挥了重要作用。为了探讨Wnt/β-catenin信号通路在上皮性卵巢癌发生与发展的作用，实验采用shRNA沉默卵巢癌干细胞β-catenin基因，观察卵巢癌干细胞增殖、迁移及侵袭能力的改变。

虽然肿瘤细胞株经体外连续传代后仍有成瘤特性，但是细胞生物学行为相较原代细胞已发生了变化，因此进行肿瘤干细胞研究更有价值。有学者从卵巢癌细胞株研究中证实，CD133阳性细胞具有干细胞特性^[25]。分离干细胞的方法有很多，例如无血清培养基序贯培养、药物富集与基于抗原抗体的免疫分选技术。相比于无血清培养基序贯培养与药物富集培养方法，免疫磁性细胞分选技术简单高效，标本污染概率低，对细胞无损伤，分选后的细胞更适于体内外实验^[26-27]。实验采用免疫磁珠法从上皮性人卵巢癌细胞A2780中分离出CD133阳性细胞，通过细胞增殖及干性基因表达也证实了CD133阳性细胞具有干细胞特性。

为了沉默β-catenin基因，实验构建了pLKO.1-shRNA- β-catenin慢病毒载体，将其转染CD133阳性细胞，为了验证β-catenin基因是否沉默成功，实验通过Western Blot检测转染后细胞的β-catenin蛋白，结果显示，实验组细胞β-catenin蛋白表达明显低于对照组(P < 0.05)，说明沉默β-catenin基因成功。实验进一步观察了转染后卵巢癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力。MTT检测显示随着培养时间的延长，两组细胞增殖能力逐渐提高，实验组培养2，3 d的细胞增殖能力低于对照组(P < 0.05)，提示沉默β-catenin基因，可抑制卵巢癌干细胞的增殖。Transwell小室实验显示与对照组比较，实验组细胞迁移能力明显降低，侵袭能力明显降低，提示沉默β-catenin基因可抑制卵巢癌干细胞的迁移与侵袭能力。

在肿瘤细胞中存在着多种表型，从完全分化的上皮表型到去分化的间质表型，不同表型具有不同的生物学特征。在肿瘤原发灶中，多数肿瘤实质细胞表现为明显的上皮表型，但是若要侵袭转移到其他器官，就必须向间质表型转化，而参与这项转化的生物学行为就是上皮间质转化^[28-29]。发生上皮转化的细胞会发生形态变化(由单层细胞转变为有突起的梭形细胞)、分子表达变化(上皮表型分子表达下调，间质表型分子表达上调)、生物学改变等。实验检测了上皮表型分子E-cadherin和间质表型分子Vimentin的表达。结果显示，沉默β-catenin基因后，实验组上皮表型分子E-cadherin蛋白表达升高，间质表型分子Vimentin蛋白表达降低，提示卵巢癌干细胞迁移与侵袭能力受到抑制。

Wnt/β-catenin信号通路是个复杂的网络，肿瘤的发生、转移与其各级信号元件结构、功能改变密切相关，该实验只是针对β-catenin通路分子与卵巢癌干细胞的关系进行了一些检测，使用pLKO.1-shRNA-β-catenin慢病毒载体稳定转染卵巢癌干细胞，沉默β-catenin基因，检测卵巢癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力，证实Wnt/β-catenin信号通路确实参与了卵巢癌的发生与发展，沉默β-catenin基因可抑制卵巢癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力，但具体的机制还需要后续更深入的研究，同时下一步将进行体内移植实验，观察成瘤能力，以更深入地了解卵巢癌发生与发展的机制。